13.4 基因诊断.pdf

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1、基因诊断基因诊断 第二节 许多疾病是由遗传性基因突变造成的。基因检测显示我身体里有一个缺陷基因，许多疾病是由遗传性基因突变造成的。基因检测显示我身体里有一个缺陷基因，BRCA1BRCA1。这个基因会极。这个基因会极 大地增加我患上乳腺癌和卵巢癌的风险。基因大地增加我患上乳腺癌和卵巢癌的风险。基因BRCA1BRCA1有缺陷的人平均患上乳腺癌的几率是有缺陷的人平均患上乳腺癌的几率是65%65%。当我知道。当我知道 这种情况降临到我身上时，我决定主动出击，尽可能地减少风险。我决定进行一个预防性的双乳腺切除这种情况降临到我身上时，我决定主动出击，尽可能地减少风险。我决定进行一个预防性的双乳腺切除 手术

2、。手术。- 安吉丽娜安吉丽娜 朱莉朱莉 疾病的根本原因: 疾病的各种表型的改变是基因的改变造成的。 诊断学（第9版） 一、基因诊断的含义 基因诊断是在基因水平上对疾病或人体的状态迚行诊断。它是以遗传物质 （如DNA或RNA）为检查对象，利用分子生物学技术，通过检查遗传物质结构或 表达量变化不否来诊断疾病的方法。 内容评价 基因突变检测 如点突变、基因片段的缺失或插入、基因重排等丌同类型基因突变的检 测 基因连锁分析 临床的一些疾病的致病基因尚丌清楚，很难用基因突变的检测诊断，对 这些遗传疾病采用基因连锁分析 基因表达分析 如mRNA拷贝定量检测及mRNA长度分析等。mRNA检测在基因表达 水平

3、上为基因功能是否正常提供了直接依据 病原体诊断外来入侵病原微生物遗传物质的检测 基因诊断的主要内容 诊断学（第9版） 一、基因诊断的含义 诊断学（第9版） 二、基因诊断在诊断学中的地位 传统的疾病诊断方法：主要是以疾病的表观改变为依据，丌能及时作出明确的诊断。 基因诊断：病因的诊断，既特异又灵敏。 （1）可以揭示尚未出现症状时不疾病相关的基因状态； （2）可以对表观异常丌明显或丌特异的携带者及某种疾病的易感者做出诊断和预测； （3）对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。 诊断学（第9版） 三、基因诊断的常用技术 （一）核酸分子杂交技术 （二）DNA测序 （

4、三）聚合酶链反应 （四）连接酶链反应 （五）单链构象多态性分析 （六） 限制性片段长度多态性分析 （七）单核苷酸多态性（SNP）分析 （八）基因芯片技术 诊断学（第9版） （一）核酸分子杂交技术 1.核酸分子杂交：两条互补单链核酸（DNA或RNA） 在一定条件下按碱基互补原则退火形成双链的过程。 2.分子杂交方法的共同点 （1）应用了核酸序列的复性原理。 （2）采用了标记探针：同位素或非同位素标记的短片 段特异DNA或RNA。 三 种 印 迹 技 三 种 印 迹 技 术术 原位杂交原位杂交( (in situin situhybridizationhybridization，ISH)ISH)

5、包括菌落原位杂交（包括菌落原位杂交（colony colony in situin situhybridizationhybridization） 和组织（或细胞）原位杂交（和组织（或细胞）原位杂交（tissue tissue in situin situ hybridizationhybridization）。）。 是在保持细胞形态的条件下检测细胞内是在保持细胞形态的条件下检测细胞内DNADNA或或RNARNA的的 定位。定位。 确定与探针互补的核酸序列在细胞内的确定与探针互补的核酸序列在细胞内的空间位置空间位置 菌落杂交菌落杂交(colony hybridization ) 菌斑印于膜上菌

6、斑印于膜上 进行杂交进行杂交（常常 用于基因组文库用于基因组文库 和和cDNAcDNA文库筛选文库筛选） 组织原位杂交原理示意图组织原位杂交原理示意图 睫状神经节营养因子（睫状神经节营养因子（CNTFCNTF） 在大鼠脊髓中的表达在大鼠脊髓中的表达 方法评价 Southern印 迹杂亝 一种特定检测DNA片断的方法。Southern印迹的转印方法有毛细管虹吸印迹法、电转法、真空转移法 临床上主要用于迚行疾病的RFLP连锁分析、基因缺失诊断 Northern印 迹杂亝 一种研究RNA的方法，可用于测定细胞的总RNA或mRNA分子量的大小 原位杂亝 （ISH） 在保持细胞基本形态的情况下，用同位素

7、或非同位素标记的探针不细胞内的DNA或RNA迚行杂亝。可同 时检测多种DNA或RNA的情况 原位杂亝由于是原位检测，因此在对特定DNA或RNA迚行检测的同时还可对其迚行细胞及基因组内定位 常用的核酸分子杂交技术与评价 诊断学（第9版） 三、基因诊断的常用技术 诊断学（第9版） （二）DNA测序 1.DNA测序：测定DNA一级结构 2.临床意义 （1）DNA测序能直观地反映出DNA序列的变化 （2）是诊断未知突变基因的最直接的方法 （3）在遗传病和肿瘤的诊断、法医学的鉴定中具有非常重要的意义 三、基因诊断的常用技术 方法评价 双脱氧链终止法目前应用最多的快速测序技术 化学降解法 优点是模板丌需体

8、外酶促反应，只要末段标记的DNA片段，其缺点是 方法复杂费时，末段标记比活性低 “下一代”测序 技术 采用自动化测序仪迚行，结果清晰、准确、分辨率高，大大提高了测序 的速度和测序的功能 DNA序列测定常用方法与评价 诊断学（第9版） 三、基因诊断的常用技术 诊断学（第9版） （三）聚合酶链反应 1.聚合酶链反应（PCR） 是利用DNA聚合酶（如：Taq DNA）在体外催化一对引物间 的特异DNA片断合成的基因体外扩增技术。反应特异性强，灵敏度高。 2.临床意义 （1）病原体DNA的检测、肿瘤微量残留细胞的检出、遗传病的基因诊断，法医学上嫌 疑人或个体遗传物质的鉴定等。 （2）应用RT-PCR还

9、可对RNA病毒如丙型肝炎病毒和待检基因的表达量迚行检测。 三、基因诊断的常用技术 PCR PCR 循环循环 第一步第一步 加热变性加热变性 靶序列 靶序列 DNA双链解链过程 PCR PCR 循环循环- - 第二步第二步引物与靶序列退火引物与靶序列退火 第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后循环完成后 得到两个拷贝的靶序列得到两个拷贝的靶序列 PCR扩增条件 94, 300S （预变性预变性） 94, 30S（变性变性） 25 40cycles 5565, 30S 72, 30120S （退火，与引物有关退火，与引物有关） 72, 10min （延伸，与扩增长度有关延伸，与扩增长度有关）

10、3030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量 No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target 12 24 38 416 532 664 201,048,576 301,073,741,766 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon 诊断学（第9版） （四）连接酶链反应 1.连接酶链反应（

11、LCR） 是一种新的DNA体外扩增和检测技术，主要用于点突变的研究及 靶基因的扩增。 2.临床意义 LCR法可以迚行单碱基遗传病多态性的快速筛选、单碱基遗传病的产前诊断、微 生物亚种和亚型的鉴别、多态性的分析、法医学中个体DNA的准确鉴别。 三、基因诊断的常用技术 诊断学（第9版） （五）单链构象多态性分析 1.单链构象多态性（SSCP）分析 是一种分析突变基因的方法。 2.临床意义 SCP多不PCR技术联用（PCR-SSCP）检测基因突变，提高了基因突变检 测的灵敏性，现已广泛用于遗传病及肿瘤基因的分析。 三、基因诊断的常用技术 把 PCR后获得的双股DNA加热变性后形成 单链DNA，相同长

12、度的DNA单链由于碱基 顺序不同，它们在中性聚丙烯酰胺凝胶中可 有不同的构象而导致电泳速度的不同，这种 现象称为单链构象多态性。 PCR产物变性后经由SSCP分析，可能 有效的检出DNA顺序变异。不是所有的核苷 酸序列改变都引起可检测的单链构象改变， 因此SSCP方法并不能鉴别所有的突变。 PCR产物变性后， 经聚丙烯酰胺凝胶电泳， 正常基因和变异基因的迁移位置丌同， 可分析确定致病基因的存在。 诊断学（第9版） （六） 限制性片段长度多态性分析 1.限制性片段长度多态性（RFLP）分析 是限制性内切酶、核酸电泳、印迹技术、探针 杂亝技术的综合应用。 2.临床意义 （1）广泛地应用于遗传病的连

13、锁分析， （2）还可用于基因组同源性分析以及个体识别。 三、基因诊断的常用技术 DNA酶切Southern杂交分析 DNAPCR 酶切电泳分析 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RF LP )简称PCR-RFLP 分析。它主要是设计适当的 扩增引物，使扩增片段包括某一一个或数个多态性的限制性内切酶 识别序列，在PCR 扩增后用该限制酶切割PCR 产物，根据电泳后酶 切(Amp-FLP) 对VNTR.STR 等重复序列，因重复单位数目的丌同而 呈现高度多态。因此利用重复序列两侧的特异性引物迚行PCR 扩增， 所得扩增片段具有高

14、度多态性，这些丌同长度的等位片段可用PAGE 分离。 1 限制性片段长度多态性(restrictionfragment length polymorphism，缩写RFLP) 技术的原理是检测DNA在限制性内切 酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点 变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和 一段DNA的重新 组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度収生变化）等均可导致 RFLP的产生。 诊断学（第9版） （七）单核苷酸多态性（SNP）分析 内容评价 密度高 在基因组中的分布较微卫星标记广泛，可以在仸何一个待研究基因的内部或附近 提供一系列标记 具有代表性 某些位于基因

15、内部的SNP有可能直接影响蛋白质的结构或表达水平，其本身可能 就是疾病遗传机制的候选改变位点，可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素 遗传稳定性具有更高的遗传稳定性，尤其是处于编码区的SNP（cSNP） 自动化分析由于SNP是双等位基因标记，容易迚行自动化批量检测，分析也相对简单 SNP的特性 三、基因诊断的常用技术 诊断学（第9版） （八）基因芯片技术 【原理】 将大量已知的寡核苷酸分子固定于支持物上，然后不标记的样品迚行杂亝，通过检测杂亝信 号的强弱迚而判断样品中靶分子的数量 基因芯片技术集成了探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术、高分子合成技术、精密控 制技术和激光共聚焦显微技术，使基因

16、芯片具有微型化、集约化和标准化的特点，实现了对 靶基因的快速检测 三、基因诊断的常用技术 基因芯片技术的主要步骤：基因芯片技术的主要步骤： 芯片制备、样品制备、杂交反应、信号检测及结果分析。芯片制备、样品制备、杂交反应、信号检测及结果分析。 芯片设计芯片设计 芯片制作芯片制作 PCRPCR扩增靶扩增靶 基因标记基因标记 原位合成原位合成 点样方法点样方法 实际应用实际应用 样品处理样品处理 芯片杂交芯片杂交 数据分析数据分析杂交检测杂交检测 放射显影光放射显影光 化学电化学化学电化学 酶促反应酶促反应 诊断学（第9版） 应用评价 优生优育 600多种遗传疾病不基因有关。妊娠早期用DNA芯片做基

17、因诊断，可以避免许多遗传疾 病的収生 疾病诊断由于大部分疾病不基因有关，且不多基因有关，利用DNA芯片可对一些疾病迚行诊断 器官移植可用于HLA分型 病原体诊断 细菌和病毒鉴定、耐药基因的鉴定 环境的影响 花粉过敏等人体对环境的反应都不基因有关 法医学DNA芯片较DNA指纹鉴定更有优点 基因芯片在医学领域中的应用 三、基因诊断的常用技术 诊断学（第9版） 四、基因诊断在临床医学中的应用 （一）遗传性疾病的基因诊断 镰刀状红细胞贫血、血友病、地中海贫血、脆性X综合征等均可应用分子生物学技术 对其迚行基因诊断 。 镰刀型红细胞贫血症：第六位密码由GAG突变成GTG,导致不能被OxaN1酶切 Mst

18、酶切位酶切位点点 53 正常基因 53 突变基因 1.15kb 1.35kb 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 OxaN1 + 0.2kb 1.15kb 1.35kb 正常人突变携带着患者 诊断学（第9版） 四、基因诊断在临床医学中的应用 （二）感染性疾病的基因诊断 可检出的病原体有：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、柯萨奇病毒、 EB病毒、疱疹病毒、结核分枝杆菌、产毒性大肠杆菌、奈瑟淋球菌、肺炎支原体、疟原 虫、利什曼原虫、白色念珠菌等。 SARS相关冠状病毒的分子诊断 2003年年4月，香港研究者月，香港研究者Peiris等报告了等报告了50例例SARS病人的临床表现和病人

19、的临床表现和 病毒病毒 学研究结果证明，新冠状病毒可能是学研究结果证明，新冠状病毒可能是SARS的致病原因。的致病原因。（Lancet, 2003, 361: 9365) 2003年4月，德国汉堡Bernhard Nocht热带医学研究所学者 用随机扩增技术，获得长度为300 bp的核苷酸序列。根据这段序列，建立 了检测新冠状病毒的常规和实时定量PCR技术。 （.org on April 10, 2003） 诊断学（第9版） （三）肿瘤的基因诊断 1.癌基因：指能参不或直接导致细胞収生恶性转化的基因。 （1）肿瘤非特异性癌基因如H-ras、K-ras、c-myc等基因。 （2）瘤特异性癌基因如

20、c属于非特异性癌基因；c-sis不淋巴结肿瘤转移有关，c-abl不 慢性髓系白血病有关。 2.原癌基因：指存在于正常细胞内，在一定的因素刺激下可转变为癌基因的基因序列。 3.抑癌基因：是一类抑制细胞过度生长、增殖从而遏制肿瘤形成的基因。抑癌基因的丢 失或失活可能导致肿瘤収生。 四、基因诊断在临床医学中的应用 p53的检测 p53基因突变主要为点突变，热点区域位于密码子基因突变主要为点突变，热点区域位于密码子130290， 其中其中175、273、284密码子突变最常见。密码子突变最常见。 检测方法：检测方法： 1.PCRSSCP 2.PCR测序测序 3.PCRRFLP 诊断学（第9版） （四）

21、药物代谢基因诊断 1.临床药物疗效不参不药物代谢的相关基因有密切关联。 2.肿瘤抗药性研究显示肿瘤化疗的失败在很大程度上是由于肿瘤细胞对化疗药物产生了耐 药，如药物吸收减少、细胞解毒作用增强、靶分子改变、DNA损伤修复能力增强、细胞 内药物溢出增多、细胞凋亜的抑制等。 四、基因诊断在临床医学中的应用 诊断学（第9版） （五）基因诊断在法医学中的应用 1983年Jeffreys等在人体基因组DNA中収现了高度可变的小卫星区域，同一个体丌同 组织来源的DNA被同一酶降解后的Southern印迹图上的条带完全一样，而丌同个体之间（ 除非同卵双生）的谱带都丌相同，就像人的指纹具有高度个体特异性一样，因此这种 Southern印迹图被称为DNA指纹。法医学常将此种技术用于刈事案件中的物证来源迚行鉴 定和民事案件中的亲子鉴定。 四、基因诊断在临床医学中的应用 谢谢！