发育生物学技术ppt课件.ppt

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1、发育生物学相关技术组织学与胚胎学系 肖玲概述 发育生物学是一个多学科的研究领域，它利用一切有关学科的技术方法，也利用它们的研究成果，来研究和解释发育中的问题。例如要了解早期发育时的基因活动，就需要用分子生物学的技术研究受精之前和受精之后以至卵裂时期的RNA，以判断哪些是受精前已有的，哪些是受精后转录的，它们是哪些类型，何时开始、在哪些细胞中转录的；要研究某一结构基因的调节控制，分子遗传学关于原核基因的研究就是不可缺少的基础。 生物学/胚胎学/分子生物学/遗传学科学家追踪到“被复制”基因 推动形态学演化2009.9.8 长期以来，生物学研究一直被一个问题所困扰，那就是进化对基因的修修补补为何没有

2、把生命变得一团糟。一种流行的理论认为，基因组拷贝了一些关键的基因，因此一旦有突变破坏了这些基因，生物体还留有一个备份。研究人员追踪到一种被复制的基因-纤维原细胞生长因子受体1(fgfr1)的基因，在这种基因的作用下能够繁殖出所谓的镜子鱼（镜鲤 ），这些鱼拥有巨大且能够反射光线的鳞片。 发育机制的探索，既可以是分子分子水平的研究，也可以是亚显微或亚显微或细细胞水平的，如果涉及某些细胞器在细胞分化中的变化和作用；或者如果涉及到不同胚层的细胞在形成某一特定结构中的相互作用，就是更高水平的事。或者如果涉及个体的极性或对称等的形成，那就是个体水平的了。不论哪个水平的发育，追究到底都可以从有关基因的调节、

3、激活去探索。有关基因在何时被激活，它基因在何时被激活，它的产物在何时、如何在不同的水平上起作用，导致出现各个水平的产物在何时、如何在不同的水平上起作用，导致出现各个水平的形态发生过程，的形态发生过程，则是发育生物学的重点所在。 研究基因的结构，转录的时刻，转译产物的性质等自然要用分子分子生物学生物学的方法；研究某种超微结构在发育中的变化，就要应用电电子显微镜子显微镜技术；研究某种蛋白的出现，细胞膜受体等可能需要免免疫学疫学技术，如果要离体地研究某种细胞的终末分化，或者不同组织在形成某种构造中的相互作用，就离不开细胞培养或组织培养细胞培养或组织培养的技术，显然，在哪个水平上工作，或者研究什么问题

4、，决定了采用什么技术。 常用的实验材料一些过去在实验胚胎学中较少使用的，但是对研究某些发育生物学问题有利的材料已受到重视。如果蝇，经过遗传学家几十年的努力，对它的性状遗传已经充分了解，而且培育出大量的突变型。果蝇的有些突变型正是了解某一基因在何时起影响，起什么样的影响的理想材料，这是用野生型做材料无法做到的。虽然果蝇体积较小，难以得到足够的量供生化分析，但有可能通过大量培养和发展微量化检测方法克服这一困难。 小鼠是另一种常用的材料。因为已经培养出一些突变型，而且它的胚胎在体内发育与人类比较接近。另一种使用范围有扩大趋势的材料是一种自由生活的秀丽隐杆线虫，与人类基因的相似程度高达80%。已经用实

5、验方法得到许多突变型。它们繁殖迅速，可以在短期内培养出大量材料供生化分析和提取之用。 2002年诺贝尔生理学或医学奖获得者悉尼布雷内等三人，他们获奖的原因是在20世纪60年代初期正确选择线虫作为模式生物，发现器官发育和“程序性细胞死亡”过程中的基因规则。布雷内是分子生物学的奠基者之一，他在1965年第一次研究线虫，直到1974年才发表第一篇有关论文，其中经历了长达10年左右默默无闻的基础工作时间。直到20世纪80年代后，线虫研究才逐渐受到国际认可。 线虫成虫体全长只有 0.1 公分，以细菌为食物，在实验室中极易培养。因为全身透明，研究时不需染色，即可在显微镜下看到线虫体内的器官如肠道、生殖腺等

6、；若使用高倍相位差显微镜，还可达到单一细胞的分辨率。 实验胚胎学的传统材料棘皮动物、两栖类、鸟类等，仍然是重要的，只是用来研究的问题不同。例如关于早期发育中基因的活动，用海胆作材料的研究曾经提供大量资料。关于器官发生的分析，细胞分化的分子基础，两栖类和鸟类仍然是重要的材料。一、谱系跟踪 定义：将细胞标记后注入胚胎或体外组织，通过对被标记细胞的跟踪可以获得胚胎形成过程中细胞或组织变异的最直接信息，若在某一特定组织发生之前对细胞谱系特异性基因表达进行比较，则可鉴别出细胞谱系的父代组织。一、谱系跟踪 1.细胞谱系（cell line）和系统谱系（genealogical pedigrees）的跟踪只

7、需将偶联了非扩散高分子葡聚糖的荧光染料注射创立者细胞，使之被标记即可。最近，创立者细胞已采用导入报告基因（通过逆转录病毒、DNA注射或电脉冲转移等）来标记。设计精美的报告基因在有丝分裂时可忠实地复制从而不致在细胞分裂过程中被稀释。细菌的基因lacZ就是很好的报告基因。与一种真核启动区相连接，注射后即能使它在受体细胞中表达。-半乳糖苷酶基因的转录和转译可通过-半乳糖苷酶催化产生一种蓝色染料而查出。 2.荧光素酶（natural luciferase） 天然的荧光素酶（natural luciferase）由萤火虫等许多发光生物的共生菌产生。荧光素酶催化一种一般称作“荧光素”的底物的，由此而发光。

8、当荧光素与ATP加入到可渗透的细胞或细胞提取物中时，由光电倍增管测出的闪光即表示有荧光素酶存在于表达该基因的受体细胞中。 3.绿荧光蛋白质（green fluorescent protein） GFP的的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白 GFP, 后经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色荧光 。3.绿荧光蛋白质（green fluor

9、escent protein） GFP与水母及其它腔肠动物绿色的生物发光有关。GFP含有一种修饰过的氨基酸（Leu-Tyr-Gly）所组成的载色中心。当GFP基因表达时，GFP中的载色中心即自发形成。由于有该载色中心，甚至在活细胞中心，用普通的荧光显微镜以标准的长波紫外光源就很容易地测出该基因的产物。将外源基因与将外源基因与GFP DNA 相连相连,构成融合基因，再将这种融合基因置于一常用的启动区控制之下，由这种融合基因所编码的多功能的相应蛋白质的表达则通过GFP这部分产生的强荧光反映出来，因此GFP可作为外源基因的报告基因实时可作为外源基因的报告基因实时监测外源基因的表达监测外源基因的表达.

10、 Baby mice fathered by mice receiving a donation of spermatogonial stem cells from mice expressing green fluorescent protein. Only half the baby mice show the green color. This is because each spermatogonial stem cell has only one copy of the gene for green fluorescent protein. When the spermatogoni

11、al cell divides, only half the cells that result from it have the gene for green fluorescent protein. GFP主要应用主要应用: 对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界刺激因子的作用下的时空表达中或外界刺激因子的作用下的时空表达, 如某种转录因子如某种转录因子的核转位、蛋白激酶的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。的膜转位等。 GFP基因与分泌蛋白基因连接

12、后转染细胞基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察可动态观察 该分泌蛋白分泌到细胞外的过程该分泌蛋白分泌到细胞外的过程 GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显就能显 示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构及病理过程的结构及病理过程 可用于观察分子的运动（可用于观察分子的运动（FRAP） 蛋白之间的相互作用（蛋白之间的相互作用（FRET）二、诱变与“基因敲除小鼠” 基因敲除：指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平设计实验，将该基因去除，或用其他序列相近基因取代，然后

13、从整体观察实验动物，推测该基因相应功能的方法。二、诱变与“基因敲除小鼠” 要对特定基因的功能和意义作追踪踪迹，有效的手段是设法将该基因完全地剔除（功能丧失的突变），或者通过引入计划好的突变以精巧的方式影响它的功能。在某些模式生物中引入转座子（如果蝇某些品系的P元件），或者，通过导入侧翼接上取自转座子或逆转录病毒介导插入的序列的外源基因，很容易产生随机突变（插入诱变）。但这种方法无法按所设想改变某一特定的靶基因，受影响的还可能是别的基因。如果导入的DNA序列与所涉基因有相同源的的部分且带有所要的突变，定点诱变可能得以实现。有时，宿主原有的基因会被所导入的基因取代。由于这类事件只在罕见的情况下发生

14、（有些单倍体真菌，尤其是酵母，这种情况却很平常），因此，两个同源染色体中通常只有一个带有该种突变。虽然如此，研究人员还是找到方法来获得两个等位基因均有同样突变的小鼠。 培养的胚胎干（ES）细胞，通过定点诱变使特定的基因失活，可用来产生出标准的“基因敲除小鼠”（Box 2）。然后将这种ES细胞注射到小鼠胚胎中，它们则有可能发育成小鼠的各种类型细胞包括生殖细胞。然后将这种动物进行配种，其生殖细胞卵子与精子是来源于该ES细胞的动物，则将会把该突变基因传到其后代。经过常规的回交，则可获得纯合型突变。 基因敲除小鼠 是指运用DNA同源重组原理，迫使所导入的外源基因与小鼠基因组中特定的内源基因（目的基因或

15、靶基因）发生同源重组（这种重组现象又称为定点整合或基因打靶），而获得的内源目的基因缺失或功能丧失的转基因小鼠。 培育基因剔除小鼠的关键技术是ES细胞基因组操作，设法使外源基因能够定点整合到ES细胞基因组中。人们已设计出能够使外源基因定点整合的几种正-负选择（positive -negative selection，PNS）系统。 positive-negative selection，PNS系统 最常用的PNS系统是由Mansaur等于1988年设计的。这套系统的基本策略是首先构建一个导向载体，其中含有一段与内源的靶基因（以X代表）同源的DNA序列，该同源序列内的一个外显子中插有新霉素抗性基因

16、（neo），以用作正选择的标志，在该同源序列附近还插有疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk），以用作负选择标志。HSV-tk基因本身没有启动子，但可接受neo基因的启动子的调节。以一定的方法（如显微注射、电穿孔等）将构建的导向载体导入ES细胞，继续体外培养并以药物G418和GANG作双重选择。如果所导入的导向载体DNA与ES细胞基因组DNA之间发生的是非同源重组，则导向载体整个地随机插入ES细胞基因组DNA中，其基因型为X、neo、HSV-tk。此时，neo基因和HSV-tk基因同时表达，其中neo基因的产物使ES细胞具有G418抗性，但HSV-tk基因的产物可使GANG转变为一种有毒的物质，使

17、ES细胞死亡。然而，如果发生的是同源重组，则外源的neo基因便可一并整合到ES细胞的靶基因X座位上，而HSV-tk基因就丢失了。此时，仅有neo基因表达，其产物可使ES细胞具有G418抗性而存活下来。条件性基因敲除法条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。它实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。 利用CreLoxP 和来自酵母的FLPfrt 系统可以研究特定组织器官或特定

18、细胞中靶基因灭活所导致的表型。通过常规基因打靶在基因组基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过将“loxP floxed”小鼠与Cre 转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。在“loxP floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一样。但当它与Cre 转基因转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“lo

19、xP floxed”靶基因和Cre 基因。Cre 基因表达产生的Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP 间发生切除反应，结果将一个loxP 和靶基因切除。这样，靶基因的修饰(切除)是以Cre 的表达为前提的。Cre 的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。所以只要控制Cre 的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度。 基因敲除的应用与缺陷基因敲除技术的应用及前景：建立生物模型。基因敲除技术常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，

20、从而进行相关的研究。 .疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗。通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响。这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。.提供廉价的异种移植器官。如：PPL Therapeutics 公司于1999 年已成功地在猪的体细胞中用基因敲除技术敲除了1，3GT 基因。使每只猪都缺乏产生a半乳糖基转移酶的基因的个拷贝。这些酶在细胞表面产生一种糖分子，人体的免疫系统可以立即辨认出这种糖分子为异源性，从而引发超急性免疫排斥反应。在缺乏这种酶的情况下，超急性排斥反应即不会再发生。. 免疫学中的应用。如果将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基

21、因，那么将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。改造生物、培育新的生物品种。基因敲除技术为定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。基因敲除技术的缺陷基因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因包括： 许多基因在功能上是冗余的， 敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同样的功能 对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死性，也就无法对这些必需基因进行相应的研究了。基因敲除的应用与缺陷三、转基因技术 转基因动物（transgenic animal）是指染色体基因组中整合有外源基因并能表达和稳定遗

22、传的一类动物。1974年，Jaenish和Mintz应用显微注射法，在世界上首次成功地获得了SV40 DNA转基因小鼠。1980年，Gordon等人首先育成带有人胸苷激酶基因的转基因小鼠。尤其是1982年Palmiter等人将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中，获得比普通小鼠生长速度快24倍，体形大一倍的转基因“硕鼠”后，转基因动物技术轰动了整个生命科学界。随后的十几年里，转基因动物技术飞速发展，转基因兔、转基因猪、转基因牛、转基因鸡、转基因鱼等陆续育成。转基因动物技术已广泛应用于生物学、医学、药学、畜牧学等研究领域， 转基因动物 动物个体如何具备一个外来的（如人的）基因？为查明某个基

23、因的功能及它与遗传性疾病的关系而设计了这类实验。如果医学所关心的是在于此，大多数探索性研究可以用小鼠来进行。方法类似于引入突变。借助与逆转录病毒或诸如显微注射的物理方法，可以将某一工程基因构件装进小鼠的ES细胞中。这种构件往往含有介导插入的序列和另外一个对某种抗生素提供抗性的基因。这有助于对转染成功的ES细胞进行鉴定。随后，将筛选出的ES细胞引入到胚泡中（Box 2）。若此类细胞参与生殖细胞的形成，转基因的卵子或精子就可加利用，通过子代的自交，则会获得异合型或纯合型转基因的动物。 根据目的基因导入的方法与对象不同，培育转基因动物的主要方法有基因显微注射法、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法、精

24、子载体导入法等。 基因显微注射法 孕马血清促性腺激素（PMSG）人绒毛膜促性腺激素（HCG）阳性Founder小鼠（首建鼠） PMSG （1）目的基因的制备与纯化 目的基因可以来源于：通过限制性内切酶预先分离的某一基因。逆转录法得到的cDNA。人工合成的DNA片段。聚合酶链式反应（PCR）扩增的特定基因片段。目的基因的克隆可以通过载体方式进行，通常选择质粒作为载体。将目的基因与质粒结合形成重组因子，然后转化至大肠杆菌，扩增质粒，再分离纯化重组质粒DNA，用适当的限制性内切酶消化，制备成线状基因片段备用。目的基因的克隆也可以通过来实现。 （2）卵供体母鼠和假孕母鼠的准备 定期准备相当数量的卵供体

25、母鼠和假孕母鼠以及一批相对稳定的正常公鼠与结扎公鼠。 （3）超排卵与取卵 选择46周龄母鼠，注射孕马血清促性腺激素（PMSG）后，隔4248h再注射人绒毛膜促性腺激素（HCG），注射HCG后1013h剖腹取卵，用培养液保存，置CO2培养箱备用。（4）基因显微注射 用专门的持卵管和注射针，在显微注射仪上操作，将纯化的目的基因（DNA）注射到受精卵的雄性原核内（雄性原核较雌性原核大）。 Figure 10.2. Preparation of an injection needle. (a) The finely drawn-out capillary is bent using fine forc

26、eps to identify the point of flexure. (b) The forceps are used to very gently break the capillary at an angle atapproximately the point of flexure. (c) Magnified view of needle tip, showing the angled break. This needlehas an inside diameter of approximately 20 microns.Figure 10.3. Testing and use o

27、f an injection needle. (a) Injection of dye solution beneath the surface of a drop of mineral oil, illustrating consistent injection volumes. (b) Injection needle contacting a one-cell embryo at approximately a right angle and depressing the surface. (c) Once the needle has penetrated, the embryo an

28、d vitelline membrane revert to their normal shape.（5）受精卵移植 转基因受精卵在单细胞至桑椹胚阶段移植到受孕后0.5d的假孕母鼠的输卵管，在囊胚期则移植到受孕后2.5d的假孕母鼠子宫。每只假孕母鼠移植2030个转基因卵为宜。 （6）目的基因的表达整合鉴定和检测 从假孕母鼠产下的幼鼠尾尖提取DNA，用PCR、Southern bolt(DNA印迹)、FISH(荧光原位杂交)等方法在染色体及基因水平上进行整合鉴定，并通过Northern blot(RNA印迹)和Western blot（蛋白质印迹）等方法在转录及蛋白质水平上进行表达检测。经检测获

29、得阳性Founder小鼠（首建鼠）。 （7）建系 将阳性Founder小鼠与同一品系的正常小鼠交配，检测F1代仔鼠的阳性率，当繁殖到阳性率为50%左右时，即基本上可以判断出外源目的基因为单一位点的整合。经扩大繁殖，从中选择外源目的基因表达效果好、适应性好的转基因小鼠进行近亲繁殖。然后从子代中选择理想的纯合子个体进行全同胞兄妹交配，建立遗传基因小鼠近交系。 逆转录病毒感染法 逆转录病毒具有高效感染和在宿主细胞DNA上高度整合的特性。因此，利用逆转录病毒作为目的基因载体，通过感染早期胚胎细胞实现基因转移，产生嵌合体动物(chimeric animal)，再经过杂交、筛选即可获得转基因动物。下面介绍

30、其中几项关键步骤。 （1）逆转录病毒载体的构建 常以禽类和鼠类的逆转录病毒为载体。其构建步骤包括：提取病毒未整合的环状DNA。将环状DNA克隆到适当的载体中。选择适当的酶将病毒结构蛋白编码区切除，如构建可复制型载体，则切除其他部分非结构蛋白基因，如致癌基因等。将外源目的基因克隆到载体中。转染细胞，测定外源基因的表达。 （2）包装细胞 又称辅助细胞，它能为逆转录病毒载体提供包装蛋白，对逆转录病毒载体功能的发挥起着重要的作用，决定着重组病毒效价及其宿主范围。在哺乳动物，最常用的包装细胞是-2细胞株，在其染色体内整合的是剔除了位点的Moloney小鼠白血病毒的缺陷型基因组。 （3）重组逆转录病毒感染

31、早期胚胎 载体转染包装细胞后，在载体中序列的作用下，将载体DNA转录的RNA和包装细胞表达的病毒蛋白包装成具有感染性的重组颗粒。这时就可以收集病毒颗粒，用于转染早期胚胎，或者将胚胎直接加入辅助细胞培养物中共培养进行转染。经逆转录病毒载体培育的转基因动物主要是小鼠和家禽。小鼠的转染方法如下：小鼠在交配后48h处死，取输卵管，用胚胎培养液冲出8细胞胚胎。将胚胎置专门溶液中去除透明带，再用胚胎培养液洗净。用专门溶液冲洗已转染重组病毒载体的辅助细胞，与无透明带的胚胎共培养24h转染目的基因。将转染目的基因的胚胎，经手术移植到交配后2.5d假孕母鼠子宫内。产生的仔鼠经筛选、杂交获得转基因小鼠。胚胎干细胞

32、介导法 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细胞团分离出来的，能在体外培养一种高度未分化的多发育潜能的细胞。它与早期胚胎聚集，或被注射到胚胎后，能参与宿主胚胎的发育，形成包括生殖细胞在内的所有组织；它也可以在体外进行人工培养、扩增，以克隆形式保存，因此，将外源目的基因导入ES细胞，再移入胚泡期的宿主胚胎，最后将宿主胚胎移植到假孕母鼠子宫内，便可获得由胚胎干细胞介导的转基因动物。以小鼠为例，大致过程如下：分离培养ES细胞。从确认受精后3.5d 母鼠采取胚胎，胚胎培养46d后，分离出内细胞团。然后经胰蛋白酶处理，从中分离出ES细胞，并克隆ES细胞。ES细胞基因操

33、作。首先构建特定的外源目的基因载体，再通过电穿孔、显微注射、磷酸钙-DNA共沉淀、逆转录病毒感染等方法，将外源目的基因导入ES细胞。获取囊胚期胚胎，以作为ES细胞的移植受体。通过显微操作将ES细胞注射到囊胚期胚胎的囊胚腔内，形成嵌合体。将注射过ES细胞的胚胎，移植到交配后3d的假孕母鼠子宫内，培育出转基因小鼠。 精子载体导入法 1989年，Arezzo发现同源性和异源性大分子能够穿透活的海星精子，用吸附有pSRVCAT或 pSV2CAT的精子受精后，pSRVCAT或 pSV2CAT质粒整合到卵内，并发现CAT质粒NDA基因在胚胎内获得表达。同年，Lavitrano等利用鼠附睾内的精子进行试验，

34、观察到相同的结果，并以30%的频率得到转基因鼠。从此发展了以精子为载体的转基因动物培育技术。这一方法的独特步骤包括：外源目的基因导入精子。可通过DNA与精子共育法、电穿孔导入法、脂质体转染法等方法实现。被导入外源目的基因的精子与卵子受精。方法有人工授精、壶腹部手术授精、体外授精等。 转基因动物培育的新方法 通过体细胞核移植技术培育转基因动物 1997年，英国PPL公司的Scknieke与Roslin研究所的Wilmut等联手，首次建立这一技术，并获得3只人凝血因子IX基因和新霉素抗性基因的转基因克隆绵羊，取名为“波莉(Polly)”。 转基因动物培育的新方法 通过将逆转录病毒载体注射MII期卵

35、母细胞培育转基因动物 其技术要点是：受精前用显微注射方法将克隆有外源目的基因的逆转录病毒载体注射入处于减数分裂中期（MII）的卵母细胞。这一方法由Anthony等首先报道。他们用此方法获得了4头乙型肝炎表面抗原基因的转基因牛。 通过精子头与外源DNA合并注射卵母细胞培育转基因动物 即首先将精子与外源目的基因共孵育，然后将精子头部注射入MII期卵母细胞内。经人工破损精子膜效果更佳。 四、原位杂交技术 原位杂交技术现已较多地应用于胚胎发育研究。常见的是胚胎组织切片的原位杂交和整胚原位杂交（whole mount in situ hybridization，WISH)，它们不同于一般的在载片上对细胞

36、和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，尤其是整胚原位杂交，能通过较好地保存组织中的RNA，观察胚胎整体在不同发育时期的基因表达情况，从而对在发育过程中表达的基因进行较精确的三维定位，结果定位较直观。 原位杂交应用于胚胎组织的技术原理与方法和一般原位杂交大体相同，但值得指出的是，对较大的胚胎标本而言，探针和抗体很难穿透整个组织或胚胎，可以先切成小的胚胎组织块、厚片或薄片，然后进行固定、杂交。 胚胎的采集与固定胚胎的采集与固定 1. 用水合氯醛麻醉孕鼠，尾静脉注射3分钟后杀死老鼠，从子宫取出胎鼠 2. 将胎鼠放在冰浴PBS 中，洗涤2次。 3. 4C 4多聚甲醛/PB 固定过夜 4. 0.1M

37、PBS/0.1% Tween 20(PBST)洗涤2x10min 5. 梯度甲醇（25，50，75，100）脱水 6. 胚胎在100甲醇中20C保存备用。 杂交前处理杂交前处理 1. 梯度甲醇/PBST（100，75，50，25）至水。PBST洗涤10 min2 2. 3% H2O2/PBST 30min，PBST洗涤10min2 3. 20g/ml 蛋白酶K 37C 20 min 4. 0.1M Glycin/PBST洗涤10 min2，PBST洗涤10min2 5. 4多聚甲醛/PB 固定10min 6. PBST洗涤10min 杂交杂交 1. 预杂交液（50% formamide, 5

38、SSC, 50 g/ml yeast RNA, 50 g/ml heparin, and 0.2% Tween 20）与PBST 1:1配制37C 20 min 2. 预杂交液37 C 1 hr 3. 将地高辛标记探针加入预杂交液，杂交16-18hr 4. 梯度预杂交液/PBST（4:1, 3:2, 2:3, 1:4）洗涤，10 min/次 5. PBST洗涤10 min2 杂交后洗涤与显色杂交后洗涤与显色 1. TNB封闭1 hr 2. 用TNB 溶液1:100 稀释的 Anti-Digoxigenin-POD，4C 孵育过夜 3. TNT Buffer洗涤 10 min3 4. 用试剂盒自

39、带稀释液Amplification Reagent稀释信号放大试剂Biotinyl Tyamid（Biotinyl Tyramid贮存液：Biotinyl Tyramid溶解于0.2ml DMSO，Biotinyl Tyramid 工作液：1x稀释液，1:50稀释Biotinyl Tyramid贮存液）,室温20 min 5. TNT Buffer洗涤 10 min3 6. 用TNB 溶液1:100 稀释的SA-AP（链霉卵白素-碱性磷酸酶），室温1 hr 7. TNT Buffer洗涤 10 min3 。NTMT (100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5,

40、50 mM MgCl2, and 1% Tween 20)洗涤 10 min3 8. NBT/BCIP溶液（4.5l/ml NBT 和 3.5l/ml BCIP溶于 NTMT）避光显色 1 hrs。 NTMT洗涤 10 min3终止显色 9. 70甘油中保存 反义探针杂交的10.5 dpc胚胎在脑、脊神经管、生殖脊、心包、肢芽及颌弓部位呈现清晰的杂交信号(图3, A), 而正义探针杂交的胚胎无阳性信号(图3, B); 反义探针杂交的13.5 DPC胚胎在端脑、中脑、延髓、脊髓、肢芽部位呈现清晰的杂交信号(图3, C), 而正义探针杂交的胚胎无阳性信号(图3, D)。 A：小鼠10.5 dpc胚

41、胎ER反义RNA探针的杂交结果：RE(菱脑), MA(颌弓), PC(心包),SNT(脊神经管), GR(生殖脊), LB(肢芽); B：小鼠10.5 dpc胚胎ERb 正义RNA探针的杂交结果; C: 13.5 dpc胚胎ERb 反义RNA探针的杂交结果:TE(端脑), ME(中脑), MO(延髓), SC(脊髓), LB(肢芽)：D：小鼠13.5 dpc胚胎ERb 正义RNA探针的杂交结果。五、RNAi 双链RNA（dsRNA）对基因表达的阻断作用被称为RNA干预（RNA interference，RNAi）。 1995 年，康奈尔大学的 Su Guo 博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试

42、验中发现，反义RNA（antisense RNA和正义RNA（sense RNA）都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。 直到1998年，Andrew Fire的研究证明，在正义RNA阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA 。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。于是提出了RNAi这个词。 2002年，Zernicka - Coetz等用双链RNA注射小鼠受精卵和着床前的胚胎，结果发现导入的双链RNA可以特异性的抑制C-mos ， E-cadherin和GFP基因的表达。Judy Lieberman 和 Premlata Shankar首先向公众宣布了在动物中利用RN

43、Ai技术治疗疾病的研究进展。 同样在2002年，科学家研究了酵母和四膜虫两种生物体的RNAi现象，他们发现RNAi对染色体的形状有着极大的控制作用。RNAi能永久性关闭或删除一部分DNA，而不只是简单地使DNA暂时沉默。 2004年，Tomoko和他的同事们发现一种小dsRNA能够作用于神经基因的表达，并且能在转录水平上直接诱导神经干细胞向神经细胞分化。这种RNA在基因转录水平上直接参与调控，它被命名为smRNA 。 双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP（以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶，RNA-directed RNA polymera

44、se）的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Argonaute2是目前唯一已知的参与复合物形成的蛋白。此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，使mRNA被RNA酶裂解 。 另一方面结合的产物以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链

45、RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。siRNA还能够通过某种不太明了的机制永久地关闭或者删除DNA片断，以在非常大的程度上控制染色质的形成，而不是仅仅暂时地抑制它们的活动。问 题 在siRNA与RNAi的研究中，仍有许多的问题：蛋白是如何与siRNA组合在一起的，如何成为活性形式？对靶RNA的剪切作用，其相关的分子机制如何，是需要特异的蛋白来剪切靶RNA，还是引导的siRNA本身即有剪切作用等。哺乳动物与人的RNAi机制是否与简单的真核生物类似，RNAi的进化地位如何等。猜 想1、 疾病治疗：主要的问题还是转运系统的选择，如何找到一种高效而低毒的用

46、于人体的转运载体是摆在所有RNAi应用面前的最大敌人。依靠免疫系统寻找转运载体可能成为途径之一，而免疫系统中本身可能也有RNAi参与。细胞中是否普遍存在RNAi或进行RNAi的潜力呢？细胞的凋亡机制可能也与RNAi有关。病毒的蛋白质复制途径可能有多种，RNAi是否能像人们期待的那么有效？ 2、 如果siRNA可以永久地关闭或者删除DNA片断，而不仅仅是短期的抑制它。那么动物细胞全能性受抑制的程度可能远远高于过去人们所想象的。干细胞的可塑性可能是由于可以产生特异的siRNA或其前体。干细胞通过细胞内的RNAi机制在发育过程中关闭或开放基因的表达，从而指导着细胞的定向分化。其中的siRNA有可能来自DNA的内含子。3、 在研究基因时，可通过短期的抑制干细胞某个基因的表达来得知其功能。