血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活力测定.docx

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1、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活力测定实验时间：2021.4. 14实验目的：1.了解ALT活力变化的意义2.掌握ALT活力测定的方法实验原理：1.以丙氨酸和a-酮戊二酸为底物，在ALT的作用下，生成 丙酮酸和谷氨酸，丙酮酸能与2,4-二硝基苯肺结合，生成丙酮酸二硝 基苯腺。后者在碱性溶液中呈现棕色，可借此比色测定。a-酮戊二 酸也能与2,4-二硝基苯肺结合生成相应的苯踪二干扰比色结果。 但是，后者在碱性溶液中的吸收光谱与丙酮酸二硝基苯踪有所不同， 在520nm比色时，a-酮戊二酸二硝基苯踪的光吸收远较丙酮酸二硝基 苯踪为低。在反应后，a-酮戊二酸减少而丙酮酸增多，使干扰减少。 故520nm处

2、吸光度增加之程度与反应体系中丙酮酸含量的增加基本 呈线性关系。实验仪器：恒温水浴箱分光光度计试管试剂：2mmol/L丙酮酸标准液，底物溶液，0. Immol/L磷酸缓冲液 (pH7. 4) ,2,4-二硝基苯月井，0. 4mol/LNaOH实验步骤：标准曲线制作取大使管6支编号，按下表加试剂：ALT与其吸光度的标准曲线绘制(用量：ml)试剂对照123452mmol/L丙酮酸标准液00. 050. 100. 150. 200. 25底物溶液0. 500. 450.400. 350. 300. 250. lmol/L磷酸缓冲液0. 10. 10. 10. 10. 10. 1混匀，至于37摄氏度水浴

3、保温5分钟，然后加入2,4二硝基苯月井2,4-二硝基苯肿0. 50. 50. 50. 50. 50. 5混匀，至于37摄氏度水浴中20分钟，然后各管加入0.4mol/LNa0H0. 4mol/LNaOH5. 05. 05.05. 05. 05. 0相当于活力单位9897150200混匀，10分钟后对照管调零，用520nm波长比色，读取各管之吸光 度，然后以吸光度为纵坐标，各管相应的转氨酶单位为横坐标，绘制 标准曲线。2.酶活性测定 取2支试管，编号，按下表操作：试剂对照测定血清卜 0. Imol/L磷酸缓冲液0. 1-底物溶液0.50.5|混匀，置于37摄氏度水浴中保温30分钟，然后各管加入2,4-二硝 基苯解2,4-二硝基苯肿0.50.5混匀，再置于37摄氏度水浴中20分钟，然后各管分别加入 0.4mol/LNaOH0. 4mol/LNaOH0. 4mol/LNaOH5. 05. 0用520nm波长比色，以对照管调零，读取测定管吸光度。由标准曲线 查知ALT酶活力单位。实验注意事项：1.加入碱液后，要注意及时摇匀，以使酶变性失活, 并使反应产物颜色均一2.涉及试剂较多。应注意量取过程中的准确性。3,o测量吸光度时，ALT活力测定和标准曲线绘制应使用同一台分光 光度计。