ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键(12页).doc

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1、-ELLMAN试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）1。TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析2。 DTNB TNB2- 根据文献记载，TNB的吸光系数在13.6*103M-cm-14.25*103M-cm-之间3,4。吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7之间。A=bc，其中A为吸光度，是摩尔吸收光系数或消光系数，单位为升/（摩

2、尔厘米）L/(molcm）。以吸光度下限0.2来计算（吸光系数取14.15*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=0.2/（14.15*103LM-cm-*1cm）=1.4*10-5mol/L (1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml.我们的条件可以达到这个检测限度。ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：1. EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系5。2. 在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm的吸收也不同，要根据选择的缓冲液来确定5。

3、另外，TNB的分光光度法分析对SDS很敏感6。3. DTNB随着pH的升高，降解速度加快。在pH7.0，其降解速度为0.02%/h，在pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH 12时，15min之内会完全降解7,8。4. 摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降4. 试验方案主要材料：1.材料PEG-G-CSF 批号：080229 浓度4.32mg/mlG-CSF 批号：080126 浓度6.9mg/ml10k超滤膜 PALL2.试剂Sequencing Grade Modified Trypsin,Promega，lot#237826。20

4、ug/小瓶。加入20 ul 50mM NH4HCO3，pH7.8溶解，配成1 ug/ ul的酶液。1M DTT 刘春凤提供TFA（三氟乙酸）：TEDIA Lot# 705114乙腈：Fisher Scientific Lot# 055848Starter kit for MALDI-TOF MS：BRUKER DALTONICS，Lot NO 2007-208241-001(including -Cyano-4-hydroxycinnamic acid(HCCA),peptide calibration standard,protein calibration standard I,prote

5、in calibration standard )PEG肽段反相分离流动相 A液：0.1%TFA/H2O B液：0.1%TFA/90%乙腈/H2O3.仪器质谱仪：BRUKER DALTONICS MALTI-TOF-TOF autoflex(厂内编号KC2007-011)Beckman 22R台式离心机（厂内编号AM-039）Beckman DU-800 紫外分光光度计（厂内编号KC2007-005）恒温循环仪：JULABO F12-ED（厂内编号KC2008-003）反相柱：Symmetry C18 5um 300 4.6*150mm， Lot NO 0206360111，内部编号1655高

6、压液相仪器：， （UV/Visible Detector）试验过程： 一、缓冲液替换PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换，超滤替换缓冲液为50mM NH4HCO3，pH 7.8。使用50mM NH4HCO3作为空白对照，样品用50mM NH4HCO3稀释一倍后在DU-800 紫外分光光度计上测浓度。PEG-G-CSF的浓度约6.29mg/ml，G-CSF的浓度约10.81mg/ml。二、酶切处理 1）取37ul G-CSF,共400ug，加入125.5ul 50mM NH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。 取63.ul PEG-G-CSF,共400ug，加入152ul 50mM N

7、H4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。 2）按质量比1：40往PEG-G-CSF中加入Trypsin 10ul，往G-CSF中加入Trypsin 10ul，同时各加入1ul 1M DTT使终浓度为5mM。另做一空白对照，往300ul 50mM NH4HCO3中加入Trypsin 15ul。 37反应，开始时间为。三、肽段反相分离TimeFlow%A%B0110001110001516832451653550154467014951801208085110009511000G-CSF Trypsin+DTT 反相分离收样：TimeFlow%A%B011000111000151683245165

8、3550154467014951801208085110009511000PEG-G-CSF Trypsin+DTT 反相分离收集到 之间的信号峰，交由崔文喜冻干 四、ELLMAN试剂测定自由巯基 由于收集到的PEG肽段已经是自由巯基，所以可以跳过还原二硫键这一步。 根据我们所查找到得文献，采用的参数如下： 反应缓冲液：0.10M 磷酸钠+0.001M EDTA ，pH 7.27 温度：25 在这些参数下，摩尔吸收光系数为14.150.09*103LM-cm-9.1) 标准曲线用反应缓冲液配制10umDTT，20 umDTT，40 umDTT，80 umDTT，160 umDTT，320 um

9、DTT。用缓冲液配制10mM 的ELLMAN试剂。准备两个比色皿。加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收值，吸收值调节到0.加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ul ELLMAN试剂到样品管中，在412nm测定吸收值ADTNB。加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品管中，混匀，35min后测定吸收值，直到值不再增加，记为Afinal。A412nm=Afinal-（3.1/3.2）(ADTNB-Abuffer),制作标准曲线。2）样品巯基测定加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收值，吸收值调节到0.加入10

10、0ul反应缓冲液到对照管中，加入100ul ELLMAN试剂到样品管中，在412nm测定吸收值ADTNB。加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品管中，混匀，35min后测定吸收值，直到值不再增加，记为Afinal。A412nm=Afinal-（3.1/3.2）(ADTNB-Abuffer)，根据标准曲线测定巯基。参考文献：1)THEODOREW.T et al.Sensitive Quantitative Analysis of Disulfide Bonds in Polypeptides and Proteins. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY

11、 138, 18 1- I88 ( 1984).2) W. L. ANDERSON AND D. B. WETLAUFER .A New Method for Disulfide Analysis of Peptides. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 67.493-502 ( 1975).3) Ellman, G.L., Arch. Biochem. Biophys., 74, 443. (1958).4) Peter Eyer,et al. Molar absorption coe?cients for the reduced Ellman reagent: reasse

12、ssment. Analytical Biochemistry 312 (2003) 2242275) W. L. ANDERSON AND D. B. WETLAUFER .A New Method for Disulfide Analysis of Peptides. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 67.493-502 ( 1975).6)Sigma 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 产品说明书。7) Riddles, P.W. et al., Anal. Biochem., 94, 75 (1979)8) Danehy, J.P, Elia, V.J. and Lavelle, C.J., J. Org. Chem., 36, 1003 (1971).9) P.W. Riddles, R.L. Blakeley, B. Zerner, Ellmans reagent:5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)a reexamination, Anal. Bio-chem. 94 (1979) 7581.第 12 页-