细菌总数的测定法.doc

《细菌总数的测定法.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细菌总数的测定法.doc（3页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、精品文档，仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除细菌总数的测定法一、细菌数测定的基本概念药品细菌数测定是微生物的定量检查，是用来判断药品被细菌污染程度和卫生质量评价的重要指标，也是检测药品质量的重要指标之一。细菌计数是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH 位、培养温度和时间等）每1g、lml、l0cm2 供试品液经培养后所生长的菌落数。所谓一定条件是按我国药典规定，在需氧条件下，3035，一般培养48h,在营养琼脂培养基平板上生长的细菌菌落数。细菌数的测定方法有多种：平板法、薄膜过滤法、涂抹法。药品细菌数测定是活菌计数，最常用的平板法是以平板菌落计数为依据，即每个菌落代表个菌细胞，但有的

2、菌落也可能是多个菌细胞形成，如双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等，很可能是多个菌细胞在一起。故准确地说，细菌数测定值实际上是菌落形成单位数( CFU)。 平板法菌落计数法，是受一定条件的限制：如供试液是否均质，供试液中的细菌是否充分分散；培养基的质量、培养温度及培养时间的影响；有繁殖能力的菌细胞才能形成菌落，死菌及某此受损伤的细菌或营养要求苛刻的细菌在规定的培养基上不能生长，因而不被计数。在试验操作中应考虑到这此问题。二、设施、设备、仪器及器皿1、设施细菌数测定全过程应严格遵守无菌操作，在环境洁净净度l0000级和局部洁净度100 级单向流空气区域内进行，以防止再污染。2、设备、仪器恒温培

3、养箱（3035）、微波炉、匀浆仪（400010000r / min ）、康氏振荡器、恒温水浴、电热干燥箱（250300 ）、电冰箱、空调、高压蒸汽灭菌器（使用时要进行灭菌效果验证并应定期请有关部门检定）菌落计数器、显微镜（1500X）、电子天平（感量0.1g）、pH 值系列比色计、全封闭可拆卸或开放式的薄膜过滤器。3、器皿锥形瓶（250300ml ）、培养皿（9cm）、量筒（100ml）、试管（1818mm）、刻度吸管（l ml , 10ml）、载玻片、玻璃或搪瓷、不锈钢消毒缸（带盖）。玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。吸管上端距0 .5 cm 处塞入约2 cm 左右的适当疏松棉花，装入

4、吸管筒内或牛皮纸口袋中。锥形瓶、量筒、试管塞（硅氟塑料塞），再用牛皮纸包扎。使用的器皿应采用经验证合格的方法进行灭菌。4、用具大、小橡皮乳头（置干净带盖的容器中并应定期用5%来苏尔溶液浸泡），无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后用布袋或牛皮纸包严）灭菌，备用。也可使用一次性无菌衣、帽、口罩。接种环(白依金或镍铬合金）、乙醇（酒精）灯、乙醇棉球或碘伏锦球、灭菌剪刀、镊子或灭菌的手术刀、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔等。二、培养基、稀释剂除另有规定外一般使用营养肉汤琼脂培养基, 可按处方配制亦可采用干燥脱水培养基。主要稀释剂有0. 9无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液（供试品稀释用），0.9%无菌氯化钠溶液（对

5、照菌稀释用）。三、检验方法1、试验前的准备1）、将试验用灭菌的器皿、稀释剂及供试品外包装去掉，内包装消毒后移至无菌室内。每次试验所用物品必须事先计划周密，准备足够用量，避免操作中出入操作间。2）、开启无菌室紫外线杀菌灯和空气过滤装置并使其工作30min 。3）、操作人员用肥皂洗手，进入缓冲问，换上工作鞋。再消毒液洗手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。4）、用碘伏棉球或乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后，用灭菌的手术剪刀将供试品启封。2、检查方法1）、供试液的制备： 2）、供试液的稀释（l0 倍递增稀释法）：根据微生物限度要求或对供试品污染的程度估计，选择适宜的、连续23个稀释级的供

6、试液。用1 ml 灭菌吸管吸取1 ：10供试液lml，沿管壁徐徐注入装有9ml稀释液的试管中，（注意吸管尖不要触及管内稀释液），摇匀制备成l : l 00的供试液，另取l 支吸管同法操作制备1 : 1000 的供试液.3）、注皿：分别用灭菌吸管吸取不同稀释级供试液各lml ，注入平皿中，每个稀释级23个平皿，注入溶化冷却约45的营养琼脂培养基1517ml，快速转动平皿，使供试液与培养基混匀，放置，待凝，倒置培养。除另有规定外，一般在3035 培养48h 。若污染细菌生长缓慢可延长培养时间。4）、阴性对照试验：为确定试验全过程的无菌性（包括稀释剂、玻璃器皿等）应做阴性对照试验。试验方法：取试验用

7、的稀释剂1 ml ，置无菌平皿中，每次试验做2 个平皿，按上述细菌计数方法进行操作阴性对照平板不得有菌生长。5）、菌落计数：从平板的背面直接以肉眼用标记笔点计，以透视光衬以暗色背景，仔细观察，计数。必要时借助于放大镜观察。点计菌落数后，计算稀释级的平均菌落数，若相同释级的两个平板的菌落数平均数不小于15 ，则两平板菌落数不能相差l 倍或以上。细菌菌落形态特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、淡黄色、红色（如培养基中加人0 . 1%TTC试剂），菌落边缘整齐或不整齐，有放射状、树枝状、锯齿状、卷发状菌落表而有光滑、粗糙、皱折、突起或扁平，菌落大小差别很大，同一平板上可出现针尖大小至大于10m

8、m 菌落，外观多样，小而突起或大而扁平，或石雾状，不规则。一般营养琼脂培养基用于细菌计数；虎红培养基用于霉菌及酵母菌计数。3、菌落报告规则宜选取细菌平均菌落数在30300之间的稀释级，作为菌数报告的依据。1）、当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数报告菌数（见表9.1.1 例l ) 2 )、 当同时有2 个稀释级的菌落数符合上述规定时，计算二稀释级的菌落数比值（高稀释级除以低稀释级的比值），若二者比值不大于2 ，以两稀释级的菌落平均数乘以稀释倍数报告菌数；若大于2 ，但不超过5时，以低稀释级的菌落平均数乘以稀释倍数的值报告菌数（见表9.1.1例2 、例3 ) 3)

9、 、当二者比值大于5 ，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证（见表9.1.1 例4 ) 4）、当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数（见表9.1.1 例5 ) 5）、如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于l 时，以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数（见表9.1.1 例6 )表9.1.1细菌数报告规则举例4、结果判断1）、在进行菌落汁数时，应仔细观察。勿漏计细小的、琼脂内和平皿边缘生长的菌落，同时应注意细菌菌落与供试品中颗粒、沉淀物、气泡等的鉴别。

10、必要时用放大镜或低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。如仍难区别，可延长培养时间57天，细菌菌落常会生长增大而加以鉴别。2）、如同一稀释度二个平板菌落数超出一倍以上，不应计数，菌落蔓延成片也不应计数。3）、若供试品测定。其菌数结果超过标准限度规定时，应从同一批样品中随机取样，独立复试两次，以3 次测定结果的平均值结果。根据点计结果和前数报告规则报告菌数，若供试品的细菌数超过规定的限值时，应从同一批样品中随机取样、独立复试两次，以3 次测定结果的平均数报告。5、注意事项l）、在培养中一些生长鞭毛的细菌具有动力，可因培养基湿度过高给动力菌造成泳动的条件，促使一些菌落蔓延生长，干扰细菌计数。可在培

11、养基中加入0.001%TTC抑制菌落蔓延生长或将已凝固的琼脂平板开盖，倒置100级层流下1 2h或置换经干热灭菌的陶瓦盖替代原平皿盖，可降低培养皿内水分，减少菌落蔓延生长。2）、供试液中常会有不溶性颗粒或沉淀物存在，有时很难与菌落区分，必要时可使用放大镜或显微镜进行观察，如仍难区分，可延长培养时间或在未加TTC的营养琼脂培养基平板上加入0.001%TTC510ml，30min后菌落即染成深红色可与其他有形物进行鉴别。3）、供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。4）、在做10倍递增稀释时，每一稀释级应换l 支吸管，吸管插入稀释液内不低于2 . 5cm ,反复冲洗数次，吸液高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管贴于容器内壁吸取1cm。靠近液面管壁（但勿接触液面），缓慢地吹出全部供试液至第二个容器中（第一级稀释液所用吸管勿接触第二级稀释液）。将吸管放入消毒筒内。5）、注皿时培养基应在45以下，用水浴保温效果较好。6）、从供试液制备至倾注培养基，全部操作应在1小时内完成。避免由于时间过长造成人为的污染，细菌繁殖或死亡。稀释液加至培养皿后，长时间末倾注培养基，稀释液边缘干涸，倾注的培养基不能与稀释液混均匀，影响菌落计数。【精品文档】第 3 页