血小板功能检测.doc

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1、精品文档，仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除血小板功能检测：血小板在止血和动脉血栓形成中的作用包括粘附到受损血管处或破裂的动脉粥样硬化斑块处，形成止血栓或凝块；加速凝血瀑布导致凝血酶的形成。本文综述了血小板的作用，列举了遗传性的血小板缺陷及异常出血性疾病，并讨论了各种血小板致聚剂。本文综述了各种血小板功能检测方法以及它们的优缺点：出血时间测定；利用透光性的改变来检测枸橼酸钠抗凝的富含血小板血浆中血小板的聚集功能；阻抗聚集仪检测枸橼酸钠抗凝全血中血小板的聚集功能；高切变力血小板功能分析仪（PFA-100）和 Ultegra快速血小板功能测定仪检测血小板相关的止血功能；用锥板分析仪检测高切变力

2、下血小板的粘附和聚集功能；检测血小板颗粒内容物的分泌（ATP, 14C-5-羟色胺,血小板第4因子和血小板球蛋白）和血栓烷B2的形成；流式细胞术检测体内和体外使用致聚剂的血小板激活情况（包括血小板膜糖蛋白构象改变，P-选择素和磷脂酰丝氨酸的表达）；检测遗传性缺陷中血小板膜糖蛋白的水平。1 简介 血小板在止血和血栓中的作用当血管损伤时，血小板会迅速粘附到损伤处，聚集形成由纤维蛋白固定的止血块。在微血管损伤处及破裂的动脉粥样硬化斑块处也会发生类似的过程，最终形成血小板纤维蛋白血栓，引发动脉硬化症的血栓性并发症。体内能够激活血小板的诱导剂主要有胶原蛋白，ADP，血栓烷A2（TXA2），凝血酶，弱诱导

3、剂有5羟色胺和肾上腺素。血小板上不仅有针对这些介质的受体，还有纤维蛋白原和VWF的受体。TXA2的形成和释放以及血小板致密颗粒中分泌的ADP和5羟色胺会加速血小板的激活过程，促凝表面的暴露促进凝血酶的形成，而凝血酶是强有效的激活剂。激活也会诱导-颗粒内容物的分泌和颗粒跨膜蛋白P-选择素出现在血小板的表面上。所有血小板致聚剂都具有协同作用，因此当凝集过程的某个途径存在缺陷或被抑制时，血小板的凝集功能将被大大受损。在血管壁的损伤处，血小板与内皮下细胞外基质中的Von Willebrand 因子（VWF），胶原蛋白和纤维结合素粘附在一起。在高切变力情况下，血小板糖蛋白GPIb/IX/V复合物与VWF

4、的相互反应是非常短暂的，但当VWF与血小板表面的GPIIb/IIIa结合，这一过程会变成不可逆的。血小板表面胶原蛋白受体包括GPIa/IIa（21），它在粘附过程中具有非常重要的作用；而GPVI在血小板活化引起TXA2的形成和释放以及致密颗粒和贮存颗粒内容物的分泌过程中起作用。血小板存在TXA2和ADP受体，在损伤处流动的血小板受刺激后会改变形状，伸出伪足，进而在粘附血小板周围形成聚集物。聚集过程需要血小板表面的异二聚体整合素分泌和血小板表面磷脂双分子层翻转暴露促凝磷脂表面，通常为磷脂酰丝氨酸（PS）翻转到血小板表面。也会产生促凝活性的微粒。PS的暴露大大加速了凝血途径因子和凝血酶原酶的反应，

5、产生了最有效的血小板诱导剂-凝血酶。凝血酶切开血小板表面的蛋白酶激活受体，导致GPIIbGPIIb/IIIa复合物转变成纤维蛋白原的受体或某些情况下作为VWF的受体。这些蛋白会在邻近的受刺激的血小板之间搭桥。激活的正常的GPIIb/IIIa在血小板聚集过程中非常重要。当血小板受胶原蛋白和凝血酶等致聚剂刺激，能引起血小板颗粒的/IIIa的激活，形成TXA2和引起血小板颗粒内容物的分泌。凝血酶同样促使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，包裹在血小板聚合物表面形成坚固的止血块或血栓。在磷脂酶A2作用下膜磷脂释要目的在于确定异常出血的原因或确保在手术或牙科侵入性操作（包括拔牙）过程中的正常止血功能。多种方法尝试

6、来证实高血小板活性有血栓形成的倾向，这个专题最近被Thiagarajan和Wu等进行综述。异常出血常见的原因为血小板减少症，这可通过血小板计数来确定。当血小板计数低放出花生四烯酸时可产生TXA2。在环氧化酶（COX-1）和血栓烷合酶作用下，花生四烯酸转变为TXA2。TXA2只能短期存在，很快形成无活性的稳定产物TXB2。COX1被阿司匹林不可逆地灭活，因此血小板生成TXA2的能力受到它们在外周循环停留时间的影响。任何一项血小板功能受损，都会削弱凝血功能。血小板功能检测的主于50-70109/l，就会导致瘀斑和凝血异常。血小板减少症会影响大多数血小板功能检测方法，但对流式细胞术除外。1.1 遗传

7、性和获得性血小板功能缺陷表1列举了部分遗传性疾病，它们的血小板功能存在某种程度的受损，有明显的出血症状。除Von Willebrand病 (VWD)外，大多数缺陷非常罕见。虽然某些食物和天然物质中含有抑制物，但是药物因素仍是最主要的引起获得性血小板功能低下的原因。抑制血小板功能的药物中有能抑制COX的阿斯匹林和其它非甾醇类抗感染药，抗生素如青霉素，thienopyridines（噻氯匹定和clopidogrel）， GPIIb/IIIa拮抗剂，影响cAMP水平的药物，抗凝剂如肝素，纤溶制剂，心血管药物，神经科药物和麻醉药物等。到目前为止阿司匹林是最常见的抑制剂，至少有250种药物中含有这种成分

8、。阿司匹林的作用是长期的，它对COX-1的乙酰化作用是不可逆的。非血液系统疾病引起血小板功能降低的疾病有：尿毒症，慢性肝病，骨髓增殖性疾病和获得性VWD。 表1 遗传性出血疾病Glanzmann血小板机能不全：GPIIb/IIIa（IIb3）缺失或异常 它是纤维蛋白原和VWF的受体，对任何血小板致聚剂无反应。Bernard-Soulier巨大血小板综合症：GPIb/IX/V缺失或异常 它参与血小板与内皮下的VWF粘附。对瑞斯霉素无反应。GPIa/IIa（21）缺失或异常。 不能粘附胶原蛋白GPVI缺失或异常。 不能被胶原蛋白激活P2Y12缺失或异常。它是ADP和腺苷酰环化酶的受体。非常罕见贮存

9、池疾病包括血小板分泌缺陷初级分泌缺陷。是由于颗粒内容物缺陷或放大途径缺陷之外的原因引起的一大类分泌性疾病最常见的先天性分泌缺陷病致密颗粒缺陷（颗粒）（如Hermansky-Pudlack 综合症，Chediak-Higashi 综合症）颗粒缺陷（颗粒）（灰血小板综合症）致密颗粒和 颗粒缺陷Quebec 血小板综合症Jacobsen或Paris-Trousseau 综合症Scott 综合症。刺激后不形成促凝表面花生四烯酸动员，环氧化酶，血栓烷酶或TXA2受体、VWF缺陷1型VWD-VWF部分减少（占80病例）2型VWDVWF异常（占15-20病例）3型VWDVWF缺失（罕见）血小板型VWD。GP

10、Ib/IX/V表型功能增强纤维蛋白原缺乏症2 血小板功能检测最早的检测血小板功能的方法是出血时间。Thiagarajan和Wu定义的皮肤表面出血时间为：在上臂处用血压绷带加压到40mmHg，然后采用一次性的自动的设备在前臂的掌侧皮肤表面上划一道长10mm，深1mm标准的切口，每隔30秒吸去伤口处的血液，直到出血停止。正常的出血时间少于10分钟。当血小板计数小于100109/l时，出血时间会延长，因此这一方法“在血小板减少的患者测定血小板功能的缺陷时作用有限”。它的优点在于操作简单，快速，不需要对血液进一步的检测和处理，缺点是受技术人员的操作技术，皮肤厚度和温度的影响。本方法缺乏一致性，在判断出

11、血倾向方面是不敏感指标。其它血小板功能检测方法需要小心抽血和处理。患者不能加绷带和一周不能服用影响血小板功能的药物。19-20号针头和塑料注射器用于静脉穿刺，从静脉穿刺到实验的间隔时间必需标准化，这是因为血样中丢失的CO2会使pH值升高，增加血小板对致聚剂的反应能力。必须防止溶血，因为溶解的红细胞会释放出血小板的诱导剂ADP。容器必须是塑料的或硅化玻璃以防止血小板吸附到容器表面。抗凝剂的选择以及温度也会影响血小板的功能，抗凝血应置于室温或37，而不能置于4。一般不推荐使用真空管，除非使用自动血小板功能分析仪（见2.4和2.5）。最常见的抗凝剂是枸橼酸钠，它可以将钙离子的浓度降到微摩尔级（枸橼酸

12、钠终浓度为10.9mM，钙离子的浓度为40M；枸橼酸钠终浓度为12.9mM，钙离子的浓度5M）。如果使用EDTA抗凝剂，钙离子的浓度将能低至不能使血小板凝集。肝素的效果不好，因为血小板经常粘附到试管壁，并且会使血小板集聚，在离心中沉积到红细胞中，使富含血小板血浆中的血小板数目减少。水蛭素和PPACK通过抑制凝血酶的活性来抗凝，它们可以维持生理性浓度的钙离子，而某些实验中正需要这种浓度，但水蛭素的价格非常昂贵无法常规使用。2.1 血小板聚集到目前为止评价血小板功能最常见的方法是测定血小板的聚集功能，抗凝血在离心力135g离心15分钟，制备富含血小板血浆（PRP）。如果可能，血小板计数应当标准化（

13、如在浓度为250109/ l时测定）,这可以通过加入少血小板血浆来实现。1毫升（或0.5毫升）PRP在37加入到装有金属磁棒的玻璃试管中，在聚集仪中磁棒以1100rpm转动，通过比色计记录穿过PRP的光强度。大多数诱导剂加入后，血小板形态由片状转变为圆形，形成伪足，引起短暂的光透过率的下降，然后由于血小板聚集，光透过率大幅度增加。光透过率增加的速度和程度会被记录下来。致聚剂主要为ADP，肾上腺素，胶原蛋白，花生四烯酸，TTXA2的类似物如U46619，或凝血酶受体活化肽如SFLLRN。（凝血酶不能作为PRP的促凝剂，因为会引起凝结）。正常情况下枸橼酸抗凝的PRP，对高浓度致聚剂反应的聚集程度，

14、与TXA2的形成，颗粒内容物的分泌和血小板表面P-选择素的形成有关。低血小板计数会影响血小板聚集试验，如果PRP中血小板计数低于100109/l结果就不可靠。如果是脂血，也不能进行此试验。如果血小板改变了形态，但不能与所有的致聚剂发生聚集，则其原因可能是罕见的Glanzmann血小板减少症。与胶原蛋白或凝血酶相比，ADP是弱的致聚剂，在枸橼酸抗凝的PRP中，低浓度ADP只引起初步的，不完全的，可逆的聚集。但当浓度高于1-3M时，初级的血小板聚集将不可逆，而且紧接着会引起第二相不可逆的过程（图1）。这个两相血小板聚集过程依赖TXA2的形成。高浓度ADP情况下，这两相聚集过程会融合，形成一个平滑的

15、曲线（图1），类似于胶原蛋白或凝血酶的刺激效果。药物，如阿司匹林，会抑制TXA2的形成，阻碍了ADP介导的第二相聚集过程。在生理性的钙离子介质中，只会发生第一相的聚集反应。ADP诱导聚集严重减弱，以及胶原蛋白和凝血酶诱导聚集受损，提示为罕见的P2Y12ADP受体异常。噻氯匹定和clopidogrel通过此受体作用，产生类似的对ADP诱导选择性抑制。弱的致聚剂，肾上腺素（5-10uM），可聚集PRP中的血小板，而不改变血小板的形态，但肾上腺素的致聚作用并不一致。如果服用了阿司匹林或其它抑制TXA2形成的药物，血小板对任何浓度的肾上腺素都不反应，不会产生聚集。胶原纤维（1-5g/ml）会引起特征性

16、滞后（可达1分钟）的血小板聚集,聚集需要TXA2形成和颗粒内容物的分泌，而且基本上是不可逆的。虽然血小板形态发生了变化，但是阿司匹林及其它抑制TXA2形成的药物可以阻断低浓度的胶原蛋白引起的聚集反应。罕见的GPVI缺陷症表现为血小板受胶原蛋白刺激后并不发生聚集，但在受到其它致聚剂的刺激后通常会发生聚集。花生四烯酸可以转变为TXA2，因此可作为聚集剂。阿司匹林和其它可以抑制环氧化酶的药物具有抑制作用。但是TXA2的类似物U46619，却可以在此类抑制剂的存在状况下产生聚集作用。在罕见的环氧化酶缺失的病人，花生四烯酸不诱导血小板聚集，但U46619会引起血小板的聚集。SFLLRN(TRAP)具有凝

17、血酶的诱导血小板强聚集作用的功能，只有当TXA2形成障碍时，这一作用才会稍有减弱。分泌缺陷，特别是致密颗粒缺少ADP的增强作用，会造成异常的聚集，即存在正常的第一相过程，而无第二相过程。分泌缺陷时低浓度的胶原蛋白和SFLLRN诱导血小板聚集会减弱。2.2 瑞托霉素聚集血小板这一试验同样用聚集仪对枸橼酸抗凝的PRP进行测试。抗生素瑞托霉素可作为致聚剂，终浓度常见为1.5mg/ml。正常的样本是第一相聚集后紧接着会发生第二相聚集。缺乏反应提示为Bernard-Soulier综合症或VWF缺乏。2.3 全血血小板聚集用阻抗血小板聚集仪可测定稀释的抗凝全血的血小板聚集功能。将两个电极插入样本中，当有电

18、流通过时，血小板会粘附到电极上。然后添加致聚剂加以搅拌，在电极上的血小板周围血小板聚集，记录阻抗变化的速率和幅度。这一试验的优点在于不用制备PRP，而且脂血中的血小板功能也可测量，但不适合血小板计数极低的病人。2.4 血小板功能分析仪100Dade Behring血小板功能分析仪（PFA100）是微处理器控制的仪器，它可定量测定高切变力下血小板和血小板相关的止血功能。试验过程为0.8ml枸橼酸抗凝血加到装有一次性试验管的槽内（要求4小时内血样），预温到37，然后利用真空吸力使血样通过一个直径200m的不锈钢毛细管和直径为150m的硝酸纤维膜微孔，膜上包被胶原蛋白和肾上腺素（CEPI）或胶原蛋白

19、和ADP（CADP）。在5000-6000/s的高切变和诱导剂的作用下，血小板产生聚集，阻碍血液穿过微孔，堵塞微孔的时间称为终止时间（CT），最大测定值为300秒。血小板最初通过GPIb/IX/V和VWF间的相互作用以及GPIa/IIa,VWF的直接连接粘附到膜上的胶原蛋白上导致聚集，而不是由纤维蛋白原连接到活化血小板的GPIIb/IIIa引起聚集。12.9mM的枸橼酸钠抗凝时得到的CT值比浓度为10.9mM枸橼酸钠抗凝CT值要大，因此选择合适的抗凝剂浓度是非常重要的。PPACK也可用作抗凝剂。仅在CEPI管CT时间延长，可能是轻微的遗传性血小板功能缺陷（如贮存池异常）和阿司匹林抑制。CEPI

20、管和CADP管CT时间均延长，可能为严重的遗传性血小板功能障碍（如Glanzmann血小板机能不全和Bernard-Soulier综合症）和VWD。实际上PFA-100是有效的筛选VWD的手段，特别是1型VWD，而且对妇女月经过多及儿童的鼻出血怀疑有血小板异常或VWD进行鉴别是非常有用的。它同时有利于监测1型VWD患者对DDAVP的反应和PTCA患者对GPIIb/IIIa拮抗剂的反应，也可用于评估血库提供的浓缩血小板质量和血小板输注的效果。PFA-100具有操作简单，快速，重复性好，全血用量少的优点。血小板计数少于50109/L和红细胞比容25时会引起CT时间延长。2.5 Ultegra快速血

21、小板功能检测Accumetrics快速血小板功能实验（RPFA）提供了一种简单，快速，准确的血小板功能检测方法，它用于床边监测接受GPIIb/IIIa拮抗剂的患者。枸橼酸钠抗凝全血采集后，马上取0.16ml样本加到有2个样本通道的一次性试管中。通过由微处理器驱动的钢珠运动，血液与血小板致聚剂（iso-S）FLLRN和纤维蛋白原包被的聚苯乙烯珠混匀70秒，检测样本的透光强度。激活的血小板和包被纤维蛋白原的珠子之间发生凝集，沉入底部，引起光透过率的增加。凝集的速度和强度可用血小板凝集单位（PAU）计算，当有GPIIb/IIIa拮抗剂存在，PAU值会迅速下降，这是因为凝集发生与活化血小板上的未被阻断

22、的GPIIb/IIIa受体成正比关系。RPFA用来监测GPIIb/IIIa拮抗剂abciximab, tirofiban,eptifibatide和orofiban对血小板的阻断效果。2.6 锥板分析仪Varon及其同事开发了锥板分析仪（CPA），在高切变力的条件下使用锥板粘度计检测血小板的粘附和聚集。这一装置通过锥体的旋转在板表面产生均一的切变压力引起层流。0.2ml的枸橼酸钠抗凝全血加到聚苯乙烯板上，以1800/s 切变速度旋转2分钟，随后染色。图形分析仪分析粘附的血小板和血小板聚集，可提供大小分布的的直方图，表面覆盖的百分比(SC)和平均大小(AS)。血小板粘附到聚苯乙烯板上依赖于板上包

23、被的VWF和纤维蛋白原，GPIIb/IIIa，GPIb/IX/V以及血小板的激活。CPA可快速确定先天性和获得性的血小板缺陷及VWD，也可测试抗血小板疗效和确定血小板功能亢进患者的血栓前形成状态。CPA的优点在于快速，简单，只需0.2ml全血。2.7 颗粒内容物分泌的检测发光聚集仪可同时检测血小板聚集和ATP（一种致密颗粒的组成部分）的释放。用荧光素酶检测ATP，ATP的浓度参照正常人PRP和已知ATP浓度制备的标准曲线进行计算。加入诱导剂，检测已标记血小板的14C-5-羟色胺的分泌状况可指示致密颗粒的分泌情况。当诱导分泌内容物时，颗粒跨膜蛋白P-选择素会出现在血小板的表面，这可通过流式细胞仪

24、检测（见2.9）。血小板第4因子（PF4）和血小板球蛋白是血小板特异性蛋白，贮存于颗粒，在血小板激活时释放。可用放射性免疫方法测定，但应注意静脉穿刺对结果影响比较大。2.8 花生四烯酸的动员和血栓烷B2的形成在正常情况下，诱导剂可将花生四烯酸从血小板的磷脂层中动员出来，并通过血小板转变为血栓烷B2。血栓烷B2是一种稳定的复合物，可通过商用的放射性免疫测定法和酶免法来测定。2.9 流式细胞术流式细胞术可快速检测抗凝血、稀释全血、PRP、人工介质中悬浮的少量血小板。使用全血可以避免操作过程中血小板被激活。通常血小板与联接不同光谱的荧光素的两种单克隆抗体（MoAbs）反应。为确定血小板的特异性，第一

25、个MoAb特异性针对GPIb,IIb或IIIa，并在近饱和溶液中使用。为确定血小板上的抗原决定簇，血小板还与另一标记MoAb反应。这种MoAb特异性针对表位，也在饱和溶液中使用。与抗体孵育后，稀释样本以1000-100，000细胞/min的速度在流式细胞仪上检测。聚焦激光束在其相应的吸收光谱内激发了联接的荧光。血小板通过标识的荧光素以及前向角和侧向角的特性进行确认。第二个单抗发出的荧光强弱与某一抗原决定簇的密度成正比，并可通过获取上千个血小板来计数。这些数据均可用软件来分析。因为激发光谱有部分被重叠，每一混合荧光需设置补偿。如果抗原决定簇的表达随着时间而变化（如膜GPs的滑动），着色前血小板可

26、先用1的多聚甲醛固定，它不干扰抗体结合。如果不是立即进行流式细胞仪检测，血小板也可在加入着色剂后再固定（原理同上）。许多荧光素标记的抗体及非抗体源的探针均可标记血小板抗原决定簇。MoAbs除可以和未被活化血小板的GPs结合外，某些激活依赖MoAbs可检测GPs构象变化（如PAC1可检测GPIIb/IIIa）或颗粒膜蛋白表达（如抗P选择素）。非抗体探针包括PKH亲脂性膜染料，可用链亲和素标记荧光检测的生物素和用于检测血小板活化促凝表面的暴露情况的荧光标记的annexin V。流式细胞仪可有效评估离体血小板活化程度及评价体外使用致聚剂后血小板的敏感性。它用来检测某些病程中血小板的活化情况，如不稳定

27、心绞痛，急性心肌梗死，顽固冠心病，初期子痫，外周血管病，脑血管缺血和冠状动脉血管成形术。流式细胞仪还被用来监测血库提供的浓缩血小板的质量，因为保存期内血小板会有所变化。遗传性血小板膜GP缺陷如Glanzmann血小板机能不全和Bernard-Soulier综合症也可通过流式细胞仪检测。虽然流式细胞仪检测需要复杂的设备和试剂，但它有不少优点：只需微量的样本（5l），可检测血小板减少的样本、全血和血小板亚群。2.10 血小板促凝表面的表达活化血小板表面的PS可使用荧光标记的annexin V通过流式细胞仪检测（见上），也可选择发色凝血酶原酶实验测定促凝表面凝血酶的产生情况。3 总结血小板在血管严重

28、损伤时止血栓的形成，血管损伤处及动脉粥样硬化斑块破裂处凝块的形成中起重要作用。血小板功能检测的主要目的在于确定止血受损时异常出血的原因。同时它也被用来监测血小板高活性状态，以及估计血栓形成倾向的可能性。进行血小板功能检测，抽血及处理时应非常仔细，并使用合适的抗凝剂。最常见的血小板功能检测方法是测定PRP中加入ADP、胶原蛋白，肾上腺素，花生四烯酸等致聚剂后血小板的聚集功能；对特定致聚剂的聚集反应有缺陷表明特定途径中血小板活性受损。阻抗聚集仪检测全血中的聚集功能不需要处理血液。目前有多种快速，自动和只需少量样本的检测方法：PFA-100，能提供在高切变力作用下血小板及其相关的止血功能；RPFA用来评估使用GPIIb/IIIa拮抗剂的治疗效果；CPA利用锥板粘度计在高切变力下测定血小板的粘附和聚集功能。除检测血小板的聚集功能外，还可检测血小板的释放功能，包括颗粒内容物的分泌，凝血烷的形成和促凝表面的表达等。流式细胞仪采用荧光标记的抗体和非抗体源探针检测血小板的活性或体内血小板的激活状态。虽然需要复杂的仪器，但它的优点在于使用微量的样本和检测血小板亚群。 参考文献（略）【精品文档】第 6 页