2022年选择乳酸菌的合成抗氧化肽酵母发酵谷物粉过程 .pdf

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1、选择乳酸菌的合成抗氧化肽酵母发酵谷物粉过程摘要 一组被挑选出来的乳酸菌被用于各种谷类面粉的酵母发酵以此来合成抗氧化肽。从酵母中提取的可溶性盐的自由基清除能力要显著高于从化学酸化处理过的生面团。 这些谷类面粉中特别好的有全麦粉、斯佩尔特小麦、 黑麦和卡姆酵母。这些谷类面粉几乎都可以抑制亚油酸的氧化。WSE were subjected to reversephase fast protein liquid chromatography.（一种液相色谱处理方法） 。然后我们得到了 37个片段并做了体外分析化验。其中最有效地片段对促进消化酶的水解有抵制作用。有 8至57个氨基酸残基的 25肽进行了液

2、相色谱法、电喷射离子化以及串联质谱的处理。 几乎所有的序列都有着同样的组成特征含有抗氧化多肽。所有被纯化的部分表现出体内的抗氧化活性在小鼠的成纤维细胞中使小鼠遭受认为的氧化压力时。 这个研究论证了酵母乳酸菌通过对来自本地的谷类食物的蛋白质水解作用释放含抗氧化活性多肽的能力。我们对提升健康水平的功能性食物、膳食补充剂、包含源自食物蛋白的多肽类的制剂很感兴趣。 生物活性多肽是一种特别的蛋白质碎片，它对人的身体功能和状态有着积极作用也可能影响人类健康。通常，生物活性肽是一种来自本土蛋白质的神秘序列，主要来源于助消化药、微生物和植物蛋白水解酶的水解作用。且经过是植物发酵后他们的水平（相对分子质量？）

3、会增加。在体内外的各项研究表明这样一个大范围的生物学功能来自于具有生物活性的pepzatides 例如：阿祥片物质、 mineral binding（矿物质的捆绑物）、免疫调节、抗菌剂、抗氧化剂、抗血栓形成的药、 血胆固醇过少的药以及降压药。各种来自乳蛋白的生物活性肽的释放（例如：血管紧张素、转化酶）通过乳酸菌的蛋白质水解是最有效的。最近，对来源于食物蛋白质的抗氧化多肽类很有兴趣，生物活性多肽组织氧化压力与大量衰减退化的的老化疾病（例如：癌症和动脉硬化） 的证据也有很多也在积累。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名

4、师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 15 页 - - - - - - - - - 总的来说，抗氧化剂在食品工业中有许多应用。 食物变质是氧化过程的结果，它的延迟能明显的提高食品储存期限。在加工和储存过程中油脂的氧化是含液体食物的损坏的主要的原因。 抗氧化剂被广泛的测试有关他们的致癌力和其他毒性效应以及它们的氧化形式以及它们与食物成分反映的产物以及他们低浓度是的效力以及在他们所在的食物中是否因为他们而被加入了令人讨厌的气味。食物中抗氧化剂的使用是由国家管制法律和内部标准控制的。即使各种综合复合物有抗氧化特性，但它们中只有一小部分被 GRAS 接受，并在国际机构中被允许在食物中

5、使用，这些国际机构有联合国粮食与农业组织食品添加剂部门、欧洲共同市场的食物科学委员会。 毒学方面的研究在讨论抗氧化剂的安全性中是十分重要的，在决定每日摄取容许量时也很重要。许多广泛应用的抗氧化剂例如丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯以及没食子酸盐在这些年已经改变，这主要是因为他们在很多方面的毒物学效应，对这些合成的抗氧化剂新的毒物学数据警告了他们的使用。最近天然抗氧化剂吸引了许多为了生产保健产品的食物制造商的注意，生物学上拥有潜在的抗氧化活性的活性多肽已经从动植物的蛋白质中分离出来。他们已经从以下分离出来：花生内核、米糠、向日葵蛋白质、紫花苜蓿叶片蛋白、玉米蛋白粉、青蛙皮肤、山药、蛋黄蛋白质, 牛奶

6、酸乳酒 , 豆浆酸乳酒、药用蘑菇 ,鲭鱼, 咖喱叶 , 棉花棉树叶虫 , 酪蛋白 , 藻类蛋白质的浪费 , 麦麸, 荞麦蛋白质。我们认为抗氧化肽作为脂质过氧化作用的抑制剂, 作为自由基的清除剂, 和作为螯合过渡金属离子的代理来催化自由基的生成(43) 。抗氧化肽通常由 2 到 20 个氨基酸残留物构成和他们的分子质量小于6.0 kDa(26，48)。抗氧化活性似乎与氨基酸组成、构象和疏水性有很大关系。谷物是人类饮食中的主食。 他们被认为是世界各地的人们膳食的中碳水化合物, 蛋白质 , 维生素、矿物质和纤维的最重要来源。 大量的谷物在消费之前被加工成食品和饮料通过发酵 ( 例如在消费之前 , 酵

7、母)。 虽然生物活性剂如ACE抑制剂、抗菌剂、抗癌剂等被报道存在于谷物肽(7 、8、38、40、41), 我们所知只有少数研究(43) 调查出抗氧化肽的潜在释放在谷物发酵期间。本研究旨在调查在体外和来自体内的抗氧化剂在不同谷物面粉中的乳酸菌的酵母发酵的潜力。生物活性肽被纯化和鉴定从而确定与抗氧化特性的结构关系。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 15 页 - - - - - - - - - 材料与方法微 生 物 ： 消 化 乳 杆 菌 (Lactobacill

8、us alimentarius) 15M,短 乳 杆 菌(Lactobacillus brevis) 14G,旧金山乳杆菌 (L.sanfranciscensis)7A,基于水解麦醇溶蛋白的能力选择了希式乳杆菌(Lactobacillus hilgardii) 51B。根据亲肽系统活动的活性选取了 旧金山乳杆菌LS3, LS10, LS19, LS23, LS38 和 LS47。菌株用于混合酸面团的发酵，乳酸杆菌在30的最终pH 值为5.6（修正MRSMMRS ）的 MRS 肉汤中培养 24 小时（ Oxoid 公司，贝辛斯托克，汉普郡，英格兰），同时加入的新鲜酵母提取物（5体积/体积）和 2

9、8 mM 的麦芽糖。当酵母发酵时， 乳酸细菌细胞处于被培养状态，直到达到生长后期指数期（约 10 小时） ，用 50mM pH 7.0 的磷酸盐缓冲液洗涤两次， 再悬浮于自来水 （细菌总数， 100菌落形成单位 /毫升） ，将其用于制备面团。 将发酵的酸面团在30的 MMRS 琼脂培养基（Oxoid 公司）上培养 48 小时，通过电镀培养物稀释液来进行乳酸菌的计数。酸面团发酵。 利用 AACC 官方方法（ 1） ，在该研究中使用的面粉的特性列于表 1。每份发酵面团含 120 克面粉 280g 的自来水，面团收率 330 （ DY 330 ）（ DY 面团重量 100/flour 重量） 。用选

10、定的乳酸菌在37 ，符合搅拌条件 （约200 转）的培养池中发酵24小时（ 5 107 CFU / g 的面团初始细胞密度） 。控制面团在化学酸化至pH 为 3.5 的由乳酸和乙酸（摩尔比，4:1）的混合物中（DY 330 ）进行无细菌接种，并在相同条件下培养。WSE 。水/盐的水溶性提取物（WSE）采用最初由奥斯本（ 32）所述的并被 Weiss等进一步改进方法用每个生面团制备。每个面团（含有7.5 克面粉）的等分试样稀释用30ml 的 50mM 的 Tris-HCl （ pH 值 8.8） ，在 4下进行 15 分钟的间隔涡旋， 20000g 离心 20 分钟的条件下培养1 小时。上清液，

11、将含有水 /盐溶性氮馏分，被用于抗氧化活性的体外测定。肽在WSE 和纯化的级分的浓度用邻苯二甲醛（OPA）的方法（ 6）来确定。绘制胰蛋白胨标准曲线制备（0.25至 1.5 毫克/毫升）用作参考。利用实验蛋白胨绘制类似的标准曲线。DPPH 自由基清除活性。WSE 和纯化馏分对1,1 - 二苯基 -2 - 苦基苯肼（ DPPH ）的清除作用的自由基是根据有一些修改的Shimada等人的方法测定的。 （45） 。冷冻干燥的样品溶解在含1 毫克/毫升的肽浓度的0.1M 磷酸盐缓冲液名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精

12、心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 15 页 - - - - - - - - - （ pH 7.0）中，并且每次2 毫升溶液中加入 2 毫升 0.1 毫溶解在 95乙醇中的DPPH。摇匀混合物，并放置30 分钟，在室温下，将所得溶液的吸光度读取在517 纳米。 10 分钟后测得的吸光度用于计算通过WSE 或纯化的肽级分（39）所清除的 DPPH 自由基浓度。较低的吸光度代表一个更高的DPPH 自由基清除活性。清楚效果的表达式为以下方程：DPPH 自由基清除活性（）（空白的吸光度样品吸光度）/空白的吸光度 100 。丁基化羟基甲苯（ BHT ）和生育酚（ 1 毫克/毫升）也作为抗

13、氧化剂进行测定。抑制亚油酸自氧化。WSE 和纯化的级分的抗氧化活性也按照大泽和并木（31）的方法测定，使用具有某些修改。冷冻干燥后，1.0 毫克每种样品悬浮在毫升的M 0.1 1.0 磷酸盐缓冲液（ pH 7.0 ）中并加入到将其预先溶解在乙醇（ 99.5）的 1ml 的亚油酸（ 50 毫米）中。在玻璃试管中培养，用硅橡胶帽紧密的密封，在 60下的黑暗环境中培养8 天。氧化的程度根据由Mitsuta 等人描述的方法通过测定硫氰酸铁的值进行测定（30） 。100 微升的样品的同4.7 毫升75 （体积 /体积）乙醇， 0.1ml 的 30 （重量 /体积）的硫氰酸铵，和0.1 毫升溶解在 1M

14、盐酸中的 0.02M 的氯化亚铁混合。3 分钟后，发色，它表示亚油酸的氧化程度， 测定分光光度波长为500nm。 BHT 和-生育酚（ 1 毫克/毫升）也作为抗氧化剂进行测定。参考阴性对照（不含抗氧化剂）。纯化的抗氧化肽。WSE 进行分级分离，通过超滤（ULTRAFREE -MC 离心过滤装置 ; Millipore ）中通过使用三个不同的膜尺寸的50 - ， 30 - 和 10 - kDa的截止值（压裂蒸发散A，B 和 C ，分别） 。400L WSE 的等份试样在 10,000 g下离心 60 分钟。超滤之后，级份用于DPPH 自由基清除活性试验。10- kDa 的部分纯化的级分测定 （C

15、）使用 RPC柱和 AKTA FPLC 设备，在 214nm 的 UV 检测器操作（ GE Healthcare公司进一步分馏（37 级） ，通过反相快速高效液相色谱法（ RP- FPLC ）生物科学 AB，乌普萨拉，瑞典）。含肽的 1 毫克/毫升的等分试样添加至 0.05（体积 /体积）三氟乙酸（TFA ）中，10,000 g离心 10 分钟。将上清液过滤，用 0.22 -间孔径的过滤器，并上样到柱上。以1 毫升/分钟的流速使用水和乙腈（ CH 3 CN） 含 0.05TFA 组成的流动相进行梯度洗脱。CH 3 CN中的浓度在 62 和 72 分钟从 5?46呈线性增加， 在 16 和 62

16、 分钟之间从 46 到100。用冷冻干燥的方法从收集的馏分中除去溶剂，剩余级分重新溶解于无菌名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 15 页 - - - - - - - - - 水中，进行体外测定抗氧化活性。蛋白质水解和纯化馏分的热稳定性。从 WSE 纯化的级分，这显示出最高的抗氧化活性是根据帕西尼等人描述的方法进行连续的蛋白水解酶（34） 。简要地，冻干等份中的含量相当于Sterilmixer 实验室（ PBI 国际）测定的的10 毫克肽悬浮在 400 升含胃蛋

17、白酶的0.05 毫克/毫升（ EC 3.4.23.1 ） （ Aldrich 公司，圣路易斯， 密苏里州 （ pH 值 2.0） ） 的 0.2 当量盐酸的匀浆中。 在 37搅拌条件下（ 150转）在含 115微升的 1M 硼酸和 0.5N NaOH 的溶液中培养， 在 30分钟后，用 5N HCl 调节 pH 值至 6.8，并加入 0.25 毫克/毫升的胰酶和 0.0087 毫克/毫升 Sigma公司胰蛋白酶（EC 3.4.21.4 ） （ Sigma 公司） ） 。所得 pH 为 7.6 。胰腺消化历时 150 分钟。消化的样品在100下加热 5 分钟，并以 12,000 g 离心 20分

18、钟，回收上清。后处理，样品进行体外抗氧化活性测定。鉴定抗氧化肽。 WSE 的具有最高自由基清除活性的级分，再 RP-HPLC 先前描述的条件下进行提纯的第二步骤，并使用AKTA 净化装置（ GE 保健生物科学公司，新泽西州皮斯卡塔韦）。收集峰的中心， 冷冻干燥，以及用于质谱（MS ）分析。肽的鉴定是通过纳米ESI 接口使用菲尼根LCQ 德卡 XP Max 离子阱质谱仪（热电子）开展纳米液相色谱- 电喷雾 - 串联质谱（ nano-LC-ESI-MS/MS ） 。操作根据 nano-LC-ESI-MS/MS 分析制造商的仪器设置， MS / MS 谱是由 Xcalibur软件（热电子）在正离子模

19、式下进行自动拍摄。光谱使用软件BioWorks3.2（热电子）处理，产生的列出峰值适用于数据库搜索。使用MS/ MS 离子与搜索的蛋白质测定搜索引擎（ Matrix Science公司，伦敦，英国）并在 NCBInr 蛋白质数据库鉴定肽（国家生物技术信息中心，马里兰州贝塞斯达）。肽的鉴定，以下参数被认为是：酶， 无;仪器类型，ESI-陷阱;肽质量误差，0.1;和碎片质量公差，0.5Da。结果中肽鉴定的描述经Chen 等人手动评估。（5） ，和用经过验证的肽序列解释所有 MS / MS 谱图的主要峰。纯化的肽在氧化诱导的细胞中的生存能力。小鼠成纤维细胞（ BALB 3T3 ;克隆 A31 ，AT

20、CC CCL- 163TM ） 用含有 10（重量/体积） 胎牛血清经 Dulbecco改良的 Eagle培养基（ DMEM ）中的湿润气氛 （5 CO 2 ， 37）下培养， 1 2mM 谷氨酰胺， 和 100 微克/毫升的青霉素- 链霉素。每 2 天将培养液续期， 用名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 15 页 - - - - - - - - - 后 4 代的培养物用来确定细胞活性。使用MTT 3 - （ 4,5 - 二甲基吡啶 -2 - 基）-2,5 -

21、 二苯基溴化 细胞存活力测定法 （18） ，和琥珀酸脱氢酶的转化3 的容量 - （ 4,5 - 二甲基吡啶 -2 - 基）-2,5 - 二苯基 - 四唑溴化物转化为可见光的甲臜晶体进行了评估。对于 MTT 测定， 将细胞接种在 5104 细胞/孔密度的 96 孔板中，培养 16 小时。细胞随后分别用抗氧化和纯化的级分处理，并再温育 16 小时。肽在反应混合物中的终浓度分别为1.20 ， 0.81 ，2.33 ， 0.41 ，1.79 ，2.88 ，1.69 ， 并且 3 是 1.67毫克/毫升 WSE 从全麦的馏分，阐明 2 和 3， 馏分 5 和 36 是黑麦；2，3 和 37 是卡姆。使用

22、不加级分的培养物肽进行阴性对照， 。 -生育酚（250和 500 M ）用作阳性对照。以下去除胎牛血清，细胞暴露于150 1M 氢氧化物中过氧化 2 小时。对于每个孔，向250 升 MTT （0.5 毫克/毫升终浓度）中加入 DMEM 溶液，并在黑暗中温育（37）保持 1 小时。最后，二甲基亚砜（DMSO） （250 升）溶液中加入以溶解形成的甲臜。甲臜的水平是通过测定在570nm处的光密度与百特EL808 酶标仪（威努斯基， VT）测定的。相对细胞存活率被视为 MTT 转化为甲酸盐的水平。数据表示为存活细胞的平均百分比，与氧化应激前的对照培养物进行比较。统计分析。 数据进行单因素方差分析 （

23、 ANOVA ） ; 对比方法由杜克的程序以 P 0.05使用 Windows 统计实现。结果酵母发酵 ：在 37 度发酵发酵 24 小时后，乳酸菌细胞密度范围为1.20.4到 6.20.5*109 cfu/G，最低值是在燕麦、大米以及玉米粉中。没有在全麦、硬质小麦、 黑麦、斯佩尔特小麦、 有机卡姆小麦和大麦粉的细胞密度中发现明显差异 （P0.05） 。 在发酵之前，ph 值分别为为全麦 5.200.05,硬质小麦 5.270.06,黑麦 5.82 0.04,斯佩尔特小麦 5.45 0.08,燕麦 4.56 0.02,大米 5.15 0.02, 有机卡姆小麦 5.37 0.03, 大麦 5.2

24、3 0.03, and 玉米面团 4.45 0.02 在发酵之后， ph值从 3.40 0.03 到 3.88 0.05最低的 PH 值在大米 （3.26 0.02）和全麦（ 3.40 0.03）酵母中最高的值在燕麦酵母中（3.88 0.05）在体外 WSE 的抗氧化活性 ：来自酵母的 WSE 作为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲剂的提取物控制生面包团的ph 在 6.50.2 到 7.00.2 之间。 用邻苯二甲名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 15 页 - -

25、- - - - - - - 醇的方法标定。 Wse 多肽链的浓度为全麦0.68 0.04,硬质小麦0.41 0.02, 黑麦 1.12 0.05,斯佩尔特小麦0.68 0.05, 燕麦 0.31 0.01, 大米 0.180.02,有机卡姆小麦0.610.03,大麦0.71 0.03, 和玉米面包团0.910.04 mg/ml。酸化后面包团 Wse 肽链的浓度其他的发酵的低2 到 3 倍在基团 -清理的实验中。 被染色的稳定的 DPPH变成了 DPPH-H(没有基团形式 )在有抗氧剂或者氢供体的情况下。DPPH基团在没有抗氧化剂的情况下会延长稳定的时间。在实验条件下，100%的活性表明了在 1

26、0分钟的抗氧化剂的潜伏后完成DPPH基团（最后浓度为 50 M）的清除。在之前的研究中，DPPH基团的颜色强弱随 BHT的浓度呈指数下降。对于 WSE酸化的生面团稳定 DPPH基团清理的活性在3.0% 0.2% 到 5.5% 0.2%之间。在样品之间没有发现明显的差异（P0.05） BHT(1 mg/ml) 显示了 65% （10min） 的活性。几乎所有来自酵母的 WSE，相比较来自化学酸化的生面团的显著地提高了基团清理的活性。硬质小麦、玉米和大麦中的酵母没有表现出可观的增长。最高的清除活性为大麦(48.0% 0.4%), 有机卡姆小麦 (39.0% 0.2%) 斯佩尔特小麦 (37.3%

27、0.4%) 黑麦(35.4% 0.5%)中的酵母。根据这些结果，化学酸化的生面团没有其他特点了。生面团酸化的 WSE的DPPH基团清理活性（黑条 -D）和与挑选过的乳酸菌一同发酵的酵母（灰条-S）BHT(白条 )被用作正向调节， ww全麦，dw硬质小麦， r黑麦，s斯佩尔特小麦， o燕麦ri大米k有机卡姆小麦， b大麦 m玉米。数据由三个独立实验获得。三个实验用的是相同的标准进行比较检验（P0.05）脂质过氧化反应是通过在不饱和脂肪酸（35）的亚甲基中， 利用基团媒介提取氢原子来进行的。来自酵母的WSE 在 500nm 的吸收比比来自正控制的要高。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 -

28、- - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 15 页 - - - - - - - - - 与之前的基团清理活性结果一致，亚油酸的氧化明显的受来自全麦、斯佩尔特小麦、黑麦和有机卡姆小麦酵母的WSE 的加入的控制。来自硬质小麦、大米、燕麦、大麦和玉米酵母中的WSE 显示了较低的活性。针对识别抗氧化剂缩氨酸， 全麦、斯佩尔特小麦、 黑麦和有机卡姆小麦酵母中的 WSE 经过超滤作用后，（10,30和 50kDA 为界限）经过进一步基团清理活性的检验，所有的超滤作用中的片段表明了DPPH 集团的活性，暗示了氧化剂的化学分子

29、量比 10kda要小（数据没有表明）。提纯并且特征化氧化剂缩氨酸片段每一个 WSE（用邻苯二甲醇测定，包含10Mg 缩氨酸）被 RP-FPLC 分开后，可以收集有37 个片段。不同的WSE 的分配基本相同。（FIG 3）冷冻干燥收集的片段，融入600 l 蒸馏水中，并且检验DPPH 基团清理活性和亚油酸自养化抑制性。根据DPPH 基团清理实验，FIG 2 . 同乳酸菌一同发酵的酵母中的WSE脂质过氧化作用抑制活性，活性以亚油酸氧化系统作为基准测量八天。BHT和 -维生素 B被用在进行正向控制。没有抗氧化剂的负向控制也被考虑了进来（ct），数据由三个独立实验的来，条纹显示了标准差。名师资料总结

30、- - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 15 页 - - - - - - - - - 图三 RP-FPLC 色谱图 WSE 的全麦（A),spelt(B),黑麦（C),kamut(D)酵母细胞发酵池的选择为乳酸菌。虚线是指自由基清除活动的百分比（破折号和点线）和梯度洗脱液B（破折号的行）。箭头表示抗氧化性最高的活性。Ct,控制。8 种活性最高的被挑选出来。他们是从全麦酵母中提取的片段3(ac-tivity of ca. 27%, peptide concentration of

31、 1.20 0.04 mg/ml)；从 spelt 酵母中分离的片段2 (ca. 90%, 0.81 0.03 mg/ml) 和片段 3(ca. 75%, 2.33 0.04 mg/ml)从黑麦酵母中提取的片段 5(ca. 45%,0.41 0.02 mg/ml) 和片段 36 (ca. 38%, 1.79 0.05 mg/ml) ；从 kamut 酵母中提取的片段2(ca. 48%, 2.88 0.03 mg/ml),3(ca. 49%, 1.69 0.05 mg/ml),37 (ca. 36%, 1.67 0.04 mg/ml).所有片段都体现出类似于(80.6%) 和 BHT (82.3

32、%)对亚油酸的过氧化反应起抑制作用。特别的，spelt 酵母的片段 3和黑麦的片段 36活性最高(83.9%). 没有发现多肽浓度和活性之间存在相关统计性。所有纯化的多肽都被胃蛋白酶， 胰蛋白酶和胰酶连续水解， 用以模拟消化过程。通过自由基清楚的速率得到，来自kamut 酵母的片段 37 和来自黑麦酵母的片段 5 和片段 36 较未消化的片段（活性分别为35,42和 35）抗氧化活性减少百分之 10.其他片段活性没有明显降低， （全麦的片段3 活性为百分之 27，spelt 酵母的片段 2 和片段 3 活性分别为百分之89和百分之 76.kamut酵母片段 2 和片段3 的活性分别为百分之49

33、 和百分之 49）水解的多肽活性在100 摄氏度下加热 5名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 15 页 - - - - - - - - - 分钟不受影响。分离鉴定抗氧化多肽物。含有 8 到 57 个氨基酸残基，分子质量从769.8 到 5,338.5Da的 25 种多肽通过 nano-LC-ESI-MS/MS analysis 分离出来。所有蛋白质都在 NCBInr 数据库中被找到作为不同的谷物蛋白。两个 14 肽和 8 个氨基酸残基，疏水比率分别为百分之64

34、 和百分之 50， （分别是序列 1 和序列 2）小麦酵母总静电荷为0.从 spelt 酵母中的片段2 和片段 3中分离的四肽和三肽含有8 到 21个氨基酸残基。除序列4 和序列 9 外，疏水键达 50.除序列 6，所有的多肽总电荷呈中性。从黑麦酵母中的片段5 和片段 36分别得到 4 种和 5 种多肽。主要的序列含有 26 到 30个氨基酸残基。 序列 11,13，14 和 15 较短（ 10 到 16 个氨基酸残基）除了序列12,17,18，疏水键数目高达百分之 48 以上。序列 18 和序列 20 成电负性，然而其他序列都成电中性和正电。从 kumat 酵母细胞的片段 2，片段 37 分

35、离到 2 种多肽，片段三中分离到3 种多肽。片段 37 的序列 24 和序列 25 含有最多的氨基酸残基数（分别为57 和 52） 。其他序列较短（少于21 个氨基酸残基）除了序列22，疏水键高达百分之35.所有从片段 2 和 3 中分离的多肽带正电或成电中性。 但是片段 37 中的序列 24 和序列 25 带负电。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 10 页，共 15 页 - - - - - - - - - 图 4 中从已发酵的乳酸菌中提取出来的脂质过氧化抑制活性的纯化

36、肽分数WSE。活性是在黑暗的亚油酸氧化系统环境中测量8 天得出。 BHT 和生育酚用作正调控因子。Ct,负性调控 （没有抗氧化剂） ,；at,a生育酚； ww3,小麦片段 3；sp2 和 sp3,分别为 spelt 酵母的片段 2 和片段 3；r5 和 r36 分别代表黑麦酵母的片段 5 和片段 36；k2,k3,k37 分别是 kumat 酵母的片段2,3,37.实验数据来源于三个相互独立的实验。柱代表标准偏差纯化多肽类物质对氧化诱导细胞活性的影响：为了观察纯化多肽类物质的氧化能力，将小鼠的纤维母细胞和来自小麦，斯佩尔特小麦， 黑麦以及 kamut酵母细胞的 8 种纯化片段共同培养。 然后用

37、过氧化氢处理细胞， 在实验条件下， 细胞活性通过评估线粒体中的线粒体乳酸脱氢酶类对 MTT 的催化生成有色甲盐的能力实现。生育酚和所有纯化片段相比于负调节因子都能提高细胞存活能力。尤其是纯化的酵母3 片段比 500uM 的生育酚活化作用更大。其他三种酵母的纯化片段活性高于250uM 的生育酚。讨论名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 11 页，共 15 页 - - - - - - - - - 酵母发酵对提高小麦、黑麦和燕麦烘焙食品的营养性能有著名的作用(22)。它稳定或增加

38、各种生物活性化合物的水平,阻碍淀粉的生物利用度 (从而降低血糖指数),并增加无机物的生物利用度(10、13、42)。据我们所知 ,这是第一个研究酵母菌和 乳酸菌通过本地谷物的蛋白质水解蛋而释放具有抗氧化活性多肽能力的报告。人类营养和生物化学领域的,关于来自食物的天然抗氧化剂的研究是很多的,因为他们有潜在的健康益处而且很少或根本没有副作用。低分子质量、低成本、高活动 ,容易吸收 ,是肽类抗氧化剂的主要特点。尽管人工合成抗氧化剂更有效,但天然抗氧化剂有更简单的结构,更高的稳定性 ,和无免疫排斥的危险 (43)。假如从谷物蛋白质中提取的生物活性肽对健康的人不产生免疫排斥性,也无过敏反应的,但对于患有

39、特定过敏症 ,无法接受或者对该类抗氧化性肽类十分敏感的受试者，它就会引起免疫反应或者过敏反应。全麦、硬质小麦、黑麦、斯佩耳特小麦、燕麦、稻米、有机卡姆小麦、大麦,玉米是最常见的用于生产发酵烘焙食品的谷物面粉。让选定的乳酸菌在半流体的条件下进行长时间酵母发酵,它对于充分利用微生物蛋白质水解是不可或缺的(38)。在这些处理参数下 , 发生了一种温和但不太广泛的面粉蛋白质降解(38)。进行酵母发酵的乳酸菌培养池内包括10个菌株 ,这些都是基于其对小麦蛋白的蛋白酶和肽酶活性影响的而选定的菌株(37)。蛋白酶活性 ,尤其是大量肽酶的组合是在酵母发酵过程中释放生物活性肽的先决条件(11，17)。在酵母乳酸

40、细菌发酵中降解谷物蛋白水解活动并不普遍,一般来说能有一种具有所有必需酶的独特微生物菌株是很罕见的(13)。之前 ,同一培养池的乳酸菌被成功用于降低导致腹泻病的抗原 (37)和在小麦和黑麦面粉酵母发酵过程中合成ACE 抑制活性肽(38)。尽管谷物内源性酶会由于酸化而被激活(16), 但(人为控制的 )生面团的化学酸化引起而产生的的抗氧化活性一般来说很低。从几组控制在几乎相同的酸度的酸面包的 WSE 可以看出，在体外清除自由基活动能力和亚油酸自氧化的抑制作用的提升。全小麦、黑麦、斯佩耳特小麦和卡姆的菌株发酵中的活性最高,然而, 在浓度化验中其浓度低于二叔丁基对甲酚和-维生素 E。许多谷物是密切相关

41、的物种,但很多因素例如高度的多态性, 蛋白质 (溶解度类)分数比例的不同 ,氨基酸组成和序列 ,单个多肽的分子量可以 ,区分不同技术、结构、营养和功能性质的面粉(44)。因此，可以预期源于不同谷物多肽的功能性质名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 12 页，共 15 页 - - - - - - - - - 是有差异的。针对抗氧化肽的纯化,在 RP-FPLC 分离后从全麦、斯佩耳特小麦、黑麦、和卡姆发酵算面包中选定八个片段(肽的浓度低于 3 毫克/毫升)。在乙腈梯度的前面区域

42、洗脱六个片段。 另外两个是在乙腈梯度的末尾被洗脱。其中一些片段(分别来自斯佩耳特小麦和黑麦的3和 36)在体外的抗氧化活性高于那些用人工合成抗氧化剂作正向控制剂的片段。如前面所报道的(29,38),纯化后的片段和原始提取物的结果相比可以显示更高的生物活性, 和含有其他基质的成分相比有更高浓度的活性化合物。图 5 纯化肽片段对老鼠成纤维细胞活性的影响小鼠成纤维细胞在没有胎牛血清的DMEM 培养基上培养并且和纯化多肽类片段一起培养16 h。 氧化应激是由 150M 过氧化氢氧化2 h 的人工培育细胞培养控制诱发的。与未处理的培养物相关的活细胞比例由3 -(4,5 - dimethylthiazol

43、-2-yl)2 、5-diphenyltetrazolium 溴化 (肽)测定来确定。 Ct，控制没有抗氧化剂。t1 and t2，维生素 E 分别为 500 和 250克/升。ww3, 全麦的片段3。sp2 and sp3, 分别为斯佩耳特小麦的片段2 和图 3。r5 and r36, 分别黑麦的片段5 和 36。And k2, k3, and k36, 分数有机卡姆小麦的片段2、3 和 37。数据是三个独立的实验分析数据平均值的两倍。在同一水平线的平均值与土耳其比较检验的平均值(P 0.05)相似。为了提高活性 ,抗氧化肽应该有克服肠道的水解和修改的能力以达到目标名师资料总结 - - -精

44、品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 13 页，共 15 页 - - - - - - - - - (43)。总的来说 , 纯化部分的抗氧化活性好像并没有受用消化酶连续离体处理的影响。略有减少的抗氧化活性只出现在卡姆酵母的序列37和黑麦酵母的序列 5和序列36,这些部分含有最大尺寸的肽。在体外实验中, 测定了小鼠成纤维细胞纯化部分的间接体内疗法的抗氧化活性,其受到非自然的氧化应激的影响。利用MTT分析如图所示 ,所有的纯化部分都表现出显著的保护作用。特别地,斯佩耳特小麦酵母的序列 3和黑麦酵母的序列

45、36,也显示最高的对亚油酸自氧化的体外抑制作用 , 与维生素 E相比，对小鼠成纤维细胞的生存有影响。然而, 应进行一个具体的体内试验来评估其对人类健康的影响。在nano-LC-ESI-MS / MS 分析中发现 25种纯化肽。这些多肽都从未被证明为抗氧化剂 (43)。在所有活性部位发现一种肽的混合物。总的来说 ,假设最强的抗氧化活性是由于肽之间的协同效应,而不是单一肽的个体活动产生的(5)。几乎所有的序列表明了常见抗氧化肽的特性,如分子质量低 (43)。氨基酸的存在， 如酪氨酸(Y)、色氨酸（ W） 、甲硫氨酸（ M） 、赖氨酸（ K） 、脯氨酸（ P） 、半胱氨酸（ C） 、组氨酸（ H）

46、、缬氨酸（ V） 、亮氨酸（ L）和丙氨酸（ A） ，被不同程度归结于肽的抗氧化活性(42)。除了序列DNIPIVIR和GTIFFSQEGDGPTSVTGSVSGLKPGLHGFHVH ALGDTTNGCMSTGPHFNPTGK ，被分别发现于全麦面包酵母的序列3和黑麦酵母序列 36,所有其他的序列由上述氨基酸完全组建(如斯佩耳特小麦酵母的序列3HPVPPKKK) 或大部分组建。疏水性氨基酸增强肽在脂质中的溶解度, 从而促进疏水性自由基和疏水性 PUFA (多不饱和脂肪酸 )(43)。 事实上 ,14/25 的序列的疏水率 在50% 以 上 。 已知 的疏水 性最 高的 序列 有MAPAAVA

47、AAEAGSK(64%)、EALEAMFL(75%) 、LC PVHRAADL(60%), 和PAEMVAAALDR(70%) 。由于与自由基的直接相互作用， 半胱氨酸 (C)的SH很强的抗氧化活性(34)。黑麦酵母的序列5，NANGELCPNNMCCSQ WGYCGLGSEFCGNGCQSGACCPEK,包含8个半胱氨酸残基。假设含组氨酸肽的抗氧化活性与氢气的供应相关,脂质过氧化氢自由基捕获和 /或金属咪唑组的离子螯合能力(3，36)。八个序列包含组氨酸的残留。 特别地 , 在N末端的组氨酸中发现来自斯佩耳特小麦酵母的序列3和卡姆酵母的序列 23的序列 HPVP PKKK 和HKEMQAIF

48、DVYIMFIN, 且C末端的组氨酸中发现来自黑麦酵母的序列15和卡姆酵母的序列2的序列 KVALMSAGSMH 和名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 14 页，共 15 页 - - - - - - - - - GVSNAAVV AGGH 。在N末端的组氨酸主要充当了金属离子螯合剂,在C末端的组氨酸是一种对各种自由基的有效清除剂(4)。四个序列的 N端或C端含有丙氨酸或亮氨酸 ,这已经被证明是抗氧化肽的一个典型特征(43，47)。含有芳香残留的氨基酸可以给缺电子的自由基提

49、供质子，这个性质可以提高多肽的清除自由基活性(43)。十六个序列包含一个或多个芳香族氨基酸。这项研究表明 , 在各种谷物面粉发酵过程中已选定的乳酸菌有合成抗氧化肽的能力。这里采用的发酵条件可以适用于工业水平上制造高营养价值的烤焙面包产品添加剂。已纯化的多肽类表现出兼容各种抗氧化机制的生物活性，从而表明对防止自由基氧化的保护。这些特性可能导致具有创新功能食品的生产和新合成肽食品/医药方面的设计。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 15 页，共 15 页 - - - - - - - - -