木薯直链和支链淀粉分离.doc

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1、.第一章 绪论1.1淀粉淀粉在自然界中广泛分布，常见于高等植物，是碳水化合物存在的主要形式，主要存在于高等植物的根、茎、叶、果实、花粉中。淀粉是多糖的一种，是通过光合作用把CO2和H2O以葡萄糖的形式固定下来在经过聚合等反应形成以淀粉形式。因为这种储存能量的功能，这些淀粉亦被称为储藏性多糖。淀粉（分子式为（C6H10O5)n，严格分子式为C6H12O6(C6H10O5)n）的基本组成单位是葡萄糖（C6H12O6)（见图1-1），由D- 葡萄糖经-1,4 糖甙键和-1,6 糖甙键组成，分子链中有还原尾端和非还原尾端。分子量一般为8003000DP。1940年，瑞士K.H.Meyer和T.Scho

2、ch发现淀粉是由两种不同的淀粉分子：直链淀粉和支链淀粉。此外，现在的研究发现，在许多淀粉颗粒中还存在第三种成分1。 图1-1 淀粉分子简式Fig 1-1 Simple starch molecules1.2木薯淀粉木薯属亚热带或热带薯类农作物，国内主要产于广东、广西、海南岛，福建部分地区；国外泰国、越南等东南亚国家和地区，巴西、委内瑞拉等南美国家和地区，尼日利亚等非洲国家。木薯作为一种富含淀粉的块根作物，与马铃薯、红薯并列为世界三大薯类作物，目前全世界有70多个国家种植木薯。我国种植木薯的省份有广西、海南、广东、福建和云南等省区，其中广西是我国种植木薯的最大省份，种植面积和产量均占全国的60%

3、以上2。木薯收获后，其块根主要用于制造木薯淀粉。木薯淀粉不是单一物质，而是由直链淀粉和支链淀粉构成的混合物3。木薯淀粉中直链和支链淀粉含量因木薯品种不同及种植地区不同而有所差别，决定着木薯淀粉的品质，并影响着木薯淀粉的贮藏与加工，所以，以木薯淀粉为原料，研究其直链淀粉和支链淀粉的分离方法具有广阔的应用前景。1.2.1支链淀粉支链淀粉的分子量比直链淀粉的大, 分子量在10100万范围内, 相当于分子中由6006000个葡萄糖单元构成。支链淀粉分子中葡萄糖单元有由a-1,4 糖苷键连成的链, 还有由1.6 糖苷键连接成的分支, 分支上又有由1,6糖苷键连接成的分支, 形如树枝状。分子中小分支的数目

4、在50个以上, 每一个小分支平均约含有2030 个葡萄糖单元。小分支中的这2030个葡萄糖单元也通过分子内氢键的相互作用卷曲成螺旋形的构象（见图1-2）部分原淀粉的支链淀粉含量如表1-1所示。支链淀粉以分支端的葡萄糖链平行排列, 彼此以氢链缔合成束状, 形成微晶束结构。所以支链淀粉中结晶区域小, 晶体结构不太紧密, 淀粉颗粒大。支链淀粉的分子大, 各支链的空间阻碍作用使分子间的作用力减小。而且由于支链的作用, 使水分子容易进人支链淀粉的微晶束内, 阻碍了支链淀粉分子的凝聚, 使支链淀粉不易凝沉4。表1-1 部分原淀粉的支链淀粉含量Table 1-1 Part of the amylopecti

5、n content of native starch淀粉来源支链淀粉含量/%淀粉来源支链淀粉含量/%玉米 73糯米100糯玉米100小麦73高直链玉米30 马铃薯80高粱73木薯83蜡质高粱100甘薯82稻米81图1-2 支链淀粉的分子结构Fig 1-2 The molecular structure of amylopectin1.2.2直链淀粉一般的研究认为直链淀粉是一种线形多聚物，都是由 -D-葡萄糖经过-D-1，4 糖苷键连接而成的链状分子（见图1-3），呈右手螺旋结构（见图1-4），每六个葡萄糖单位组成螺旋的每一个结局，在螺旋内部只含有氢原子，羟基位于螺旋外侧。现在研究证明，除了直链

6、淀粉（线形）分子之外，还有一种在长链上带有非常有限的分枝的分子，分支点是-D-1，6糖苷键连接，平均每180320葡萄糖单位有一个之间，分支点-D-1，6糖苷键占总糖苷键的0.3%0.5%.含支链的直链淀粉分子中的支链有的很长，有的很短，但是支点隔开很远，因此它的物理性质基本上和直链淀粉分子相同。直链淀粉没有一定的大小，不同来源的直链淀粉含量差别很大，见表1-2。未经降解的直链淀粉非常庞大，其DP为几千。不同种类的DP差别很大1。直链淀粉和支链淀粉的分离在这些年来引起了较多的关注，但取得的成功却是很少。在之，用凝沉法探究谷物淀粉样品的研究表明：直链淀粉的沉降系数约为410 s，支链淀粉的沉降系

7、数约为100400 s 。同时也表明了淀粉组成的沉降系数与浓度是紧密相关的5。直链淀粉的颗粒小，分子链与分子链间的缔合程度较大，形成的微晶束晶体结构紧密，结晶区域较大。直链淀粉由于分子排列较规整，分子容易相互靠拢重新排列。所以在冷的水溶液中,直链淀粉有很强的凝聚沉淀性能。工业上正是利用直链淀粉与支链淀粉的凝沉性的差异, 将直链淀粉与支链淀粉分离4。表1-2 各种粮食淀粉中直链淀粉的含量Table 1-1 The amylose content of variety starch 淀粉种类含量/%淀粉种类含量/%大米17小麦24糯米0燕麦24玉米（普通种）26豌豆（光滑）30甜玉米70豌豆（皱皮

8、）75糯玉米（蜡质种）0甘薯20高粱27马铃薯22糯高粱0木薯17图1-3 直链淀粉的分子结构Fig 1-3 Molecular structure of amylose 图1-4 支链淀粉的螺旋结构Fig 1-4 The spiral structure of amylose 1.3国内外研究现状和发展动态淀粉主要是由直链淀粉和支链淀粉组成，因为两者的分子结构、分子构型状态各有不同，所以使得不同来源的淀粉有各自的应用表现。已有研究表明，淀粉中二者的比例和含量对淀粉的产品储存、加工、物化特性研究等有着直接或者间接的影响。同时，直链淀粉和支链淀粉本身也有着不同的性能和用途。1.3.1直链淀粉的国

9、内外研究现状和发展动态由于直链淀粉具有近似纤维的性能，所以，工业上直链淀粉的用途较多。直链淀粉具有良好的成模性、质构调整、凝胶性及促进营养素吸收等功能，比如高直链淀粉食品是糖尿病患者理想食品,国外许多营养研究机构进行许多实验,证实直链淀粉功能作用。另外，直链淀粉还是胆结石及高血压病人理想食品,具有防止胆结石形成及降低胆固醇作用。直链淀粉与人体内其它营养元素吸收也相互影响,尤其是一些重要微量元素,如Zn、Fe、Ca、P等。试验结果表明,饲喂直链淀粉配方和支链淀粉配方食谱710天，饲喂直链淀粉配方的小猪肠道内Fe、Ca吸收率均比饲喂支链淀粉配方的高；Zn、P吸收率差异统计上不显著,即所用试验群体(

10、12头小猪)Zn、P吸收率不受淀粉种类影响6。直链淀粉具有凝结成块、易形成结构稳定凝胶物性,可作为强韧食品包装薄膜，这种薄膜对氧和油脂有良好隔绝性,又因涂布展开性好,故适于作为产品保护层。其乙酸衍生物又可作为纺织纤维,还用于浆纱、纤维上光及作为胶粘剂、包扎材料等。此外,利用其粘合无毒、水溶性,还用于药剂、绷带、缝合线等医疗品中7。直链淀粉能制成强度高、柔软性好的纤维和薄膜，而支链淀粉不能。目前,利用直链淀粉作为塑料增量剂和某些类型塑料完全代用品是可行的。美国用直链淀粉制成一种名为“Ecofoam”新型包装充填物,类似于聚苯乙烯泡沫塑料“塑料花生”,体轻而松软,广泛用于包装工业。因其成分95%

11、是直链淀粉,能在很短时间内分解，因此，可解决聚苯乙烯对环境污染问题6。表1-3 直链淀粉及衍生物的应用Table 1-3 Application of amylose and its derivatives品名应用特性食品包装无毒、不透油、薄膜普通包装与覆盖层不透气、耐水、可食药品及糖果类包装生物可降解性面包改善质量、抗陈化性食品添加剂糕点面团降低湿稀、减少收缩番茄酱增稠果胶与胶质蜜饯降低明胶化时间医疗用品药剂粘合绷带、缝合线无毒、水溶性油田用品钻井泥浆高粘度印花浆料高粘度与所需求的纺织浆料不黏着的短稠度纺织浆料提高润滑性和耐磨性吸声贴片粘合建筑材料瓦楞板高度保水性成膜性混凝土粘合铸件芯粘合1

12、.3.2支链淀粉的国内外研究现状和发展动态支链淀粉具有抗老化特性、改善冻融稳定性、增稠作用、高膨胀性及吸水性,因而被广泛应用于食品加工、包装材料的制造、水溶性及生物可降解膜、医药和建筑工业等领域8-9。为了加深理解木薯淀粉物性与其所含直链淀粉、支链淀粉含量的关系，提高直链和支链淀粉应用价值，必须对直链、支链淀粉进行有效分离与检测。但由于直链淀粉分子与支链淀粉分子交织缠绕在一起，分子内与分子间存在着强大的氢键结合力10，因此较难分离，目前我国尚少有木薯直链淀粉与支链淀粉的纯品出售。在过去的几十年间，淀粉结构研究已取得很大进展，尤其是对淀粉颗粒结构的研究方面，更是如此。这些进展一方面是由于出现了新

13、的显微技术，另一方面是由于固体的核磁和结晶技术的进步，使得我们能够分析颗粒内部支链淀粉的构造11,12。我们甚至可以检查淀粉颗粒的不同部分13。由于早在六十多年前就了解了淀粉是由两种大分子物质组成，人们早就期望尽快建立淀粉组分的结构模式14。虽然由于支链淀粉的束结构已经取得一致认同，但关于该结构的深入了解还很不够。为了最终了解淀粉颗粒的结构以及淀粉的功能性，人们仍在细致研究其束结构15。1.4淀粉组分分离由上文可知，直链淀粉和支链淀粉无论是在结构、性质还是用途上都有一定的区别，而且直链淀粉和支链淀粉的组成百分数的差异，对木薯淀粉的品质、储藏和加工产生重要的影响。所以研究直链淀粉和支链淀粉的分离

14、方法具有重大的意义。分离的原则：一是不能使淀粉的性质发生变化，二是淀粉不能发生降解。1.4.1.温水浸出法原理是直链淀粉易溶于热水，从团粒中渗透出来，并形成粘度很低的溶液，而支链淀粉只能在加热加压的情况下才能溶解于水。将脱脂的淀粉水悬浮液保持在糊化温度或稍高于糊化温度下搅拌，之后离心浓缩即可得到直链淀粉。温度是影响该方法效率的主要因素。一般提取的温度稍高于淀粉的糊化温度即可16。Baum、Gilbel17将淀粉粒在氮气流下用0.5 mol/L NaOH溶液悬浮30 min, 然后用40000 rpm离心2 h, 上部清液经过中和、浓缩、脱水后得直链淀粉。此方法中温度影响淀粉的抽提效率。若太高，

15、支链淀粉也溶解导致纯度较差；相反温度太低，直链淀粉得率较低。1.4.2配合剂法配合剂分离法中以Schoch的丁醇法最为有名。该法是往淀粉糊液中加入正丁醇进行冷却, 使直链淀粉- 正丁醇复合物沉淀出来。直链淀粉分子在较高温度下分子较为伸展,极性基因外露,很容易与一些极性有机物,如醇类、脂肪酸作用。而支链淀粉分子中,由于支链呈树枝状,在空间上起到阻碍作用,所以与极性试剂进行反应较慢，不易与这些化合物形成复合物沉淀4。可应用此原理进行直链淀粉和直链淀粉的分离操作。具体操作过程：首先经过一定的预处理包括高压加热、碱液增溶等方法将淀粉分散成溶液，然后加入适当的有机溶剂，使直链淀粉成为一种不溶性的复合物沉

16、淀，进行离心，沉淀即为直链淀粉，而支链淀粉留于母液中，经过减压蒸馏，再用无水乙醇进行沉淀，将其析出。该方法是目前实验室制备少量样品的常用方法。敖自华等采用正丁醇分离了银杏的两淀粉，并用凝胶渗透色谱法进行了纯度鉴定，表明通过该法可得到纯度较高的淀粉组分。孙忠伟等人对芋头淀粉进行了分离纯化，并采用高效液相色谱进行了鉴定18。1.4.3盐类分离法同系高聚物的溶解度随分子量的增加而降低。将非溶剂加入高聚物溶液中将会引起分子离析和沉淀, 开始析出和沉淀的是分子量较高的级分。在两种聚合物的混合物中, 当其中一种结晶趋势较小时,加入非溶剂将会沉淀或盐析出具有较多的全同立构结构, 形成有较高结晶倾向的另一聚合

17、物19。盐类分离法就是利用直链和支链淀粉在盐的浓度相同的条件下盐析的温度不同而将其分离。常用的无机盐有硫酸镁、硫酸铵和硫酸钠等。支链淀粉和直链淀粉在室温下能从13%硫酸镁溶液中沉淀，但在80 只有直链淀粉能沉淀。利用这种性质，工业上分离直链淀粉和支链淀粉的方法为：10%马铃薯淀粉用SO2和MgO调PH值至6.57.0，为了防止淀粉降解，加入13%硫酸镁，160 加压加热使淀粉溶解。冷却至80 ，高速离心，直链淀粉沉淀。母液继续冷却至20 ，离心分离，沉淀为支链淀粉沉淀1。1.4.4控制结晶分离法淀粉溶液或淀粉糊在低温静置条件下,直链淀粉分子就缓慢渗出, 如果适当地降低温度,则此类分子将产生定向

18、并从溶液中结晶出来。这种迅速结晶的现象是结构有规律的全同立构-D-1.4键键合的线性直链淀粉分子的特征。如果浓度太高或温度太低, 直链分子的渗出减慢而结晶受阻,结果取而代之的是一种三维凝胶网络, 即淀粉的凝沉现象。如果支链淀粉的线性外支链也参与凝胶的形成, 那么直链和支链淀粉分离困难或成为不可能。Etheridge等通过控制结晶过程分离出了纯度相当高的直链淀粉。Hoffman. Starkfarbriken应用以凝胶作用为基础的流体力学法分离出马铃薯直链淀粉和支链淀粉16。1.4.5电泳法马铃薯中支链淀粉含有少量磷酸，具有负电荷，可利用电泳将直链淀粉和支链淀粉分离。将马铃薯淀粉溶液置于电场中，

19、支链淀粉移向阳极，沉淀下来，直链淀粉仍留在溶液中。玉米淀粉不含磷酸酯，但直链淀粉吸附有脂肪酸，具有负电荷，置于电场中，直链淀粉向阳极移动沉淀下来，而支链淀粉仍留在溶液中。1.4.6纤维吸附法利用直链淀粉能被纤维素吸附而支链淀粉不被吸附的性质可将它们分离。将冷淀粉溶液通过脱脂棉花柱, 直链淀粉被吸附在棉花上, 支链淀粉流过, 直链淀粉再用热水洗涤出来。用此方法可制得高纯度的支链淀粉1。1.4.7 色谱法由于直链淀粉和支链淀粉的分子结构和分子量的不同,使得采用凝胶过滤层析分离成为可能。当淀粉溶液通过层析柱时,分子直径比凝胶孔大的支链淀粉分子只经过凝胶颗粒之间的空隙,随洗脱液一起移动,先流出柱外；而

20、分子直径比凝胶孔小的直链淀粉分子,能够进入凝胶相内, 不能和洗脱液一样向前移动, 移动的速度必然要落后于支链淀粉分子。但由于此方法所用的上样量较少, 所以多用于对已分离的直链淀粉和支链淀粉进行纯度检验17。1.4.8伴刀豆蛋白A法Matheson 和Welsh20提出了另一种淀粉级分分离的方法，不沉淀直链淀粉，而是讲支链淀粉与外援凝集伴刀豆球蛋白A形成复合物，然后将其沉淀出来，再用蛋白酶将外源凝集素（一种蛋白质）水解去除21。虽然该方法可获得较纯的支链淀粉，但是如果原淀粉样品中含有分支状的中间级分，则也会随支链淀粉沉淀析出20,22。伴刀豆球蛋白A与支链淀粉的结合力与外源凝集素浓度和多糖结构有

21、关15。1.5本课题的提出、研究内容和意义淀粉既可供食用也可作为工业原料，其价格低廉且来源十分丰富，是一种重要的化工原料之一，淀粉分为直链淀粉和支链淀粉，两者具有不同的结构及其应用特性。本项目利用亚热带木薯淀粉为原料，研究直链淀粉和支链淀粉的较佳分离方案，并探究其最佳的分离条件。为建立以木薯淀粉为原料分离直链淀粉和支链淀粉的工业化生产平台提供技术支持，同时对提高广西木薯淀粉深加工产品档次和质量、拓宽淀粉深加工产品应用功能和应用领域都具有十分重要的理论与现实意义。研究的主要内容是：(1) 研究制备木薯直链淀粉和支链淀粉的产品工艺方法；(2) 通过单因素实验来考察原淀粉液的浓度、糊化温度等因素的影

22、响，做出单因素影响曲线以确定最佳工艺条件；(3) 通过紫外-可见分光光度计对显色后的淀粉进行扫描，确定淀粉中的直链及支链被分离。此研究可以有效的利用广西十分丰富的木薯淀粉资源，提高木薯淀粉的深加工工艺水平，拓宽木薯淀粉深加工产品品种及其应用功能，对广西的木薯产业具有一定的指导意义及参考价值。顺应科学发展观的经济体制，可以为日益紧张的工业提供新的原料来源，减少对石油工业的依赖。附录一 英文文献翻译原文附录二 译文用密度梯度离心法分离小麦淀粉的直链淀粉和支链淀粉Mahsa Majzoobia, Arthur J. Rowea, Martin Connockb, Sandra E. Hilla, S

23、tephen E. Hardinga*aSchool of Biosciences, University of Nottingham, Sutton Bonington Campus, Loughborough LE12 5RD, UKbSchool of Applied Sciences, University of Wolverhampton, Wolverhampton WV1 1SB, UKReceived 4 June 2002; revised 26 September 2002; accepted 14 October 2002摘要本文介绍了用密度梯度离心法分离直链淀粉和支链淀

24、粉并由分析性超速离心机作为分析支持的新颖的技术。淀粉首先在90DMSO和5的蔗糖溶解，然后铺在梯度形成溶液的10 %- 30的蔗糖在90DMSO中，用由36的氯化铯和在水中的25蔗糖作缓冲。然后用制备超速离心机用转子转速为14000prm的速度离心大约25min。小麦淀粉的实验结果表明：这种方法出品高度纯化的支链淀粉中可溶和高度聚集形式，且直链淀粉级分的至少部分纯化。2003年 Elsevier Science Ltd出版。关键词：淀粉分离、分析超速离心法、密度梯度离心法、小麦1.介绍淀粉是一种多糖，对工业尤其是食物方面、制药公司、医疗保健和涂料行业（比如Englyst & Hudson，19

25、97）有重要的地位，主要有直链淀粉和支链淀粉构成。例如小麦淀粉，里面有25%直链淀粉和75%支链淀粉( Shibanuma, Takeda, Hizukuri & Shibata,1994)。直链淀粉是淀粉中几乎无分支的线性部分。这是由-D-葡萄糖通过-D-1，4糖苷键链接起来的。支链淀粉也有直链淀粉的分子，但是它是由-D-1，6糖苷键链接的 (Cura & Krisman, 1990; Lasztity,1999; Shibanuma et al., 1994)。直链淀粉和支链淀粉的分析两已经被估计为105和108 (Roger, Bello-Perez &Colonna, 1999; Ro

26、ger & Colonna, 1996)。淀粉如高直链玉米淀粉，土豆淀粉和皱纹豌豆淀粉的分子量现已报告。这些分子的特点是具有较高的直链淀粉，具有较低的链分支( Banks, Geddes, Greenwood & Jones, 1972;Colonna & Mercier, 1984; Lasztity, 1999).直链淀粉和支链淀粉的分离在这些年来引起了较多的关注，但取得的成功却是很少。( Cornell, McGrane & Rix, 1999)。在之，用凝沉法探究谷物淀粉样品的研究表明：直链淀粉的沉降系数约为410s，支链淀粉的沉降系数月尾100400s (see, e.g. Leli

27、evre, Lewis & Marsden, 1986;Fronimos, 1990; Millard, Wolf, Dintzis & Willett, 1999).同时也表明了淀粉组成的沉降系数与浓度是紧密相关的(Tongdang, Bligh, Jumel & Harding,1999)。在这项研究中，我们介绍一个新颖的技术，特别是在谷物科学中，使用超速离心法分离直链淀粉和支链淀粉。在这种方法中，直链淀粉和支链淀粉的分离是应用它们之间的分子大小的和沉降速率的差异，使用蔗糖密度梯度离心法。在密度梯度中获得更好的离心效果的关键是：首先防止对流，在高速转动中就能破坏这种对流行为，第二，增加了一

28、个相对的离心力场从而维持一个相对恒定的速度沉降粒子( Ralston,1993)。分析型超速离心机是一种拥有能用于分析直链淀粉和支链淀粉已经分离的机器，在分析沉降速率中应用的分析型超速离心机，是用来评估密度超速离心机离心成功与否的主要技术( Banks, Greenwood & Muir, 1974)。二甲基亚砜（DMSO）已经被证明为一种温和的试剂，淀粉可以溶于其中而不会产生明显的分层，这个特性已经被用于溶解淀粉( Cheetham & Tao, 1997; Jackson & Lincoln, 1991 )。同是有几个报告显示，脱脂淀粉的结构和物化性质有关系( Morrison, 1981

29、; Vasanthan & Hoover,1992)。因此脱脂淀粉也用于测试脂类对淀粉分离的影响。2.材料和方法2.1脱脂淀粉美国西格玛化工有限公司的纯小麦淀粉，使用85%甲醇作为溶剂( Cornell et al., 1999）用索氏萃取法萃取脱脂24h。然后在已知温度和水分含量的环境下干燥淀粉。2.2测定淀粉的直链淀粉含量直链淀粉含量和支链淀粉的比例以及支链小麦淀粉的比例测试预计使用来自Megazyme (Ireland) 的商业用分析工具。2.3样品制备将50mg/ml纯小麦淀粉和5%（w/v）蔗糖加入50ml的90%DMOS（v/v用蒸馏水），用沸水浴加热，为了避免形成任何凝胶状淀粉，

30、用高速旋涡混合器中混合15min (Gibson et al., 1997)。然后将样品在室温下冷却，用滚轴混合器搅拌过夜。脱脂小麦淀粉也是用这样的方法制备。2.4用密度超速离心机制作纬向密度梯度层一个贝克曼带状超离心机B-XIV钛带状转子运行在2000 rpm，内充满了由10%30%蔗糖溶于90%DMOS的密度梯度范围在1.21.3g/ml的溶液540ml。由36%（w/v）氯化铯和24%（w/v）蔗糖蒸馏水溶液制成的密度大约为1.4g/ml的缓冲液，用于位移加载前的空气样本和位移结束时收集密度梯度的样本。然后用25ml90%DMOS当覆盖层。将样品置入机器，设定温度为20，转子转速为140

31、00rpm，离心25min。当转子转速降至2000rpm后，把密度大约1.9g/ml的FC43注入离心管外围。2.5密度测量检查密度梯度形成的稳定的和整个运行充分线性是很重要的。每个百分数的密度都是用分析天平精确称量的1ml的质量来获得（有效体积）。2.6通过碘染色法测定直链淀粉和支链淀粉的分数碘显色法被用于快速测量直链淀粉和支链淀粉的含量，通过显色形成两个不同的颜色，主要是直链淀粉的显深蓝色，主要含支链淀粉的显棕色。每1ml试剂中含有0.35mlKOH，0.4mlHCl（0.1N）和0.07mlKI-I2（Gerard, Barron, Colonna & Planchot 2001)。用9

32、0%DMOS作空白对照。测出直链和支链的百分数，用于做下一步实验。2.7 净化淀粉组件的解决方案基于碘显色法得出的数据，把淀粉进一步纯化。把样品放入沸水浴中加热几分钟，然后加入50ml无水乙醇，然后反演混合。在沉淀过程中加入最小化淀粉聚合的乙醇，然后加热。2h后放置在室温中，收集沉淀（2000g,10min）。弃上清液，收集沉淀并用乙醇洗涤多次，用真空干燥箱烘干，设置为50.2.8 淀粉在90%DOMS中的再增溶首先，通过在低转速上的旋涡混合混频器用螺旋盖管，把干燥淀粉分散在5毫升90的DMSO中，。然后将试管加盖并置于沸水浴。 几分钟后，取出管 并涡旋以高速，然后返回到水浴15分钟，间歇搅拌

33、。如果凝胶状 淀粉团块保持到15分钟后，该 搅拌和加热步骤被继续，直到它们完全分散。然后将样品冷却至室温，并留在辊混合搅拌过夜。2.9 使用贝克曼沉降速度实验最优XL-I贝克曼舰XL-I用于做沉降速度实验，目的是为了获得关于分理出的直链淀粉和支链淀粉的纯度信息。纯度从评估样品的沉淀系数分布图中获得。进行样品纯化的实验在型号XL-I分析超速离心机上进行，在20上先8000rpm离心4h，再50000 rpm离心4h。给定的径向位置r，沉降边界移向细胞基地的浓度变化随时间变化（dc(r)/dt)是生产和表观重量平均沉降系数，然后S*是使用程序DCDT+(Philo, 2000).计算出的。表示在水

34、温20下的标准密度和粘度的沉降系数（S20,w）就可以得出( Tanford, 1961 ):指溶质的微分比体积，20，w指水的密度，20，w指水的粘度（都是在20的条件下），和是指溶剂在温度T下相应的参数。在项目中所使用的参数如下：直链淀粉的：在20下溶于90DMSO，0.643ml/g，(Fujii,Honda & Fujita, 1973)。支链淀粉的：在20下溶于90DMSO，0.613ml/mg，(Fronimos, 1990)。20的90DMSO的密度：1.0861 g/ml ( Tongdang, 2001 )。20的水的粘度：1.004厘泊。20的90DMSO的粘度：4.0厘泊

35、。(Van Holde, Johnson& Ho, 1998)。2.10 用刀豆蛋白A（刀豆蛋白A）检测支链淀粉中含有的直链淀粉的分数在一定的温度、离子强度、pH值下，凝集素刀豆蛋白A专门配合物分支多糖是基于a- D-吡喃葡萄糖（例如支链淀粉）或 a- D-mannopyrannosyl单位在多个非还原性末端基团连接与沉淀的形成。因此，刀豆蛋白A被用来研究直链淀粉的纯度。在本实验中，90DMSO的淀粉溶液溶解在乙酸钠溶液（200mM，pH=6.4），加入刀豆蛋白A使支链淀粉沉淀，然后以速度1000rpm离心10min (Gibson et al., 1997)。2.11直链淀粉/支链淀粉的比率

36、各成分的浓度使用DCDT+算法用一下的方法测量：对沉降速率实验扫描得，其中的边界有几乎移动到该单元的中间被选定。各组分的再沉积的图表明了明显的沉淀系数分布;是相对沉降系数; 可以获得。下一个峰的面积表示的部分的负载浓度( Philo, 2000 )。3.讨论密度的测量证实了线性度和梯度层（图1）的稳定性。因此，区带转子内的梯度层已完成成功。碘染色结果显示，大部分的直链淀粉在前四个级分已经分离（加入碘后蓝色的百分数可以证明）。图1.纬向馏分作为分数数的函数的平均密度Fig. 1. The average densities of the zonal fractions as a function

37、 of fraction number.图2.分析超速离心沉降速度50000转在图前四部分富含直链淀粉。（F为从纬向超速离心机实验次数），20.08。光学记录记录用瑞利干涉光学系统，并使用DCDT+系统转换成时间导数的浓度对沉降系数S *分布作为函数（见正文）。Fig. 2. Analytical ultracentrifuge sedimentation velocity diagrams for the first four fractions at 50000 rpm rich in amylose. ( F=fraction number from the zonal ultracen

38、trifuge experiment), 20.0 . Optical records recorded using Rayleigh interference optics, and converted into a time derivative concentration distribution as a function of the apparent sedimentation coefficient s* using the DCDT +programme (see text).图3.分析超速离心在转速为8000转的沉降速度图的前四个部分中的的速度显示的中间体S组成分数（F指分数

39、）。其他细节，如图2。Fig. 3. Analytical ultracentrifuge sedimentation velocity diagrams for the first four fractions in the speed of 8000 rpm showing an intermediate s component. (F = fraction number). Other details, as Fig. 2.另外，50000rpm（图2）的实验沉降速度结果表明存在大分子的沉降系数值约6 8S，能被分离的直链淀粉也在这个范围内。虽然在8000rpm下约一个沉降系数的成分70

40、 150S也存在于这些组分（图3）。加入刀豆蛋白A的前四部分薄沉淀层形成，其中显示，大分子物质的分支也存在于第一个部分。这可能是一个低沉降系数支链淀粉或具有少部分分支的直链淀粉。对于分数5，6，23，24碘染色呈棕褐色。因此可以得出结论，支链淀粉为组件的主要成分。从这些馏分的沉降速度实验结果中，观测不到峰在50000转（图4），而约350S 150S的沉降系数峰值观察到在8000rpm（图5）确认碘染色结果并成功分离支链淀粉。图4.分析超速离心对含支链淀粉部分（5,6，23，和24）在50000转时的沉降速度图表，（F指分数）。其他细节，如图2。Fig. 4. Analytical ultra

41、centrifuge sedimentation velocity diagrams for the amylopectin containing fractions (5, 6, 23, and 24) at 50000 rpm. ( F= fraction number). Other details, as Fig. 2.图5.分析超速离心对含支链淀粉部分（5,6，23，和24在8000rpm下沉降速度图的（F为分数）。其他细节，如图2，这表明不存在直链淀粉和中间S成分。Fig. 5. Analytical ultracentrifuge sedimentation velocity d

42、iagrams for the amylopectin containing fractions (5, 6, 23, and 24) at 8000 rpm ( F= fraction number). Other details, as Fig. 2. This shows the absence of the amylose and the intermediate s component.分级分离出的小麦直链淀粉/支链淀粉的比率由DCDT+算法获得的淀粉前四个馏分为约1.5，0.8，0.6，及0.4。这些值表明，直链淀粉和支链淀粉的分数二分之一减少到四分之一。此外，这些值是显著比用采用

43、刀豆蛋白A的方法得非分级小麦淀粉约0.33的值高。因此分数1 - 4是直链淀粉丰富的分数而馏分5，6，22，和23似乎是无直链淀粉的直链淀粉/支链淀粉值之比为实际上为零。结果为脱脂小麦淀粉样的结果（表1）非常类似非脱脂小麦淀粉。虽然已经报道了脱脂的淀粉可以改变结构和淀粉的功能特性(Vasanthan and Hoover, 1992)，通过脱脂的小麦淀粉，在分馏无显著变化结果。总之，我们发现，带状超速离心可以分离直链淀粉和支链淀粉具有相当程度的成功，由分析型超速离心机和碘染色实验证实了。这种方法产生高纯度支链淀粉，表现在可溶性（分数一般5,6）和高度汇总（部分23和24）的形式。的直链淀粉馏分似乎含有，在除了低沉降系数直链淀粉（6 8S）一些更快沉降材料，进一步研究可能会出现支链淀粉或异常的低沉降系数形式的支链淀粉。目前的工作中定义了一个快速的、新的技术，它提供了一个收率较大的 淀粉的主要组成部分。这种技术另外还起到了隔离中间的沉降系数的一小部分直链淀粉和支链淀粉。这个中间的沉降系数与直链、支链淀粉的关系将需要进一步调查