8.5体内方法评价.pdf

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1、体内药物分析方法验证体内药物分析方法验证 内内 容容 体内分析方法的建立体内分析方法的建立 体内分析方法的验证体内分析方法的验证 (一一 ) (二二 ) 体体内药物分析方法类型内药物分析方法类型 气相色谱法；高效液相色谱法气相色谱法；高效液相色谱法 色谱色谱-质谱联用（质谱联用（HPLC-MSn, GC-MS） 具有较高的灵敏度、准确度和准确性，具有较高的灵敏度、准确度和准确性， 可用于大多数小分子药物的检测。可用于大多数小分子药物的检测。 液质联用技术液质联用技术LC-MS与与LC-MS/MS，已，已 经成为体内药物分析检测的首选方法。经成为体内药物分析检测的首选方法。 常用的检测方法常用的

2、检测方法: 1）色谱分析法；）色谱分析法；2）免疫分析法；）免疫分析法；3）生物学方法）生物学方法 放射免疫分析法（放射免疫分析法（RIA） 酶免疫分析法（酶免疫分析法（EIA） 荧光免疫分析法（荧光免疫分析法（FIA） 具有一定的特异性，灵敏度高具有一定的特异性，灵敏度高 多用于蛋白质、多肽等生物大分子多用于蛋白质、多肽等生物大分子 类物质的检测类物质的检测 微生物学方法可用于抗生素类药物微生物学方法可用于抗生素类药物 特异性较差，应用较少特异性较差，应用较少 已逐渐被特异性高的色谱分析法取代已逐渐被特异性高的色谱分析法取代 体体内药物分析方法类型内药物分析方法类型 1. 色谱条件的筛选色谱

3、条件的筛选 取待测物、内标的标准物质，确定最佳分析检测条件取待测物、内标的标准物质，确定最佳分析检测条件 考察项目：色谱柱的型号、流动相组成及其流速、柱温考察项目：色谱柱的型号、流动相组成及其流速、柱温 、进样量、内标物质的浓度及其加入量、进样量、内标物质的浓度及其加入量 目标：待测物及内标有良好的色谱参数；具有适当的保目标：待测物及内标有良好的色谱参数；具有适当的保 留时间以避开内源性物质的干扰；有足够的方法灵敏度留时间以避开内源性物质的干扰；有足够的方法灵敏度 以色谱分析法为例以色谱分析法为例 (二二) 分析方法建立的分析方法建立的一般程序一般程序体体内药物分析方法建立内药物分析方法建立

4、试剂与溶剂试验试剂与溶剂试验：取待测药物的非生物介质溶液（通常取待测药物的非生物介质溶液（通常 为水溶液），按照拟定的分析方法进行试验，要求空白试为水溶液），按照拟定的分析方法进行试验，要求空白试 剂色谱峰如果出现的话，不干扰药物的测定；剂色谱峰如果出现的话，不干扰药物的测定； 生物介质试验生物介质试验：取空白生物介质，如空白血浆，按照拟取空白生物介质，如空白血浆，按照拟 定的分析方法进行试验，要求内源性物质在待测物及内标定的分析方法进行试验，要求内源性物质在待测物及内标 的保留时间处无干扰；的保留时间处无干扰； 质控样品试验：质控样品试验：取空白生物介质，根据实际生物样品中取空白生物介质，根

5、据实际生物样品中 药物的预期浓度范围，加入待测药物的标准物质，制成标药物的预期浓度范围，加入待测药物的标准物质，制成标 准样品和质控样品（准样品和质控样品（quality control，QC），考察各项技），考察各项技 术指标，需要符合要求；术指标，需要符合要求； 体体内药物分析方法建立内药物分析方法建立 标准添加系列待测标准添加系列待测 药物的标准工作液药物的标准工作液 标准样品（标准样品（calibration standard），至少），至少6个浓度个浓度 标准添加，独立配标准添加，独立配 制的待测药物标准制的待测药物标准 工作液，高、中、工作液，高、中、 低三水平低三水平 质控样品（

6、质控样品（Quality control， QC），高、中、低三个浓度），高、中、低三个浓度 空白空白 生物生物 介质介质 空白空白 生物生物 介质介质 代谢产物对待测物、内标物的干扰代谢产物对待测物、内标物的干扰 配伍用药的干扰配伍用药的干扰 进一步验证方法的可行性进一步验证方法的可行性 3. 实际样品实际样品 的测试的测试 体体内药物分析方法建立内药物分析方法建立 实例：实例：HPLC法测定人血浆中泮托拉唑法测定人血浆中泮托拉唑 空白血浆空白血浆 空白血浆空白血浆 +泮托拉唑（泮托拉唑（1） +内标（内标（2） 服药后血浆样品服药后血浆样品 体体内药物分析方法建立内药物分析方法建立 二、分

7、析方法的验证二、分析方法的验证 方法学验证方法学验证（validationvalidation）：保证所建立的分析方：保证所建立的分析方 法的可行性与可靠性法的可行性与可靠性 与常规分析方法的验证相比与常规分析方法的验证相比，体内药物分析验证的体内药物分析验证的 技术指标基本相同技术指标基本相同，但具有特殊性但具有特殊性。 体体内药物分析方法验证内药物分析方法验证 参考资料参考资料 1.中国人民共和国药典中国人民共和国药典2015年版第四部指导原则：年版第四部指导原则： 生物样品定量分析方法验证生物样品定量分析方法验证 2. FDAGuidance for Industry Bioanalyt

8、ical method validation, 2013 3. ICH Guidance for industry Validation of analytical procedures: text and methodology, 2005 体体内药物分析方法验证内药物分析方法验证-指导文件指导文件 特异性特异性 比较标准比较标准 物质与物质与6个个 不同个体的不同个体的 空白生物介空白生物介 质和质和QC样品样品 比较比较QC样样 品和至少品和至少6 个不同个体个不同个体 用药后的实用药后的实 际生物样品际生物样品 临床治疗临床治疗 药物监测时药物监测时 ，还要考虑，还要考虑 患者可能同患

9、者可能同 时服用其他时服用其他 药物的干扰药物的干扰 。 特异性(specificity), 又称专属性或专一性, 是分析 方法排除各类干扰测定待测物的能力； 1.内源性物质内源性物质 2.未知代谢物未知代谢物3.伍用药物伍用药物 4.参比方法参比方法 参比方法结参比方法结 果为横坐标果为横坐标(x), 拟定方法结果拟定方法结果 为纵坐标为纵坐标(y), 最最 小二乘小二乘 法考察法考察 相关性相关性 y=a+bx a恒定干扰恒定干扰 b比例干扰比例干扰 标准曲线标准曲线（standardstandard curvecurve）反映了生物样品中所测定药反映了生物样品中所测定药 物浓度与仪器响应

10、值物浓度与仪器响应值（如如HPLCHPLC峰面积峰面积）的关系的关系 标准曲线通常为线性模式标准曲线通常为线性模式 Response x Response GOODBAD x 标准曲线与范围标准曲线与范围 制备标准样品制备标准样品（standard samples）建立建立 不同浓度的待测药不同浓度的待测药 物的系列标准溶液物的系列标准溶液 空白血浆空白血浆 系列标准含系列标准含 药血浆样品药血浆样品 取空白血浆数份取空白血浆数份，分别加入不同浓度的待测药物的系列标分别加入不同浓度的待测药物的系列标 准溶液准溶液，涡旋混匀涡旋混匀，即得系列浓度的标准样品即得系列浓度的标准样品。至少包含至少包含

11、 6个浓度点个浓度点（不包含零点不包含零点，即空白样品即空白样品） 线性范围应能覆盖全部待测的生物样品浓度范围线性范围应能覆盖全部待测的生物样品浓度范围，不能使不能使 用定量范围外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度用定量范围外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度 (二二) 标准曲线与定量范围标准曲线与定量范围标准曲线与范围标准曲线与范围 (二二) 标准曲线与定量范围标准曲线与定量范围 标准曲线的绘制： 以待测药物的检测响应(如色谱峰面积) 或与内标物质(内标法) 响应的比值为因变量 y，以标准样品中的药物浓度为自变量 x 采用最小二乘法或加权最小二乘法进行线性回归分析采用最小二乘法或加权最小

12、二乘法进行线性回归分析 求得回归方程( yabx )及其相关系数( r ) 0.99(色谱法) 标准曲线各浓度点的回归计算值(x)与标示值(x)之间的偏差 bias=(x-x)/x100%应在可接受的范围之内 最低浓度点的偏差在最低浓度点的偏差在20%以内以内 其余浓度点的偏差在其余浓度点的偏差在15%以内以内 判定标准判定标准 曲线合格曲线合格 标准曲线与范围标准曲线与范围 定量下限（定量下限（LLOQ） 是标准曲线上的最低浓度点是标准曲线上的最低浓度点，表示方法的灵敏度表示方法的灵敏度 LLOQ应能满足测定应能满足测定35个消除半衰期时生物样个消除半衰期时生物样 品中的药物浓度品中的药物浓

13、度，或或Cmax的的1/201/10 测定法：取同一生物介质测定法：取同一生物介质，制备至少制备至少5个独立的标个独立的标 准样品准样品 准确度应在标示浓度的准确度应在标示浓度的80%120%范围内范围内,相对标相对标 准差准差(RSD)应小于应小于20% 精密度(precision ) 在确定的分析条件下，相同生物介质中相同浓度样品的一系 列测量值的分散程度，表示该分析方法的可重复性 通常用QC样品的相对标准差（RSD）表示 包括批内（within-run或intra-batch）精密度、 批间（between-run或inter-batch）精密度 注：分析批（analytical run

14、/batch）-包括未知样品、适当 数目的标准样品和QC样品的完整系列。一天内可以完成几 个分析批，一个分析批也可以持续几天完成，但连续测量不 宜超过3天。 精密度与准确度精密度与准确度 在确定的分析条件下，测得的体内样品浓度与真 实浓度的接近程度 通常用QC样品的实测浓度与标示浓度的相对回收 率 （relative recovery，RR）或相对偏差 （relative error，RE）表示 ）（%100 A M RR ）（）（%100%100 RR A AM RE 其中，为多次测定结果的平均值；A为标准值（制 备时的加入值） M 准确度（accuracy） 精密度与准确度关系精密度与准确

15、度关系 Good Precision Good Accuracy Poor Precision Good Accuracy Good Precision Poor Accuracy Poor Precision Poor Accuracy Gold Standard Silver Standard Off-Base Model Hit or Miss Model 精密度与准确度精密度与准确度 测定法测定法 高（High）、中（Midium）、低（Low） 3个浓度的QC样品同时进行精密度和 准确度考察 每一浓度至少制备并测定5个样品 为获得批间RSD，应在不同天（每天1个分析批）连续制备 与测

16、定，至少有3个分析批，不少于45个样品 限度要求限度要求 准确度（RR）：LLOQ附近，80%120%； 一般应在85%115%范围内 精密度（RSD）：LLOQ附近，不超过 20%； 一般不超过15% 稳定性稳定性 稳定性：短期稳定性、长期稳定性 室温：一般1个工作日内（如1,2,4,8或24h） 冰冻（-20或者-80 ）：至整个分析完成（数星期甚至数月） 冻-融循环：3次，每次冷冻时间应在24h以上； 进样溶液：样品室或者特定温度，一般不超过3个工作日 标准储备液：4 或者-20 ，至整个分析完成 提取回收率（提取回收率（extraction recovery） 指从生物样本介质中回收得

17、到待测物的响应值与标 准物质产生的响应值的比值，以%表示 考察生物样品预处理过程造成的药物的损失程度 样品处理方法的评价重点在于结果的精密与重现样品处理方法的评价重点在于结果的精密与重现; 而非待测物提取的完全与否而非待测物提取的完全与否 提取回收率应一致、精密和可重现。 高、中浓度 的RSD应不大于15%，低浓度的RSD应不大于20%。 测定法测定法 高、中、低3个浓度的QC样品，每一浓度至少5 个样品 另取空白生物介质，照QC样品同法处理后，加 入等量的标准溶液，作为标准对照样品 AT为经萃取后的QC样品的信号强度；AS为未经 萃取的标准对照样品的信号强度 ）（%100 S T A A R 提取回收率（提取回收率（extraction recovery） 分析过程的质量控制分析过程的质量控制 分析方法验证完成分析方法验证完成以后才能进行未知体内样品以后才能进行未知体内样品 的分析的分析。 在分析过程中在分析过程中，推荐由推荐由独立的人员配制不同浓独立的人员配制不同浓 度的度的QC样品样品对分析方法进行质量监控对分析方法进行质量监控。 每个分析批体内样品测定时每个分析批体内样品测定时，应建立新的批标应建立新的批标 准曲线准曲线，并并随行测定高随行测定高、中中、低低3个浓度的个浓度的QC 样品样品。