液相色谱串联质谱联用技术-实验指导.doc

《液相色谱串联质谱联用技术-实验指导.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《液相色谱串联质谱联用技术-实验指导.doc（9页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、!-液相色谱串联质谱联用仪检测技术实 验 指 导（2014、2015级）课程内容（一个实验8学时）：（1）AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱 液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用。（2）利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7种农药的残留量。吉林农业大学 农业部参茸质检中心2017.03实验一 AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱 液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用一 .实验目的和意义通过学习液质联用仪的构成和使用方法，及其在定性、定量分析中的应用，培养学生使用液质联用仪进行仪器分析的能力，并培养学生严谨的科学态

2、度、细致的工作作风、实事求是的数据报告和良好的实验习惯（准备充分、操作规范，记录简明，台面整洁、实验有序，良好的环保和公德意识）。培养培养学生的动手能力、理论联系实际的能力、统筹思维能力、创新能力、独立分析解决实际问题的能力、查阅手册资料并运用其数据资料的能力以及归纳总结的能力等。（一）检测仪器 1、 仪器名称 高效液相色谱串联质谱联用仪（简称LC-MS-MS）。型号：4500 QTRAP（美国Applied Biosystems公司）。2、 仪器组成 液相色谱部分：岛津 LC-30A，配有在线脱气机、超高压二元泵、自动进样器； 串联质谱部分： QTRAP4500，配有ESI离子源、串联四级杆

3、/线性离子阱。 3、 主要性能指标 离子化方式：ESI电离 质量范围：（5 1700）amu 分辨率： 6900 质量稳定性：0.1 amu/12h 灵敏度：1pg reserpine, ESI+, MRM扫描（m/z : 609/195），信噪比S/N 120:1 扫描速度：4000 amu/sec 质量准确度： 0.01%（全质量数范围）4、 方法原理 高效液相色谱二元泵将流动相泵人系统并混合，自动进样器将待测样品注入流动相中，随流动相进入色谱柱，由于样品不同组分在色谱柱中保留时间不同，各组分被分开，依次进入离子源。在离子源中，各组分以ESI或APCI方式电离，被加速后进入质量分析器。 4

4、500QTRAP的质量分析器主要由Q1、Q2、Q3三组四级杆串联组成。Q1可将分子离子按质荷比（m/z）大小分开；Q2是碰撞室，可将母离子进一步破碎为碎片离子；Q3具有四级杆和线性离子阱两种功能，作为四级杆时可将分子离子或碎片离子按质荷比大小分开，作为离子阱还可富集离子从而提高检测灵敏度。各组分的不同离子在质量分析器中被破碎、分离，并按质荷比大小依次抵达监测器，经记录即得到按不同质荷比排列的离子质谱图。 4500QTRAP通过串联四级杆/线性离子阱两种不同质谱技术的结合，可以在单次分析中对复杂样本中的单个成分同时进行定性和定量，也可以对多个化合物进行定量分析。整台仪器的控制、数据采集、数据处理

5、、结果输出均由PC计算机Windows操作系统支持下的Analyst软件控制完成。 （二）样品 1、样品要求 本仪器适合分子量在5 1700 amu范围内的有机样品的定性及定量分析。待测样品必须能溶解于水或其它有机溶剂中。若样品或配制的样品溶液发生沉淀、挥发、变质等异常现象时，应重新取样或重新配制溶液。 2、试剂要求 所有的试剂均选用色谱纯级，所用水的电导率应大于18K。流动相必须用0.2m或0.45m滤膜过滤后方可使用。 3、分离条件要求 在液相色谱仪上确定分离条件，使待测组分能完全分离，且该色谱条件中流动相不应含有不挥发性盐，如磷酸盐。 （三）、操作步骤 实施检测操作的人员，必须熟悉该仪器

6、的操作规程，仪器的工作状态、包括检测灵敏度和分辨率，必须满足检测项目的要求。 1、 开机前准备 开机前应检查仪器室内电、气的供应情况及空调机的工作状态是否稳定，检查真空机械泵泵油是否需要更换。只有当UPS工作正常，Gas1/Gas2、Curtain Gas和Exhaust Gas的压力分别稳定在0.35、0.35和0.7 Mpa，环境温度为1030，相对湿度小于70%时才能开机。 2、开机 1) 打开真空机械泵上的电源开关。 2) 真空机械泵继续工作至少15分钟后，打开MS电源主开关。 3) 等真空度达到210-5Torr（绿色指示灯不闪）后，打开PC计算机电源3、仪器调谐 （四）、方法建立1

7、.在Analyst软件Tools菜单中选择ProjectCreate Project。在Project name项下输入新建的Project名称。注意，不要点选窗口中的其他按钮！点击OK，确认新建Project。2.在Analyst软件界面下，双击导航栏内Hardware Configuration。在弹出窗口中选择MassOnly，点击Activate Profile，激活MassOnly（只联接质谱主机）。3.在导航栏内单击Tune and Calibrate，进入调谐模式。点击上方工具条中的T钮。此时，应注意到主机有“扑”声音，表明进入调谐状态。此时右下角质谱状态显示绿色。双击Manua

8、l Tuning，进入质谱参数设置及运行窗口。4.使用1mL玻璃进样针吸取适当标准溶液，置于进样针座上。点击MS Method下拉菜单，选择Syringe Pump Method，设定针泵流速Flow Rate为10L/min。5.点击Start Syringe Pump按钮开针泵进样。6.返回MS Method，选择扫描模式Scan Type为Q1 MS，设定扫描速度Scan Rate为10Da/s，设定扫描范围StartStop设定为50化合物分子量。DP预输入60。7.点击start开始采集数据。运行稳定后，注意观察是否有预期的母离子出现，并控制其响应值在约E4以下。点击stop，选择第

9、一个峰（后面是同位素峰）的平稳段，双击，选中母离子。点击右键，选择Delete Pane。8.设定Scan type为产物离子扫描Product Ion（Ms2），扫描速度200Da/s，选择扫描正/负离子，输入母离子（product of），设定扫描范围startstop为50MW+20，覆盖可能的子离子质量范围，点击compoud标签，设定（DP）60，（CE）5。9.点击start，开始采集数据，注意观察是否有预期的母离子出现。手动调节CE，以5eV为步长，逐渐增加。每次增加后稍作等待，直至目标化合物的子离子清晰看见。选择平稳的一段，双击，选择子离子。10.选择Scan Type为MRM

10、。设定参数表格中的Q1对应的母离子，Q3对应的子离子，time（ms）为50，ID值设为名称 1（定量），名称 2（定性）。11.点击Edit Ramp，在Parameter下选择Collision Energy，点击OK。点击start开始采集数据，记录每个MRM通道的最佳CE电压。在MRM参数设定表中，右键点击。选择Collision Energy CE，调出表格中的CE列，输入每个MRM通道的最佳CE电压值，精确到个位数。重复以上步骤，在Parameter项下选择Declustering Potential，优化并保存DP。完成后选择菜单File/Save保存采样方法，文件名.dam。（

11、五）LCMS方法的建立：1、连接仪器：打开 HPLC质谱电源，将 HPLC系统接上柱子，将6号出口管线与离子源连好。调离子源喷雾针位置到2mm处，双击Hardware Configure，在硬件配置菜单下单击LCMS ( 液相与质谱联用 )，单击Activate profile激活仪器，会听到笛的一声，说明仪器已经连接上。2、确认液质同步：选择项目（之前优化方法的时候已经建立的项目）；双击Build acquisition method新建方法，弹出新建方法模板。在模板左侧点击acquisition method，模板右边显示对应的参数，确认synchronization mode选择LC S

12、ync,表示液质同步。3、设置MRM参数：点击方法模板左侧的MRM, 在模板右侧 Scan Type下选择MRM；在polarity下选择化合物极性：Positive(正离子)、Negative（负离子）；Duration为15min(与液相分离相同的时间)；表格中Q1：母离子分子量，Q3(Da)：子离子分子量，Time（msec）：50，ID栏：化合物名称（离子对名称后空格加1为定量，空格加2为定性），在表格中右键分别单击DP、CE，点击工具栏的OPEN打开之前优化的方法参数，调出DP,CE值，选中整行，Ctrl+c(复制)参数，关闭窗口，再Ctrl+v(粘贴)参数）；最后点击Edit pa

13、rameter设置离子源参数：Source/Gas项用以下推荐值：CUR 35，IS:5500(正离子) 或-4500（负离子），TEM 600，GS1 60，GS270，点击OK。4、设置液相参数：点击模板左边的shimadzu LC system，在右边的pumps栏下，设置stop time （运行时间）为15min， flow流速为1mL/min，A为水相设为95%，B为有机相设为5%（设置时改B，A自动），泵最大压力为50；点击time program设置液相梯度：例咪唑类梯度设置：Time(min)AB-95%5%55%95%105%95%10.195%5%1595%5%接着在右边

14、的Auto sampler栏下，设置清洗时间，在Rinse mode 下选择Before and after(前后都洗)，并设置清洗时间为5s，清洗液用50%甲醇水。最后点击保存按钮,在保存窗口输入该方法的名称。（五）数据处理双击打开Multiquilt，选择项目，点击File下的荧光棒型图标，点击sample，选择需要的标准品和样品数据，点击next，create new method，为方法命名，点击next，选择一个有代表性的样品（一般选择浓度较大的标品数据），设置分组（同一物质定量离子和定性离子设置为一组），并指定内标，next，对每个物质进行积分。设置积分参数：CausianSmot

15、h（平滑）：一般是0，如有毛刺可改成1或2；Expeceted Time（保留时间）:一般不动Expected time范围：一般30s，表示在保留时间15s范围最小峰宽最小峰高背景噪音扣除：可调整目标峰基线以下被积分的面积，比例越高积分越往下，必要时调整。分峰因子：峰有分叉时设置，如有两个分叉，设置为2，峰分叉不能大于2单位：设置单位，勾选Apply units to all可将此单位用于所有化合物点击next，点击finish。在新跳出窗口内将标准品选定，输入浓度。查看各化合物积分是否正常，点击第三个图标查看标准曲线。实验二 利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7种农药的残留量1 实验

16、目的：1.1 让学生了解利用液相色谱质谱联用仪测定食品、农产品中农药残留等有害化合物的分析流程。1.2 利用前2节课所学内容实际处理样品，增强学生实践能力。1.3 进一步加强液相色谱质谱联用仪的操作和数据处理。2 试剂或材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂，水为 GB/T 6682 规定的二级水。2.1 乙腈(C2H3N)：色谱纯。2.2 氯化钠(NaCl)：140 干燥4 h。2.3 氨基固相萃取小柱：500 mg/6 mL(或性能相当的其它固相萃取柱)。2.4 二氯甲烷-甲醇混合液: 二氯甲烷+甲醇（体积比）= 95 + 5。2.5 标准品：见表1。2.6 农药标准溶液配制2.6.1 标准储

17、备溶液分别准确称取一定量（精确至 0.1 mg）农药标准品，用甲醇溶解，逐一配成 1000 mg/L 的单一农药标准储备液，密封贮存在 -18 冰箱中，使用期为 6 个月。表1 9 种农药标准品农药名称纯度（%）多菌灵98吡虫啉98啶虫脒98辛硫磷98阿维菌素98克百威98嘧霉胺982.6.2 混合农药标准溶液分别准确吸取一定体积的 9 种农药标准储备溶液（4.8.1）注入同一容量瓶中，用甲醇稀释至刻度配制成 100 mg/L 的混合标准储备液，-18 冰箱中密封闭光保存，使用期为 3 个月。2.6.3 混合标准工作液吸取一定体积的混合农药标准储备液，用甲醇配制成 0.01mg/L、0.05

18、mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、1.0 mg/L、5.0 mg/L 的 7 种农药混合标准工作液，贮于 4 以下冰箱中，需现用现配。3 仪器设备3.1 电子天平：感量0.01 g；3.2 破壁食物料理机：不低于20000 r/min；3.3 均质机：不低于20000 r/min；3.4 恒温水浴锅； 3.5 旋转蒸发仪；3.6 氮吹仪。4 试验步骤4.1 样品制备4.1.1 鲜人参取不少于 500 g 水果于破壁食物料理机中，以不低于 20000 r/min 的转速将样品制成糊浆状，充分混匀后装入样品密封盒中直接测定或 -18 保存，备用。4.2 样品预处理4.2.1 提取称取

19、25 g 水果样品（水果品种当季待定），精确至 0.01 g，于 100 mL 具塞离心管中，加入 50 mL 乙腈，于匀质机中高速匀质 1 min，过滤至装有7 g氯化钠的比色管中，振荡200下，静止分层，吸取 10 mL 上层有机相于 50 mL 浓缩管中，60 水浴中氮气吹至近干，用 2 mL 二氯甲烷甲醇混合液溶解残渣，待净化。4.2.2 净化氨基柱用 5 mL 二氯甲烷甲醇混合液溶解进行预处理，当溶剂液面达上层筛板表面时，再倒入上述浓缩管中待净化溶液，用浓缩瓶接收，待液面下降至上层筛板表面，用 8 mL二氯甲烷甲醇混合液溶解分2次冲洗浓缩管并洗脱小柱，将浓缩瓶中洗脱液于 40 水浴中

20、旋转浓缩至尽干，氮气吹干后用2.5 mL甲醇和2.5 mL水定容，过0.22 m滤膜待测。 4.3 仪器参考条件4.3.1 液相色谱串联质谱联用仪: Qtrap 4500三重四级杆/离子阱质谱仪(配岛津30A超高效液相色谱仪)，电喷雾离子源,美国AB SCIEX公司。4.3.2 色谱柱：Kinetex XB-C18，2.1 mm 150 mm 2.6m4.3.3 流动相及流速见表14.3.4 色谱柱箱温度：40 4.3.5 进样体积：5.0 L表1 流动相梯度及流速步骤总时间/min流速/（ml/min）0.1%甲酸铵水溶液/（%）甲醇/（%）10.0400901026400208036.14

21、005954840059559400901061140090104.4 质谱条件：4.4.1 扫描方式：正离子扫描，多反应监测MRM；4.4.2 离子源温度（TEM）：550 4.4.3 电离方式：电喷雾 ESI； 4.4.4 电喷雾电压：5500 V；4.4.5 雾化气压力：60 PSI；4.4.6 气帘气压力：30 PSI；4.4.7 辅助加热气压力：70 PSI；4.4.8 标准曲线的绘制分别吸取 1.0 L 0.02 mg/L、0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L 混合标准工作液按照仪器参考条件，由低浓度到高浓度依次进行测定。分别以 9 种农药的质量

22、浓度（mg/L）为横坐标，以 9 种农药的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。4.5 定性分析根据样液中被测物含量情况，选定浓度相近的标准工作溶液，标准工作溶液和待测农药的响应值均在仪器检测的线性范围内。标准工作溶液与样液等体积参差进样测定。 4.6 定量计算试料中 7 种农药的残留量以质量分数 计,数值以毫克每千克(mg/kg)表示,结果保留 3位有效数字，按公式(1)计算： (1)式中:标准曲线校正后所测定该种农药的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；V1提取液中有机溶剂总体积，单位为毫升（mL）；V2吸取出用于检测的提取溶液的体积，单位为毫升（mL）；V3样品溶液定容体积,单位为毫升（mL）；m称取试料的质量，单位为克（g）。1、尊老爱幼是每一个人都应该去做的,让我们大家要从现在做起，从自己做起，从身边的每一件小事做起，做一个尊老爱幼的模范；积极、勇敢地接过先辈们尊老爱幼的接力棒，把祖祖辈辈这一光荣传统，一代一代传下去在这天高云淡、秋风飒爽的季节，让我们共同祝愿天下所有的老人都能幸福、安康，让我们共同祝愿天下所有的少年儿童都能健康、快乐！谢谢大家