2022年改善缺铁性贫血功能评价方法技术转让网 .pdf

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1、改善缺铁性贫血功能评价方法实验工程、实验原则及结果判定Items, Principles and Result Assessment 1 实验工程1.1 动物实验1.1.1 体重1.1.2 血红蛋白1.1.3 红细胞比积 /红细胞游离原卟啉1.2 人体试食实验1.2.1 血红蛋白1.2.2 血清铁蛋白1.2.3 红细胞游离原卟啉/红细胞运铁蛋白饱和度2 实验原则2.1 动物实验和人体试食实验所列指标均为必做工程。2.2 针对儿童的人体试食实验，只测血红蛋白和红细胞内游离原卟啉。2.3 在进行人体试食实验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。3 结果判定3.1 动物实验：血红蛋白指标阳性，

2、红细胞游离原卟啉/红细胞压积二项指标一项指标阳性，可判定该受试样品改善缺铁性贫血功能动物实验结果为阳性。3.2 人体试食实验3.2.1 针对改善儿童缺铁性贫血功能的，血红蛋白和红细胞内游离原卟啉二项指标阳性，可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血功能作用。3.2.2 针对改善成人缺铁性贫血功能的，血红蛋白指标阳性，血清铁蛋白、红细胞内游离原卟啉 /血清运铁蛋白饱和度二项指标一项指标阳性，可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血功能作用。改善缺铁性贫血功能检验方法Method for the Assessment of Improving Nutritional Anaemia Function 1.动物

3、实验1.1 原理用低铁饲料喂饲动物可形成实验性缺铁性贫血模型，再给予受试样品，观察其对血液精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 14 页细胞学、血液生化学等指标的影响，可判定该受试样品对改善动物缺铁性贫血的作用。1.2 实验动物健康初断乳大鼠，单一性别，每组大鼠812只。1.3 低铁饲料配方：成分添加量g/kg 玉M淀粉529.5 蛋清蛋白 * 200.0 蔗糖100.0 玉M油（无添加剂）70.0 纤维素50.0 混合矿物盐 (AIN-93G-MX) 35.0 混合维生素 (AIN-93G-VX) 10.0 L-胱氨酸氯化胆

4、碱3.0 2.5 * 亦可使用 EDTA 处理的酪蛋白AIN-93G 混合矿物盐配方矿物质添加量g or mg/kg mix Calcium carbonate anhydrous 357.00 Potassium phosphate monobasic 196.00 Potassium citrate, tripotassiummonohydrate 70.78 Sodium chloride 74.00 Potassium sulfate 46.60 Magnesium oxide 24.00 Zinc carbonate 1.65 Sodium meta-silicater9H2O 1.

5、45 Manganous carbonate 0.63 Cupric carbonate 0.30 Chromium potassium sulfater12H2O 0.275 Boric acid (17.5% B), mg 81.50 Sodium fluoride (45.24% F), mg 63.50 Nickel carbonate (45% Ni), mg 31.80 Lithium chloride (16.38% Li), mg 17.40 Sodium selenate anhydrous(41.79% Se), mg 10.25 AIN-93G混合维生素配方维生素添加量g

6、/kgmix Nicotinic acid 3.000 Ca pantothenate 1.600 Pyridoxine-HCl 0.700 Thiamin-HCl 0.600 Riboflavin 0.600 Folic acid 0.200 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 14 页Biotin 0.020 Vitamin B-12 (cyanocobalamin) (0.1% in mannitol) 2.500 Vitamin E (all-rac-a-tocopheryl acetate)2 (500 IU/g)

7、 15.000 Vitamin A (all-trans-retinyl palmitate)2 (500,000 IU/g) 0.800 Vitamin D-3 (cholecalciferol) (400,000 IU/g) 0.250 Vitamin K-1 (phylloquinone) 0.075 Powdered sucrose 974.655 1.4 剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个低铁对照组，以人体推荐量的5 倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组（硫酸亚铁或乳酸亚铁，剂量为2ppm 或 2mg/(kgbw)，以 Fe元素计）。受试样品给予时间

8、30 天，必要时可延长至45 天。1.5 实验步骤1.5.1 建立缺铁性贫血大鼠模型选用健康断乳大鼠在实验环境下适应35 天后饲予低铁饲料及去离子水（或双蒸水），采用不锈钢笼及食罐，同时，采用剪尾取血法放血，5 天一次，每次0.30.5ml。实验过程中避免铁污染。自第3周开始每周选取部分大鼠采尾血测Hb，如多数动物Hb 低于100g/L 时，测定全部大鼠的体重及Hb。1.5.2 恢复实验选取 Hb100g/L 的大鼠作为实验动物，根据贫血大鼠Hb 水平和体重将其随机分为低铁对照组和三个实验组，各组均继续饲予低铁饲料，低铁对照组给予相应溶剂，实验组分别给予不同剂量的受试样品，受试样品给予时间30

9、 天，必要时可延长至45 天，测定体重及各项血液学指标。1.6 观察指标体重、血红蛋白、红细胞比积/红细胞内游离原卟啉1.6.1 血红蛋白测定（氰化高铁法）消光系数法和标准曲线法任选其一测定血红蛋白。1.6.1.1 吸光系数法1.6.1.1.1 原理血红蛋白（ haemoglobin，Hb）被铁氰化钾氧化后生成高铁血红蛋白，再与氰离子结合形成氰化高铁血红蛋白（红色），氰化高铁血红蛋白（红色）极为稳定，在540nm 波长下，摩尔吸光系数为44000，据此，用分光光度法测其光密度，运用吸光系数作血红蛋白的定量测定。1.6.1.1.2 仪器精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总

10、结 - - - - - - -第 3 页，共 14 页分光光度计。10 微升微量吸管。1.6.1.1.3 试剂称取碳酸氢钠（NaHCO3，AR ）140 毫克、铁氰化钾200 毫克、氰化钾50 毫克，用水溶解并稀释到1000 毫升。贮存於棕色试剂瓶内，在暗处或冰箱（4）保存，至少可稳定数月到 1 年。1.6.1.1.4 实验步骤1.6.1.1.4.1 取试剂 2.5毫升於 5毫升带盖试管中，加入10微升血液，混匀后，放置15分钟。1.6.1.1.4.2 选用 0.5厘M光径比色杯，于540nm波长下，以试剂调零点，将所得样品管之光密度乘以 736，即为血红蛋白浓度（g/L）。计算公式如下：Ct

11、=736644585.044000512540540HiCNDDHiCNCt=待测的血红蛋白（g/L ）浓度。D540HiC N= 氰化高铁血红蛋白在540nm波长下测出的光密度。251= 测定时血液的稀释倍数（血10L 加入试剂 2.5mL中）44000= 氰化高铁血红蛋白的摩尔吸光系数0.5= 比色杯的光径64458= 血红蛋白的分子量1.6.1.1.5 注意事项1.6.1.1.5.1 试剂不要放在聚乙烯瓶内，以免因氰离子与其反应而使试剂作用降低。1.6.1.1.5.2 仪器因摩尔吸光系数法完全依靠仪器的吸光度来计算，故此法要求所用的仪器性能要符合要求（如仪器的波长准确与否，以及灵敏度及线

12、性等），否则将直接影响测定的结果。1.6.1.1.5.3 仪器在使用前最好应以WHO 规定的氰化高铁血红蛋白参考液校正后再使用。参考液最好选用ICSH （国际血液学标准化委员会）确定的由RIV （荷兰国立公共卫生研究院）制作的氰化高铁血红蛋白参考液或上海医学化验所制备的氰化高铁血红蛋白标准液。1.6.1.2 标准曲线法1.6.1.2.1 原理血红蛋白（ hemoglobin ，Hb）在铁氰化钾和氰化钾的作用下生成极为稳定的氰化高铁血红蛋白（红色），其颜色深浅与血红蛋白的含量成正比。用分光光度计在540nm 波长下，测定血红蛋白标准品和参考标准物质的吸光度，制成标准曲线，测得待测样品的吸光度后查

13、标准曲线即可得Hb 的浓度。1.6.1.2.2 仪器10L血色素吸管（或定量毛细管）5mL 或 10mL 带盖试管分光光度计精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 14 页1.6.1.2.3 试剂称取碳酸氢钠（NaHCO3，AR ）140mg、铁氰化钾200mg、氰化钾50mg，用蒸馏水溶解并稀释到1000mL，贮存于棕色试剂瓶内，保存于4冰箱可稳定至1 年。1.6.1.2.4 实验步骤吸取 2.5mL 试剂于 5mL 带盖试管中，用10L血色素吸管（或定量毛细管）取大鼠尾血或静脉血10L放置于已放入试剂的试管中；混匀放置15m

14、in 。选用 0.5cm 光径比色杯，于 540nm 波长下，以试剂调节仪器零点，测定各样品管的吸光度，同时测定血红蛋白标准和参考标准物质的吸光度，绘制血红蛋白的标准曲线。查标准曲线可求得待测样品和参考标准物质的血红蛋白含量(g/L) ，计算参考物质的回收率。1.6.1.2.5 注意事项1.6.1.2.5.1 不要将试剂放在聚乙烯瓶内，以免因氰离子与其反应而使试剂作用降低。1.6.1.2.5.2 不宜直接使用消光系数方法计算血红蛋白的含量，因为仪器的波长准确与否仪器的灵敏度和线性等因素均直接影响测定结果。1.6.1.2.5.3 每次测定时，在不同间隔反复测定血红蛋白标准液和参考标准物质（低、中

15、、高3个浓度）。1.6.1.3 数据处理及结果判定实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F 值， F 值 F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值 F0.05，P 0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。结果判定受试样品组与对照组比较，血红蛋白浓度升高经统计处理差异有显著性，且受试样品组前后升高幅度平均达到10g/L以上，判定该实验结果阳性。1.6.2 红细胞内游离原卟啉测

16、定1.6.2.1 原理血红蛋白的合成过程中，幼红细胞中的原卟啉在血红素合成酶的作用下与铁结合，当铁供应不足时，红细胞内的原卟啉乃以游离形式累积起来超过正常水平。因此，检测红细胞内游离原卟啉（Free erythrocyte proloporphyrin ， FEP）的含量是检查缺铁性红细胞生成的有效方法。血液样品经生理盐水稀释后，分别以乙酸乙酯：乙酸混合液（4:1）和 0.5N盐酸提取分离血中游离原卟啉，在一定波长下测定其原卟啉的荧光强度而定量。1.6.2.2 仪器1.6.2.2.1 荧光分光光度计或930型荧光光度计。1.6.2.2.2 离心机。1.6.2.2.3 混旋器。精选学习资料 -

17、- - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 14 页1.6.2.3 试剂1.6.2.3.1 肝素抗凝剂一支12500单位的肝素以0.9%生理盐水稀释至25mL （ 1mL=500 单位）。1.6.2.3.2 5%（W/V）硅藻土生理盐水悬浊液称取 5g硅藻土加 0.9% 生理盐水至 100mL。1.6.2.3.3 4:1乙酸乙酯和乙酸混合液。1.6.2.3.4 0.5N HCl 。1.6.2.3.5 原卟啉标准液。1.6.2.3.5.1 原卟啉标准贮备液（50mg/L）：称取 5mg原卟啉，加 4mL无水乙醇使之溶解，以1.5N HCl 稀释至 10

18、0mL。1.6.2.3.5.2 原卟啉标准中间液（1.0mg/L）：取 2mL原卟啉贮备液，以乙酸乙酯与乙酸（4:1）混合液稀释到 100mL。1.6.2.3.5.3 原卟啉标准应用液（0.1mg/L）：取 1mL原卟啉中间液，以乙酸乙酯与乙酸（4:1）混合液稀释到 10mL。1.6.2.4 实验步骤试剂样品管空白管标准管肝素（ mL） 0.10 0.10 0.10 全血（ mL） 0.02 水 （mL） 0.02 0.02 5%硅藻土悬浊液（mL ）0.15 0.15 0.15 原卟啉标准应用液（mL） 0.5 乙酸乙酯与乙酸（ 4:1）混合液（ mL） 4 4 3.5 注：按上表依次加入各

19、种试剂，在加入乙酸乙酯与乙酸混合液前，用混旋器混合已加入的混合液，然后边混合边加入乙酸乙酯与乙酸混合液。离心 15分钟，将各管上清液分别倒入10mL比色管中，每管加4mL 0.5N盐酸，振摇 5分钟静止使之分层，将上层溶剂抽出弃去，测定盐酸液的荧光强度（30分钟内比色）。1.6.2.5 荧光测量1.6.2.5.1 若使用日立MPF-4 型荧光分光光度计测定条件为激发波长为403nm，狭缝 10nm；发射波长为 605nm，狭缝为 5nm，液槽为 1cm厚石英槽。1.6.2.5.2 若使用国产 930型荧光光度计测试，条件为激发滤光片420，荧光滤片 550，灵敏度1500，满度开关开至最大，液

20、槽为1cm厚石英槽，检出灵敏度为0.01 g/4mL。在不同量原卟啉（ 0 g，0.01 g，0.03 g，0.05 g，0.07 g，0.1 g）呈线性关系。1.6.2.6 计算样品荧光强度 空白荧光强度 100血中原卟啉含量（ g/L全血） = 标准管原卟啉含量（ g）10标准管荧光强度 空白荧光强度样品取样量(mL)1.6.2.7 数据处理及结果判定实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F 值， F 值 F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值 F0.05，P 0.05，用多个实验组精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结

21、 - - - - - - -第 6 页，共 14 页和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。结果判定受试样品组与对照组比较，红细胞内游离原卟啉降低经统计处理差异有显著性，即可判定该实验结果阳性。1.6.2.8 注意事项1.6.2.8.1 荧光强度随时间延长而逐渐衰退，但30分钟内基本稳定。1.6.2.8.2 加乙酸乙酯 -乙酸混合液时，一定要边混合边加入，否则影响测定结果。1.6.2.9 滤纸法测定：将滴有 20微升血点全部剪下放入试管中

22、，同时取同样大小空白滤纸放入标准管和空白管中，各管均加入5%硅藻土悬浊液 0.2亳升，振荡后放置过夜，以下步骤同直接法。计算： FEP（微克 /100毫升全血） =C/B A/D 100 A=标准管原卟啉含量（0.02毫克） B=标准管荧光强度-空白管荧光强度 C=血样荧光强度-空白管荧光强度 D=取样量1.6.3 红 细 胞 压 积 测 定 ： 使 用 全 自 动 血 细 胞 分 析 仪 进 行 。 数 据 处 理 及 结 果 判 定 同“1.6.2.7”。1.7 数据处理和结果判定实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F 值， F 值 F0.05，结论：

23、各组均数间差异无显著性；F 值 F0.05，P 0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。结果判定受试样品组与低铁对照组相比，若血红蛋白差异有显著性，且其前后平均升高幅度达到10g/L 以上，同时，受试样品红细胞内游离原卟啉或红细胞压积与低铁对照组相比差异有显著性，可判定该受试样品改善缺铁性贫血功能动物实验结果阳性。1.8 注意事项本项实验关键在于贫血模型的建立。低铁饲料含铁量最好控制在9mg/Kg 以下，所用试剂应为

24、分析纯，动物饮用水应为去离子水或双蒸水，采用不锈钢笼具，所用器皿应用10%硝酸溶液处理。实验过程中严防外来铁的污染及彼此交叉污染。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 14 页2 人体试食实验2.1 受试者纳入标准受试者为小细胞低色素贫血，且有明确的缺铁原因和临床表现的成人和儿童。2.1.1成人纳入标准：男性 Hb80g/L 130g/L ，女性 Hb80g/L 120g/L 。2.1.2儿童纳入标准：6岁儿童 Hb70g/L 110g/L；718岁青少年 80g/L 120g/L 。2.2 受试者排除标准2.2.1合并有心、

25、脑血管、肝、肾、消化道等严重疾病及精神病患者。2.2.2过敏体质或对该受试样品过敏者。2.2.3 严重贫血患者。2.2.4短期内服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者。2.2.5 未按标准服用受试样品、资料不全影响功效或安全性判断者。2.3 实验设计及分组要求采用自身和组间两种对照设计。按受试者的血红蛋白水平随机分为试食组和对照组，尽可能考虑影响结果的主要因素如性别、年龄、经济状况等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。每组受试者不少于50 例。2.4 受试样品的剂量和使用方法试食组按推荐服用方法、服用量服用受试产品，对照组可服用安慰剂或采用空白对照，也可服用具有同样作用的阳性物。受试

26、样品给予时间30 天，必要时可延长至120 天。实验期间不改变原来的饮食习惯，正常饮食。2.5 观察指标2.5.1 安全性指标2.5.1.1 一般状况（包括精神、睡眠、饮食、大小便、血压等）2.5.1.2 血、尿、便常规检查2.5.1.3 肝、肾功能检查（儿童受试者不测定此项）2.5.1.4 腹部 B超、胸透、心电图检查（各项指标在实验前检查一次，儿童受试者不测此项）2.5.2 膳食调查于实验开始前、结束前进行三天的询问法膳食调查，观察饮食因素对实验结果的影响。2.5.3 症状观察精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 14 页

27、食欲不振、乏力、烦燥、头晕、眼花、精神不集中、心慌、气短等。2.5.4 功效性指标儿童观察指标：血红蛋白、红细胞内游离原卟啉成人观察指标：血红蛋白、血清铁蛋白、血清运铁蛋白饱和度/红细胞内游离原卟啉2.5.4.1 血红蛋白：见 1.6.1。2.5.4.2 血清铁蛋白测定（放射免疫法）：2.5.4.2.1原理人血清中的铁蛋白（SF）与加入的125I 标记的 SF竞争性地与抗铁蛋白抗体结合。用第二抗体分离结合部分，分别测定总放射性与沉淀物放射性计数。依据标准SF试剂作出标准曲线，从而可在曲线上查出相应样品血清的SF浓度。*SF+Ab *SFAb+*SF + SF SFAb + SF *SF：标记的

28、铁蛋白 SF：未标记的铁蛋白 Ab：抗铁蛋白抗体2.5.4.2.2 仪器离心机、-射线计数仪。2.5.4.2.3 试剂125I血清铁蛋白放射免疫分析试剂盒.。2.5.4.2.4 操作步骤2.5.4.2.4.1 操作步骤：铁蛋白测定操作程序和试剂用量（mL）（见下表）2.5.4.2.4.2 绘制标准曲线以各标准管的B/ B0 %作纵座标，标准铁蛋白浓度为横座标（对数边）作标准曲线。样品或质控由B/ B0 %值从曲线上查到相应的含量。组 别名 称标准曲线组待测管（T）总计数值（NBS）非特异管（B0）零标准管（B）标准管温育液0.2 0.1 铁蛋白标准0.1 待测血样或质控0.1 铁蛋白抗体0.1

29、 0.1 0.1 125I铁蛋白0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 充分摇匀， 37，温育 1.0小时分离试剂0.5 0.5 0.5 0.5 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 14 页充分摇匀，室温15分钟3500转分，离心 15分钟，弃上清液，测沉淀计数2.5.4.2.4.3 结果计算非特异结合率： NBS （%） =）本底（）本底（cpmT(cpm)cpm)(cpmNBS 100% 零管结合率：B0 / T（%） =）本底（）（cpmT(cpm)cpm)(B0NBScpm 100% 标准管（样品、质控）结合率：BB

30、0 （%） =）（）（cpmB0(cpm)cpm)(BNBSNBScpm 100% 2.5.4.2.4.4 注意事项本实验为抗原抗体结合反应，操作时要注意防止可引起抗原、抗体失活的因素（如高温、冰冻等）。测定时，要防止液体溅出，以免造成同位素污染，使本底值增高。离心后，抽去上清液时勿将平铺在管底的免疫复合物吸起，否则测定结果不准确。非特异管、零管是为鉴定试剂是否符合规定而设立的。血清铁蛋白浓度也可用酶联免疫吸附法测定。具体测定方法按相应试剂盒说明书进行。2.5.4.3 血清运铁蛋白饱和度测定2.5.4.3.1 原理血清中加入过量的铁，使血清中的运铁蛋白全部与铁结合，达到饱和，过剩的铁用碳酸镁吸

31、附除去，然后按测血清铁的方法，测定总结合的铁量，即为总铁结和力。从中可计算出未饱和铁量及血清运铁蛋白饱和度。2.5.4.3.2 血清铁测定血清铁（ S1）是指存在于血清中与血清运铁蛋白结合的铁，它以高铁的形式附着在血清pl 球 蛋 白 的 转 递 蛋 白 上 ， 成 人 正 常 值 为50 184 g/100mL 。 缺 铁 性 贫 血 时 常 低 于50 g/100mL，当血红蛋白浓度降低不明显时，血清铁已减少，被认为是早期缺铁性贫血诊断依据之一。2.5.4.3.2.1 铬天青 B 铵盐比色法铬天青B 铵盐作为显色剂测血清铁，比过去多采用的联吡啶等作为显色剂有较高的灵敏度，其克分子吸光系数在

32、630nm 波长下为1.68105 L mol-1cm-1。可大大减少样品血清量，方法简便，准确。2.5.4.3.2.1.1 原理 Fe3 Fe2与铬天青B（CAB ）和十六烷基三甲基溴化铵（CTMA ）反应，形成三元胶囊状络合物使试剂颜色加深，其颜色加深程度与血清铁含量成正比，在pH 为 4.65.5，波长为 630nm 时，有最大吸收峰，利用柠檬酸船为铁的掩蔽剂，样品为自身空白，不需除蛋精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页，共 14 页白，即可测出血清铁的含量。2.5.4.3.2.1.2 试剂2.5.4.3.2.1.2.1

33、缓冲溶液pH4.75，取 25g 无水醋酸钠，110g 氯化钠， 8mL 冰醋酸，用蒸馏水定容 1000mL。用酸度计测pH 应为 4.75。2.5.4.3.2.1.2.2 显色剂2.5.4.3.2.1.2.2.1 0.1铬天青B铵盐溶液（ A 液）：取0.1g 铬天青 B 铵盐，定容于l00mL蒸馏水中，放在棕色瓶中可在室温下保存1 个月。2.5.4.3.2.1.2.2.2 0.3十六烷基三甲基溴化铵（B 液）：取十六烷基三甲基溴化铵0.3g，用蒸馏水定容至100mL 。2.5.4.3.2.1.2.2.3 显色剂应用液：取90mL B 液， 60mL A 液，小心混匀，用缓冲溶液定容至100

34、0mL，放在棕色瓶内可保存1 个月。2.5.4.3.2.1.2.3 掩 蔽 剂 ： 称17.0g柠 檬 酸 （ C6H8O7 H2O ） ， 35.0g柠 檬 酸 钠（Na3C6H5O7H2O），约加50mL 蒸馏水加热助溶，冷却后定容至l00mL 。2.5.4.3.2.1.2.4 铁标准液2.5.4.3.2.1.2.4.1 贮备液： 3mmol L，取 1.176g 硫酸亚铁铵（6 分子结晶水）至少量蒸馏水中，加 50mL 浓硝酸混匀反应10 分钟，用蒸馏水定容至1000mL。2.5.4.3.2.1.2.4.2 工作液： 30 mol L，取 10mL 贮备液，用蒸馏水定容至1000mL。2

35、.5.4.3.2.1.3 方法按下表加入各种试剂。样品管标准管空白 1空白 2空白 3血清（ mL ）0.1 0.1 Fe标（ 30 molL）0.1 蒸馏水（ mL ）0.1 0.1 显色剂应用液（mL）3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 隐蔽剂（ mL ）0.1 0.1 混匀，放置20分钟，在721 型分光光度计上，波长630nm，以空白管调零点记录光密度。注：样品管和标准管以空白1调 0 点；空白管 2 以空白 3 调 0 点。2.5.4.3.2.1.4 计算样品管光密度空白2 管光密度血清铁浓度（ molL） = 30 标准管光密度样品管光密度空白2 管光密度或 血清铁浓度（ g

36、100mL）= 167.55 标准管光密度2.5.4.3.2.1.5 注意事项2.5.4.3.2.1.5.1 要求所用器皿用2N 盐酸浸泡过夜，试剂纯度为分析纯以上，所用蒸馏水为双蒸水或去离子水。2.5.4.3.2.1.5.2 缓冲液 pH 对结果影响较大，测定时pH 应保证在4.704.80 之间。2.5.4.3.2.1.5.3 严格限制波长的选择（需经校下），血清样品在607609nm 之间有一个杂精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页，共 14 页质吸收峰。2.5.4.3.2.2 原子吸收光谱法用原子吸收光谱法测定生物样品中

37、微量元素的含量具有操作简便、快速、灵敏度较高的优点，故被广泛应用。2.5.4.3.2.2.1 试剂2.5.4.3.2.2.1.1 混合酸消化液： 4 份硝酸， 1 份高氯酸混合即成。2.5.4.3.2.2.1.2 铁标准溶液2.5.4.3.2.2.1.2.1 铁标贮备液：取1.0000g 纯金属铁，用盐酸或硝酸溶解后，用0.1N 盐酸稀释到 1000mL，移入聚乙烯塑料瓶内，存放在4冰箱， 1mL 含 1mg 铁。2.5.4.3.2.2.1.2.2 铁标工作液：取10mL 贮备液，用0.1N 盐酸定容至l00mL ，lmL=l00 g铁。2.5.4.3.2.2.2 操作2.5.4.3.2.2.

38、2.1 样品收集及处理取静脉血2mL 于盛有l0mg 草酸钾的5mL 试管中（于每试管中加入0.2mL5草酸钾，置烘箱中烤干即成），离心（3000 转分） 15 分钟。将分离出的血浆吸入另一带盖小试管中，备用。2.5.4.3.2.2.2.2 消化取 1.0mL 血浆，于100mL 高型烧杯中，约加3mL 混合酸消化液，上盖表皿，放置数小时或过夜，在沙浴电热板上徐徐加热煮沸，在冒白色浓烟激烈作用后溶液呈无色或淡黄色。反应终了，取下烧杯（若酸用量不够，最后可出现溶液变黑现象，此时可再加2mL 混合酸消化液继续消化直至五色）。冷却后用1020mL 去离子水冲洗表皿和杯壁，除去表皿继续加热，直到再度冒

39、白色浓烟，待溶液体积接近蒸干，残留酸量不超过lmL ，取下冷却，用蒸馏水稀释至3mL。2.5.4.3.2.2.2.3 测定吸取 0.0mL ，0.5mL ，1.0mL，2.0mL，3.0mL ， 5.0mL 铁标准应用液，用0.1N 盐酸定容至100mL ，混合，各容量瓶中每mL 分别相当于0 g， 0.5 g，1 g，2 g， 3 g， 5 g铁。将处理后的样液，试剂空白，铁标系列溶液分别导入火焰进行测定，测定条件（Pekin-Elener403 型原子吸收分光光度计）：波长248.3nm；空心阴极灯电流：30mA ，狭缝宽0.2mm，空气流量13.51min，乙炔流量：5.21分。以铁含量

40、对应浓度吸光度绘制标准曲线，根据标准曲线求得样品铁含量。2.5.4.3.2.2.2.4 计算（ A1A2） V X 100 m 式中： X 血浆中铁的含量（ g100mL 血清）。 A1测定用样品液中铁的含量（mgL）。 A2测定空白液中铁的含量（mgL）。 V样品处理液定容总体积（mL）。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页，共 14 页m 血浆取样量（mL ）2.5.4.3.3 总铁结合量测定2.5.4.3.3.1 试剂2.5.4.3.3.1.1 铁标准液2.5.4.3.3.1.1.1 铬天青 B 铵盐法2.5.4.3.3.

41、1.1.1.1 贮备液：（ 3mmol/L ）取 1.176g 硫酸亚铁铵（6 分子结晶水）置蒸馏水中，加 50mL 浓硝酸混匀反应10 分钟，用蒸馏水定容至1000mL。2.5.4.3.3.1.1.1.2 工作液：（ 30 mol/L ）取 10mL 贮备液，用蒸馏水定容至1000mL。2.5.4.3.3.1.1.2 原子吸收分光光度法2.5.4.3.3.1.2.2.1 贮备液：取1.0000g 纯金属铁，用盐酸或硝酸溶解后，用0.1N 盐酸稀释到1000mL，移入聚乙烯塑料瓶内，存放4oC 冰箱， 1mL 含 1mg 铁。2.5.4.3.3.1.2.2.2 工作液：取10mL 贮备液，用0

42、.1N 盐酸定容至100mL ，1mL=100g 铁。2.5.4.3.3.2 轻质碳酸镁（ AR ）（或碱式碳酸镁）其质量应符合要求。2.5.4.3.3.3 实验步骤2.5.4.3.3.3.1 应用铬天青B 铵盐方法测总铁结合量取0.1mL 血清放入尖底离心管，加60 mol/l 铁标准液0.1mL 充分混合，室温放置15 分钟。再加45mg 轻质碳酸镁，放置15分钟，混合34 次。然后以3000 转/分离心58 分钟，取上清液0.1mL 按铬天青B 铵盐比色法测血清铁的步骤进行操作，计算。2.5.4.3.3.3.2 原子吸收分光光度法测总铁结合量取1.0mL 血清，加铁标准液（20 g/mL

43、 ）0.5mL，充分混合，放置15 分钟。加150mg 轻质碳酸镁，充分混匀1 分钟以上，放置30分钟，混合34 次。离心10 分钟，取上清液1mL 按原子吸收分光光度法测血清铁的操作步骤进行消化，测定，计算。2.5.4.3.3.4 计算2.5.4.3.3.4.1 血清总铁结合量可用（mg/100L）表示。2.5.4.3.3.4.2 未饱和铁量 = 血清总铁结合量血清铁。血清铁血清蛋白运铁蛋白饱和度（）= 100 血清总铁结合量2.5.4.3.4 数据处理及结果判定实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F 值， F 值50 ）的资料应用秩和检验。结果判定：改善儿童缺铁性贫血：实验前后自身比较和实验后组间比较，血红蛋白、红细胞内游离原卟啉二项指标差异有显著性；同时，试食组自身前后比较，血红蛋白平均升高幅度10g/L，可判定受试样品具有改善缺铁性贫血功能的作用。改善成人缺铁性贫血：实验前后自身比较和实验后组间比较，血红蛋白指标差异有显著性；同时，试食组自身前后比较，血红蛋白平均升高幅度10g/L，血清铁蛋白、红细胞内游离原卟啉/血清运铁蛋白饱和度二项指标中一项指标阳性，可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血功能。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 14 页，共 14 页