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1、如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流专业英语翻译【精品文档】第 13 页 先进的液相色谱质谱联用的代谢显型专业：药物分析 学号：201413176 姓名：张旭关键词： 全球代谢轮廓 亲和色谱 液相色谱 质谱 代谢显型 代谢物组学 代谢组学 反相液相色谱 超高液相流动相 色谱法 超高液相色谱 摘要：我们回顾目前的分离技术应用于全球代谢轮廓和基于使用液相质谱联用。目前，大多数分离使用反相液相色谱法，不能很好的使用反相模式分离的极性化合物，亲和色谱是一个流行的选择。当超高液相色谱法快速、高效的样品分析的优点被发现后，逐渐代替了传统的高效液相色谱法在代谢方面的应用。我们讨论基于小型化的高效液相分离

2、技术的选择性和新兴的样本轮廓方法，或者运用超临界高效液相和高效液相色谱分离。前言：1、代谢产物使用生物标记来诊断和理解疾病、疾病机制，评价药物安全性和生理学（理解潜在生物化学）的基础研究不是最新的。为了发展代谢显型和利用高通量分析化学发展全球代谢产物轮廓，绝大部分目前在利用这些代谢产物先进的方法就是利用广泛轮廓方法学。此种类型的组学轮廓，通过它们支持者各方面了解作为代谢组学或者代谢物组学。代谢型的大多数目的是提供代谢产物相关浓度改变的信息，结果产生一种确定的生物化学状态以致于检测特殊条件下专属性的生物标记物（单独代谢物更经常为指纹）。理论上，这些标记物也应该提供新的视野在细胞上器官和整体生物体

3、的生物学影响、生理学改变、疾病状态和治疗或毒性诊断。代谢显型的进程，在第一个例子中基于假说和目标（理想的公平）测定方法。这些方法经常提供仅是相关测定并且目的在于尽可能检测和测定样本中的多种成分。目前，全球代谢轮廓使用高通量分析天平实现，例如核磁共振氢谱和质谱。后者可以被用于此轮廓通过直接注入样品或提取液或者结合使用色谱或电泳分离。（例如，气相色谱质谱联用，液相色谱质谱联用，超临界流体质谱联用或者毛细管电泳质谱联用）。作为全球代谢轮廓已经成熟并且成为系统生物学和生物标记的主流技术，一种新的挑战已经出现。然而发表对于流行病学和临床代谢显型综合的代谢物组学分析，就是这些技术包括的一直追求的可负担的、

4、快速、高通量和高容量的方法。在这里，我们借助液相质谱联用技术研究目前代谢显型的状况强调发展液相色谱分离。2、 分离还是不分离？ 在基于质谱分析的基础上，一个减少全部复杂的分析系统的显而易见的方式就是排除分离步骤。质谱的能力就是基于质荷比分离粒子已经导致许多研究者推断这样的结果可能达到快速使用直接介绍的方法（直接注入），并且这种基于质荷比分离微粒是足够的，尤其是当使用高效质谱。并且，确实对于直接注入法有一种情况涉及速度和实现的容易程度（对于一些有趣的应用见例子10-12）。然而，在不知道样本无目标的分析情况下，这种问题有关于离子抑制和增强效应，并且很难区别在区域同分异构体和立体异构体和同素异形体

5、等，限制了这种方法的价值。这种分离的优点对比更加广泛无靶标的代谢显型的直接注入质谱的例子如图一，借助纳米光设备，比较大鼠血浆直接注入获得的光谱数据，这些数据来源于通过液相-质谱联用色谱图显示总结所有的数据。相同的四级杆飞行时间质谱分光仪在正离子电喷雾模式下应用于两个实验。从图一所列举的数据，有一些借助液相-质谱分析的重要的更多的离子检测比纳米喷雾注射是更清晰的。通过检测马尿酸盐和质荷比为297.1的峰在液相分析中两个大部分强度离子选择性检测的直接注入法是很突出显著的方法。 然而液相-质谱联用提供了一个更加广泛的轮廓，提高了生物标记物发现的潜能，一旦生物标记物被发现，它是清晰地可以使用直接注入法

6、扫描。首先使用大气压固相分析探针（第一次描述被Mc.Ewan等人）借助超高液相质谱联用定性，通过分析大鼠和狗胆汁来阐明这种方法。随着和是样品的准备，为了分解目前在胆汁中的微团，这种简单方法可以快速检测许多胆酸和辨别从大鼠和狗中得到的胆汁。已经有相关的例子，一个具体疾病轮廓，然后像这样一种方法，随着广泛轮廓首次实行为了确定显型和简单直接注入方法，对于随后的靶向分析可以提供一种途径来支持高通量扫描在临床试验的一个例子。 逐渐增长的可利用的离子手性分离联合质谱可能改善代谢轮廓，借助包括一种十分快速分离步骤的直接注入方法提供，但仍然不可能去掉直接注入方法的所有的限制。见例子6，在大鼠血浆的初步的结果依

7、旧表明这种方法在液相分离中的应用的优越性。然而，对于许多靶向方法，合适有效的直接注入方法有明显的优势。3、结合方法 HPLC和它的变形技术代表目前主要分析技术用于代谢轮廓。 液相-质谱联用方法可能是快速的并且联合分离质谱提供极佳的，即使底物对于各种不同底物种类和物理化学特性是依赖的和灵敏的。液相-质谱联用可以使用的样品例如尿液、血清或血浆，经常是极小的样品准备或者依靠原始提取物或化学修正的形式根据气相-质谱分析的例子。自从20世纪末期，基于HPLC分析的应用结合电喷雾质谱已经形成了绝大多数文章应用于基于液相的代谢组学或代谢物组学，当超高效液相被引进这个领域在2005年之后，就开始逐渐被替代。

8、液相-质谱应用已经用于反相色谱分离，随着亲和色谱和离子对色谱变得更加流行，由于反相液相色谱监测极性片断代谢物组学的局限性已经是显而易见了的。然而，当分析一个复杂的混合物，一个宽范围的极性分析物，没有一个理想的解决方法，因此，研究者被迫选择最好的方案使最大程度上包含样品中所有组分适于所使用的检测器。出于这个原因，绝大多数代谢显型实验已经使用反相液相色谱或者与亲和色谱或离子对色谱联合使用，描述如以下3.3部分中。 3、1 UPLC-MS 同时在早期的研究中使用LC-MS来分析代谢组学和代谢物组学应用传统的HPLC（确实许多人依旧使用它），一步的改变基于挖掘LC-MS方法的代谢型潜力，发生在引进2m

9、以下粒径的UPLC/UHPLC的方法。这种先进的兼容性的技术与传统的HPLC对比如图2大鼠尿液中成分，借助HPLC和 UPLC分离。正如它显示的特点，UPLC是更加先进的代谢轮廓，结合随之而来提高的分辨率（每个峰分离的更准确），更高的灵敏度和效率，减少了离子抑制。这些特性已经使调查者能够显著的检测到在一样的样品中具有相同分析时间更多分析物的一个传统的HPLC的分离。 应用这种类型轮廓关于生物学问题一个早期例子就是使用UPLC-MS的方法描述尿液轮廓来源于三个家族的Zucker鼠表明家族的差异和一个重要的年龄轨迹如图三。 UPLC应用于代谢显型目前代表性“黄金标准”对于这种类型的分析物和此方法已

10、经变得普通在代谢轮廓共同体的范围内对于研究人类疾病在癌症调查、肥胖、酶诱发的易变性、肝和肾疾病中。Scopus的调查揭示在2009年，UHPLC或者UPLC术语变得同等的与HPLC术语，2013年，它被频繁的使用四次在文章中解决代谢组学和代谢物组学（此调查实行在2014年2月使以上术语在摘要、关键字和标题）。 利用UPLC对于代谢显型增长的可接受程度反映在最近公开的建议的标准方法（因此叫草案），描述了使用反相-超高效液相质谱分析样品，例如尿液、血清或血浆和组织。 一个主要的优点是2m以下的粒度的液相色谱是最佳分离发生在高线速度的流动相伴随着分离行为保持在持续一个宽范围的流速。UPLC宽范围的最

11、佳流速允许高流速被用于产生非常快速分析，可以从一个使用2-min反相梯度分离分析大鼠尿液的研究结果的例子中看出来。分析这种类型产生一种相似水平的显型的辨别一个传统的10minHPLC分离（虽然减少了在大量代谢产物检测的花费比10-min UPLC分析）并且清晰的提供在相同的时间范围的直接注入质谱的高通量分析的潜能，但也有减少离子抑制的优点。同时效率涉及仪器时间，这种类型的快速依旧导致大量溶剂消耗，现在已经逐渐成为一个严重的问题由于溶剂的购买和废液处置的费用，作为样品数量增加结合应用在流行病学和临床研究。溶剂可以被最少的使用借助降低内部柱子的直径，例如1mm，流速范围为150-250L/min，

12、相同线速度达到如传统的内径为2.1mm柱子。这种方法的结果不仅增加了灵敏度和产率而且减少了溶剂的消耗。一个全面比较通过应用窄范围UPLC柱子达到的节约溶剂的文章最近已经发表并且推测出使用窄专控柱子导致减少4倍在溶剂的花费，同时提供增加了2-3.5倍测定灵敏度。同时这些透过粒子产生搞得效率，它们需要更高的柱压比传统的HPLC达到600L/min的流速结合使用2.1mm内径的柱子。一个可选择的方法应用基于非透过的2m以下的固定相，因此称为中心壳，柱子可以产生相似的效率，在这么低的压力下。对于代谢显型研究这一类方法的例子正出现在文献中如例子33 应用高分辨率的UPLC方法，例如以上的描述，结果使液相

13、色谱峰宽在此基础上为要求的1-3s，因此它对质谱检测器产生了一个重大的挑战。为了精确的定义色谱峰，它是必要的产生-12个数据点通过每个色谱峰，导致获得的速率在50ms范围内。然而，对于发展起来的高分辨率的质谱（200,000FWHM）傅里叶变换离子回旋共振质谱要求数据获得时间为1s，对于UPLC变得不切实际，当70F线性离子阱、四级杆离子阱和离子阱质谱被使用时，这个问题才被证实。与之同时，在代谢显型试验中渴望得到的质谱数据时，仪器责任周期问题可能导致这个问题。一种方法被Bateman等人描述来简化这个问题，应用可选择的高和低碰撞能快速获得，高分辨率ToF-MS仪，允许同时收集初级粒子和产物离子

14、数据在一次获得中，这个仪器能够以20-spectra/s获得数据，使它是适合对于高分辨率的液相色谱和已经用于许多代谢轮廓的应用。 3.2 高温UPLC 在LC中，最佳分离使用下的参数就是提高温度。事实上，由于缺少所需要温度的固定相，高温已经不被广泛使用。同时采用2m以下粒径LC导致很大的降低色谱峰宽度35m粒径用于HPLC，进一步改善可以通过高柱温实现。因此，高柱温可以减少流动相黏度允许在低压下操作，并且在分析物洗脱时可以用来降低有机改性剂需要的比例（有时一起被消除）。 HT-LC可以在大量的模式下操作（例如，恒定温度但可以改变流动相组成借助溶剂梯度，或者恒定流动相组成结合一个温度梯度），并且

15、，当如以上描述，对于代谢组学分析所有方法使用的例子已经被阐述。使用提高UPLC柱温或者确实任何包裹柱子的LC分离，产生一个变化在Van Deemter Plot 中，改变最佳分离位置实现一个更高流速，尤其否认任何压力下降的优点，但是此方法被描述通过提高流速伴随着温度梯度以致于达到压力的要求。使用高柱温增加质谱发射效率，并不是线性增加对于所有分子，通过不能同分析物在柱子中迁移，可能导致灵敏度改变，如果需要的话提供其他方面的最佳选择条件。对于尿液中代谢轮廓使用HT-UPLC-MS恒定柱温，第一次在2005年阐明。在这个例子中，柱温为90，流速为900L/min和操作压力为800bar导致峰更大空间

16、分离比700bar溶剂线性梯度的条件下仅在10min。确实，随着分析时间变长(50min)，峰的分离空间容量大于1000也是可能的（如图4）在另一个例子，此时使用溶剂组成恒定（酸化溶液），温度梯度为50-180，用于家族Zucker 鼠尿液中显型的研究（二型糖尿病模型），然而，使用HT-UPLC分析血浆的方法是不成功的，并且它是清楚的洗脱非极性代谢产物，例如脂类，依然要求使用包含流动相的有机试剂，虽然可能在较低浓度下比在低温条件下使用。提高UPLC温度因此可以提供一些有实际价值和经济利益，但仔细选择柱子的学科知识被要求掌握。当并不是所有的柱子都有足够稳定性。根据以上两种方法的要点，恒定温度的模

17、式更易于应用，当许多U(H)PLC仪器配置一个恒温箱。温差梯度与之同时可能更加用途广泛，更加困难的按规章使用（尤其当联合恒定压力通过变化流速来实现效率最大化）和可能要求调查研究在一个更加复杂的柱温箱。一个明显的担忧就是热不稳定化合物和研究者必须清楚的评估对于分解的各个不稳定分析物的潜能在应用于HTs时。3.3 极性代谢物分析LC-MS 正如所讨论的，RPLC限制分离极性分析物，并且，为了实现这样化合物代谢轮廓，其他操作方法不得不被应用。尤其，随着它原始的应用在这个领域，HILIC使用一个极性固定相（有许多新的）和一个更高的有机流动相，例如乙腈（和水改性，作为强的洗脱剂）逐渐被用于极性代谢产物。

18、在这种操作模式下，更加亲脂化合物很难吸附在固定相而很快被洗脱。但更多极性化合物易保留并且仅仅被洗脱当极性水溶液浓度增加时，HILIC有一个突出重要益处超过正相液相色谱，在水相样品有更大的兼容性在流动相中，简化了样品的引入。然而，HILIC有更低的在线容量比RPLC，因此仅能使用小体积注射，降低了测定灵敏度（尽管使用更高极性的有机流动相提高离子化作用可以在一定程度上得到补偿）。HILIC也能显著产生更宽色谱峰比RPLC，导致更低峰容量和峰的分辨率更大程度上依赖质谱。 尽管这些缺点，HILIC 已经发现更多用途用于分析代谢显型样品，例如，尿液。HILIC已经被用于结合MS/MS发展多分析检测被称为

19、靶向代谢轮廓模式。HILIC-MS、MS使用一个氨基化合物的UPLC柱子导致定量检测140极性代谢产物在单一注射酒或水果提取物。比较UPLC型HILIC和RP-UHPLC对于大鼠尿液泌尿轮廓已经展示，表明两种方法都能分离不同显型，但对于那种方法，不必惊讶，这种检测依靠不同的生物标记物。其他的研究尿液中极性代谢物的色谱法，应用HILIC的方法，水相NPLC和RPLC表明对于两性离子，评价HILIC柱子能给出更好的结果，同时一个最近研究也评估一定范围内。相的发现HILIC在DIOL柱子得到最好的效果。另外，应用结合HILIC和RPLC-MS方法已经发展为轮廓更加广泛的脂类和以碳中心的代谢菌的代谢产

20、物和癌细胞和人类血浆。在同样的方法，如T,kindt等。比较HILIC和RPLC对于植物代谢组学。图五表明一个典型HILIC分离尿中的代谢物，分析时间为20min。色谱图表明相关色谱较宽的峰是HILIC的特征。对比于RPLC，但此方法表明良好保留时间重现性（CV=1.7）和一个平均CV为14%达到信号强度超过被200样品分析。 LC-MS分析法使用HILIC-MS分析尿液样本源自在大鼠中半乳糖胺的肝毒性的研究，表明了一个清晰的统计学的不同在模型组和给药组，并且统计学的角度揭示大量尿酸。N-乙酰葡萄胺和tyramin一起极大增加了一定量的2-氧代葡萄糖盐在大鼠中。 然而，同时广泛使用HILIC并

21、不代表对极性化合物是通用的，结果一定范围内，不得不探索其他选择。固定相例如石墨化碳，同时高保留对于极性化合物和提供更有效的分离对于磷酸核糖核苷酸和核糖核酸出现保持一些分析物不可逆（例如丙酮酸盐、乳糖、果糖、1,6-biphosphate)。 二氧化硅-氯化物固定相已经被建议对于极性代谢物，但是，仍然很少它们应用的例子。目前，对于极性、阴离子代谢物大部分广泛应用的方法是IPC，一般使用三丁基胺作为IP试剂，同时大多数发表的例子已经发展为靶向分析例如中心碳代谢物，它们对一般的污染损害系统极性阴离子化合物也有很好的表现并且因此同等适用于非靶向分析。结合这种方法的主要困难就是IP试剂此后阻碍了它是适用

22、于由于离子抑制的正离子电喷雾。改变IP试剂在系统中所有途径是一个问题和时间的消耗(即使成功),事实上，这可能意味着采用IPC将要求提供一个完全LC-MS系统对此方法从这以后。同时离子交换色谱（IELC）代表一个明显的选择性对于已经有的IPC，与之相关很少的对于它的应用的例子在全球代谢轮廓。 同时HILIC、IPC和IELC已经表明提供分析极性化合物的方法，补充这些RPLC的方法，都有限制并且它们并没有代表一个完全的解决对于极性分析物。直到更早的200s甚至Sio2 RPLC限制PH范围为3-7。即将到来的混合Sio2构型固定相已经允许更多的碱性流动相，将被探索PH达到11。对于保留极性碱性组分

23、的高PH流动相的优点第一次被Neue和Mazzeo描述。主要的优点是清晰表明使用一个高PH流动相改变碱性分析物的离子状态，例如胺、中性的物质允许它们使用RP条件保留和分离。对于代谢显型高PH 的LC-MS 方法潜在的优点。最近被Rainville等人调查研究，表明对于高极性组分不仅增加保留时间（使用酸溶剂系统被传统RPLC无效柱子洗脱),而且可以分离特定的异构体，同时被好的保留在酸性基于溶剂RPLC中仍然未被解决，当在一个更低的一面如图六。这些轨迹显示了一个信号峰，m/z为358.269，使用一个酸性流动相，洗脱的保留时间为10.68min，当色谱分离时使用一个碱性流动相，两个明显分析物洗脱时

24、间分别为9.03min和10.72min。同时也不能代表完全的回答极性代谢物，这样高PH 溶剂系统在策略上可能证明是有用的对于特定困难的代谢物轮廓的分析4、1未来技术：使小型化 正在发展起来一种必须达到来自更小的样品高质量的代谢轮廓。这样的改变的先驱者正在增加它的使用例如遗传性改变小鼠模型，允许研究者更大程度上模拟人类疾病比目前为止可能增加了诠释人类疾病发现的自信。然而，这些小鼠模型可能是非常贵的，花费每只动物在每只动物￥1000-5000范围内。因此，出于科学、经济和伦理的原因，研究者义不容辞的达到最大化信息量，同时最小化动物使用。这样做就需要仅仅小的血液样品（2030L）从小动物中得到超过

25、一个或多个研究课题和发展并且应用微量样品技术，或者在玻璃毛细管中或者在合适底物血液凝固点来促进收集这样小体积血液对于这种类型工作。色谱系统小型化能够使它对应减少样品型号并不代表是一个特别的问题，因为它是一个可升级的过程。最近在微型规模LC的发展意味着现在开始看见了它的应用在小分子微粒分析中，例如药物生物分析和代谢物的鉴定用相似与传统规模LC的色谱行为。另外，重大的提高在质谱反应，在一些情况的20倍，已经注释使用这些微量分离方法。应用微量(或纳米级）LC-MS代谢轮廓包括检测极性阳离子代谢物在人类脑脊髓液中，和极性阴离子代谢在HeLa细胞中，小鼠脑提取液、血浆和脑脊髓液。为了改善多电荷组分的峰形

26、，必须添加金属螯合试剂EDTA在流动相中。另外，Kiefer等人已经应用纳米规模IP-RP-HPLC-MS分析细胞提取中阴离子成分。一个例子的结果可能达到这种类型方法学的要求如图七显示来自得到在更低一个病人的胆固醇水平的罗苏伐他汀药浓度的血液凝固点的分析。这个结果得到借助LC-MS方法分析一个20L血液样品的一部分使用一个150m ID微流量LC装置结合一个QToF的质谱在正离子电喷雾模式。从这个分析中它是可能不仅检测药物本身而且描述出提取血液位点脂的轮廓。这个系统已经用于分析大鼠胆汁，展示一个全部良好的精力和稳定的表现在整个分析的1000份样品的流程中没有色谱峰形的变化。（Plum等人没有发

27、表这些观察结果）。这些原始数据暗示微量LC的发展可能已经成熟到一点，可以应用它在一般的代谢轮廓实验室中）。4.2超临界流体色谱 SFC看到一个兴趣的复苏由于这种类型色谱图展现的优点，例如更快速的质谱转换和更短的分析时间比同等的RPLC分离，使它成为基于LC手性分离选择的纲领。这些特征，结合快速溶剂蒸发已经确保它用于组分的分离和提纯。SFC已经更进一步显示它自身是特别的效率在分离脂类、甘油三酸酯和游离多脂肪酸，并且在这个领域内SFC已经得到了有限的数据在代谢组学的应用。然而，SFC没有限制分离酯类和组织提取物。为了阐明方法的兼容性，SFC-MS被用于狗和大鼠胆汁代谢组学的分析。这样的样品被选择，

28、因为它代表一个复杂混合温和极性代谢物、表面活性剂和亲脂组分，并且正在接受来自分离和分析观点的挑战。我们最近运用梯度SFC使用2m以下微粒（CO2改变流动相中的甲醇）分析大鼠和狗胆汁取得了一些成功确实，Bamba 等人最近也描述了一个胆汁酸定量方法使用SFC。色谱图显示如图八阐明一个使用SFC-MS方法分离狗胆汁的例子。结果显示完美的色谱行为和鉴别样品组分的重现性，例如胆汁酸，基于质谱数据和分析标准，它变得显而易见应用SFC并没有限制酯类分析，并且已经表明很多次通过分离各种中等极性、酸性、碱性和其他分析物。伴随可利用的高分辨率的SFC系统，在代谢轮廓领域更多应用是可以预见的。 5、结论 代谢显型

29、的科学正在开始显示真正的价值在解释临床和生物方面的问题。发表信息的能力是可以信赖、精确和适时的方式很大程度依赖分析技术的应用。在过去的10年里，LC-MS在代谢显型中的角色已经戏剧性提高，使它成为分析纲领的主导。在过去的5年期间，已经有重大的进步在色谱科学上，提高了数据质量、密度、灵敏度和通用性在样品提取溶剂中。在不考虑操作模式下，2m以下微粒LC已经成为分离选择纲领（例如HILIC、RPLC或SFC）。改善这些小粒度系统的色谱效率和抑制MS规模兼容性使它们成为代谢组学研究的理想选择。分离更大的峰容量超350在10min内是寻常的，更大的峰容量超过700已经被报道。一起总的提高色谱行为，新型柱子化学已经允许使用更高温度和更高PH流动相来扩展这些分离范围。SFC至少实现了它的承诺，发表了一个高质量分离方法成为有机溶剂注入的通用性的福利。对于未来，SFC和微流量（后者结合小规模样品技术（例如血液凝固点）对于更大的效率代谢显型研究显示更大的承诺。