白血病融合基因检测综述.doc

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1、-/白血病相关融合基因的检测及意义白血病是造血系统的恶性克隆性疾病，由于造血干细胞受损，导致克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。白血病细胞具有自我更新增强、增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等特点，患者会出现不同程度的贫血、出血、感染和浸润的临床症状，严重危害生命健康。近年来，随着细胞生物学和分子生物学技术的发展，人们已经认识到大部分的白血病中都存在着包括缺失、重复、易位等染色体畸变，导致原癌基因或抑癌基因结构变异，原癌基因激活或抑癌基因失活，产生新的融合基因，编码融合蛋白。现有报道的染色体畸变已有五十种以上，累及更多数目的融合基因，这些异常已经逐渐成为不同类型白血

2、病的分子生物学特异性标志。白血病相关融合基因的种类多样，常见的融合基因有BCR-ABL、AML1-ETO、PML-RAR、E2A-PBX1、MLL-AF4、TEL-AML1、SIL-TAL1、DEK-CAN、CBF-MYH11等。BCR（breakpoint cluster region）基因是BCR-ABL融合基因的组成部分，与费城染色体（Philadelphia Chromosome）的形成有关，具有两种转录异构体。正常的BCR基因编码产物的功能还尚未清楚，它编码的蛋白具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，是RAC1和CDC42的GTP酶激活蛋白。ABL1基因是编码细胞质和细胞核蛋白酪氨酸激酶的原癌

3、基因，与细胞分化、细胞分裂、细胞粘附、应激反应等生命活动相关。活化的ABL1蛋白通过SH3结构域受到负调控，SH3结构域的缺失会导致ABL1基因转化为癌基因。CDC2介导的磷酸化能够调节ABL1酪氨酸激酶的DNA结合活化过程，表明ABL1可能在细胞周期中发挥作用。Nowell及Hungerford于1960年发现在慢性粒细胞性白血病（CML）患者外周血中有一个比G组染色体还小的近端着丝粒染色体，由于首先在美国费城（Philadelphia）发现，故命名为费城染色体。1971年ORiordon利用荧光显带法确认费城染色体是第22号染色体长臂缺失大段后剩余的部分。1973年Rowley发现缺失下来

4、的那部分通常易位到9号染色体长臂的末端，形成t（9；22）（q34；q11）。1982年Deklein等在费城染色体上首次发现了原来位于9号染色体长臂末端（9q34）的癌基因ABL1，证明费城染色体上有来自9号染色体长臂末端的片端，是22号染色体与9号染色体相互易位的产物。易位使9号染色体长臂（9q34）上的原癌基因ABL1和22号染色体（22q11）上的BCR基因重新组合成融合基因，因而称为BCR-ABL融合基因。BCR-ABL融合基因编码的融合蛋白具有很强的酪氨酸激酶活性，改变细胞多种蛋白质酪氨酸磷酸化水平和细胞微丝机动蛋白的功能，扰乱细胞内正常的信号传导途径，使细胞失去了对周围环境的反应

5、性，并抑制凋亡的发生，影响细胞周期调控，导致骨髓造血干细胞过度增殖。BCR-ABL融合基因在病人中常见有四种剪接体mRNA：编码P210融合蛋白的b2a2和b3a2，编码P190的e1a2，编码P230的e19a2。其中b3a2和 b2a2主要存在于CML，ela2主要在急性淋巴细胞性白血病(ALL)中出现，而出现较少的e19a2根据2008年世界卫生组织（WHO）最新版的血液系统肿瘤分类标准，也应被诊断为CML。90%以上的CML患者血细胞中都发现有费城染色体的存在，主要为P210融合蛋白，因而费城染色体和BCR-ABL融合基因可以作为区分典型CML和非典型CML的诊断指标。同时在费城染色体

6、阳性的ALL患者中，65%的成人和80%的儿童能够检测到P190融合蛋白阳性。由于BCR-ABL融合蛋白能够收到多种小分子化合物的抑制，临床上第一代针对BCR-ABL融合蛋白的酪氨酸激酶小分子抑制剂（TKI）伊马替尼就是是通过结合抑制BCR-ABL融合蛋白的酪氨酸激酶结构域来抑制其在细胞周期中的影响，从而发挥抗白血病作用的。第二代BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼和尼洛替尼也是在这个基础上进行改进，以以减少因伊马替尼使用而带来的抗药性。对费城染色体和BCR-ABL融合基因的检测，对于正确区分CML类型，指导临床治疗和判断预后情况具有重要的指导作用。RUNX1（Runt-related tr

7、anscription factor 1）基因也被称为AML1（acute myeloid leukemia 1）基因或 CBFA2（core-binding factor subunit alpha-2）基因，RUNX1基因编码的RUNX1蛋白是调控造血干细胞分化为成熟血细胞的转录因子，是RUNX（Runt-related transcription factor）家族或CBF（core binding factor-）的成员，能够与CBF蛋白形成异质二聚体复合物，增强DNA结合和复合物的稳定性。人的RUNX1基因全长260kb，在21号染色体（21q22.12）上，有两个选择性转录启动子，

8、能够通过选择性剪接形成多种转录异构体。全长的RUNX1蛋白由12个外显子编码形成，在这些外显子中，包含有两个结构域，分别被命名为RHD（runt homology domain）和TAD（transactivations domain），前者由2,、3、4号外显子编码形成，后者由6号外显子编码形成。RUNX1蛋白分别通过这些结构域来介导DNA结合和蛋白间相互作用。RUNX1的转录过程受两个增强子的调节，这些组织特异性的增强子能够结合淋系或红系调控蛋白，促进RUNX1基因在造血系统中的高度活化。RUNX1在胚胎发育的造血过程中发挥着至关重要的作用，在所有的造血部位都有表达，能促进造血干细胞和造血

9、祖细胞的形成。在分子水平，RUNX1基因通过结合血小板生成素TPO（thrombopoietin）受体c-Mpl的启动子，募集转录活化子或抑制子，进而促进造血干细胞的生成或向其他造血细胞方向分化。RUNX1还能够通过上调Smad6的表达来促进蛋白体降解。ETO基因又称RUNX1T1基因，编码的蛋白是一种锌指结构转录因子和癌蛋白。AML1-ETO融合基因主要见于急性髓系白血病（AML）患者中，t（8；21）（q22；q22）染色体易位导致21号染色体的原癌基因AML1基因和8号染色体的ETO基因融合，形成AML1-ETO和ETO-AML1融合基因。ETO-AML1不能通过聚合酶链式反应（PCR）

10、检测到，一般被认为其表达量极低或由于降解导致表达不稳定。AML1-ETO融合基因表达的蛋白全长含有752个氨基酸，其N端为RUNX1（runt-related transcription factor 1），也称AML1区；C端是8号染色体编码的RUNX1T1runt-related transcription factor 1; translocated to, 1 (cyclin D-related)，也称ETO。AML1-ETO融合基因主要发生在M2型AML患者中（约40%），在M2b的阳性率达90%，因而可以作为M2b分型诊断的重要分子标志，少见于M4和M1，极少数骨髓增生异常综合症（

11、myelodysplastic syndrome, MDS）患者中也有AML1-ETO融合基因的存在。临床上将AML1-ETO融合基因作为分子分型诊断和预后观察的一个重要依据，AML1-ETO融合基因阳性的患者预后较好。AML1-ETO阳性的白血病细胞有一定程度的分化能力，能分化为较成熟的嗜中性粒细胞核嗜酸性粒细胞，对化疗反应较为敏感，因而AML1-ETO融合基因阳性的患者采用大剂量的阿糖胞苷治疗，完全缓解率高达98%，5年存活率达到67%，预后较除M3外的其他亚型好。因而对初诊患者的AML1-ETO融合基因检测，对预后判断和治疗方案的制定具有重要意义。PML（Promyelocytic le

12、ukemia）基因编码的PML蛋白，属于TRIM（tripartite motif）家族的成员，定位在核小体上，具有转录因子和肿瘤抑制蛋白的功能。PML的表达与细胞周期有关，能够调节p53对致癌信号的反应。RAR（Retinoic acid receptor alpha，维甲酸受体）也叫NR1B1（nuclear receptor subfamily 1， group B， member 1）基因，能编码细胞核受体蛋白。维甲酸信号由两种细胞核受体家族转导，分别是RAR（retinoic acid receptor）和RXR (retinoid X receptor)，两者能够结合形成RXR/R

13、AR异质二聚体。在没有配体存在的情况下，DNA结合的RXR/RAR复合物通过募集共阻遏物NCOR1、NCOR2（SMRT）和组蛋白脱乙酰基酶来抑制转录过程的进行；当配体结合到复合物时，就能够诱导构像发生改变，允许募集共活化物、组蛋白乙酰基转移酶，使转录过程进行下去。PML-RAR融合基因是急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia， APL）的特异性分子标志，见于98%的APL患者中。APL患者的特异性细胞遗传学异常 t（15；17）（q22；q21），导致15号染色体上的早幼粒细胞白血病基因（PML）和17号染色体上的维甲酸受体（RAR）形成PML-RAR

14、融合基因。正常的RAR等位基因编码野生型维甲酸受体，与维甲酸结合可以调节多个靶基因的转录。PML是POD（PML oncogenic domain）多蛋白复合体的核心组分，通过转录共激活作用，可以抑制肿瘤生长，在多种凋亡途径中起重要作用。形成PML-RAR融合基因后，维甲酸核受体基因表达受抑制，使维甲酸对靶基因的转录调节功能丧失；PML-RAR融合蛋白通过负显性抑制作用抑制早幼粒细胞分化成熟；PML去定位使POD的结构破坏，形成上百个细小颗粒分布在核及胞质中，正常的抑制增殖和促凋亡功能发生障碍，导致细胞大量增殖，凋亡减少，这些导致了APL的发生。形成PML-RAR融合基因的RAR部分断裂位点位

15、于2号内含子上，而PML部分的断裂位点有三种，因此将PML-RAR融合基因分为三类：1）PML断裂位点在6号内含子上的BCR1型（L型），占APL患者的55%；2）PML断裂位点在6号外显子上的BCR2型（V型），占APL患者的5%；3）PML断裂位点在3号内含子上的BCR3型（S型），占APL患者的40%。由于PML-RAR融合基因与APL发生的重要相关性，临床上已经将PML-RAR融合基因作为动态评估患者病情及预后的重要依据。E2A基因编码蛋白能够与NeuroD形成二聚体复合物，调控多种基因的转录过程。PBX1（Pre-B-cell leukemia transcription facto

16、r 1）基因编码的转录因子PBX1能够与HOXB1、MEIS1和HOXB7等蛋白相互作用，形成复合物，结合到DNA上，促进转录过程的进行。临床中发现的E2A-PBX1融合基因是由t（1；19）（q23；p13）易位形成的，编码的融合蛋白中E2A氨基端转录活化域结合到PBX1同源结构域蛋白的DNA结合域上，是急性淋巴细胞白血病（ALL）中常见的染色体畸变，见于3-5%的儿童ALL患者和3%左右的成人前B-ALL患者中，在儿童前体B细胞ALL（precursor-B ALL）患者中20-25%可以检测到E2A-PBX1融合基因阳性。E2A基因13号外显子和PBX1的2号外显子断裂后相连接，形成E2

17、A-PBX1融合基因，同时在5-10%的E2A-PBX1融合基因阳性患者中发现连接点处有27个核苷酸的突变，编码出两种不同的蛋白P85和fy77，两者只在PBX1部分的羧基端存在差异，并都具有转化特性，属于癌蛋白。近年来随着化疗方案的改进，对于E2A-PBX1融合基因阳性的ALL儿童采用更强烈的化疗方案，可以改善其预后，5年无病生存率（EFS）已达89.5%。E2A-PBX1融合基因阳性和预后关系不明显，但是可以作为ALL和微小残留病变（MRD）诊断分子标志。DEK癌基因编码的蛋白具有一个SAP结构域，该蛋白能够结合到十字形和超螺旋DNA上，诱导闭环DNA出现超螺旋结构，并且与mRNA形成中剪

18、接位点的选择密切相关。该区域的染色体异常会增加DEK基因的表达，产生针对DEK蛋白的抗体，引起多种疾病。CAN基因又称为Nup214（Nuclear pore complex，核孔复合物）基因，它编码的核孔复合物蛋白是延伸通过核膜的主要结构，形成一个能够调节大分子在细胞核与细胞质之间流通的通道。CAN基因编码的蛋白定位在核孔复合物的细胞质一面，是细胞周期和核质转运正常运行的必要调节。DEK-CAN融合基因是由Von Lindern等人在1990年研究发现的t（6；9）（p23；q34）易位，导致6号染色体上的DEK基因和9号染色体上的CAN基因融合形成的。CAN基因的3部分和DEK基因的5部分

19、发生融合，在6号染色体短臂上产生DEK-CAN融合基因，转录形成一个异常的5.5kb的mRNA。DEK-CAN融合基因主要见于急性髓系白血病（AML）的M2型和M4型中，也见于M1型，且常常是唯一存在的核型，发生率为0.5%4%，这种异常也存在于MDS的难治性贫血伴原始细胞增多症（RAEB）中。伴有这种染色体异常的患者的年龄一般比较轻，且预后较差。对于DEK-CAN融合基因的检测，有助于辅助诊断分型和判断预后。SIL-TAL1融合基因仅见于急性T淋巴细胞白血病中（T-ALL），约占26%，由1p32的部分缺失形成，是T-ALL的特异性克隆标志，是儿童T-ALL患者中最为常见的一类染色体异常，在

20、儿童患者中出现的频率要远高于成人患者。由TAL1基因的5端丢失，与SIL基因的5端融合，形成SIL-TAL1融合基因，TAL1编码序列在SIL启动子的调控下在T细胞中表达。SIL基因转录产生的mRNA存在于整个细胞周期中，其编码的含有1283个氨基酸的胞质蛋白，在细胞进入G2期时积累，在细胞周期完成时降解。而SIL-TAL1融合基因的形成，引起了细胞周期调控的异常，导致白血病的发生。临床上SIL-TAL1融合基因的检测可以辅助分型诊断和MRD的监测。CBF（Core-binding factor subunit beta）基因编码的蛋白是二聚体核结合转录因子的beta亚基，属于PEBP2/CB

21、F转录因子家族，基因特异性的调控造血过程和成骨作用的进行。CBF蛋白亚基是一个非DNA结合亚基，它通过别构作用增强DNA和alpha亚基的结合，并使结合后的复合物结合到多种增强子和启动子的核心区。CBF基因能够选择性剪接形成两种mRNA，每种编码不同的羧基末端。MYH11基因编码的myosin-11蛋白是一种平滑肌肌球蛋白，属于肌球蛋白重链家族，是一个包含2条重链亚基和2对轻链亚基的六聚体蛋白亚基，能够通过ATP的水解来将化学能量转换为动能。CBF-MYH11融合基因是在多为AML-M4伴嗜酸性细胞增多症，但亦可见于其他类型，如M1、M2、M4、M5、M7和慢性髓系白血病(CML)急变，是由i

22、nv（16）（p13；q22）导致16号染色体长臂的核心结合因子（CBF）链基因和短臂的MYH11基因发生融合形成的，见于8-9%的初诊AML患者中。它具有CBF-MYH11和MYH11-CBF两种形式的融合基因，其中前者对M4EO的致病可能具有重要作用。研究显示CBF基因的断裂位点靠近3端编码区的17个氨基酸处，而MYH11基因的断裂点存在着至少3种不同的方式，能形成10种以上的不同剪接体重排，同时这些重排仍然保持着融合基因转录本的开放阅读框，常见的三种剪接体为A型，D型和E型。85%的CBF-MYH11融合基因阳性患者为A型，D型和E型各占5%。CBF-MYH11融合基因的产生能够促进白血

23、病的发生，但是含有CBF-MYH11融合基因的M4EO白血病患者预后较好。研究表明CBF-MYH11融合基因在患者治疗缓解后可以消失，所以该基因可以用于MRD的检测和预后判断。MLL（Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia）基因编码转录共激活物，是一种组蛋白甲基转移酶，能够正调控基因转录过程，对早期发育过程的基因表达和造血功能具有不可缺少的作用。虽然ML的功能仍有很多未能研究清楚，但是已有报道表明MLL在发育过程的细胞分裂中起着核心作用。同时MLL还是HOX基因上游转录调控因子，HOX基因在造血生成中发挥关键的作用，当MLL蛋白功能异常时，HOX基

24、因表达下调，进而影响正常造血功能。混合谱系白血病（Mixed Lineage Leukemia，MLL）基因重排发生在11号染色体2区3带，MLL蛋白包括三个功能区，分别是转录抑制区、转录激活区和DNA结合区。MLL基因重排使得AT钩区和锌指结构之间的序列发生断裂，在DNA修复时与其他基因发生融合。MLL基因重排涉及五十余种染色体易位，产生不同的融合基因，常见的MLL重排形成的融合基因有MLL-AF4、MLL-AF6、MLL-AF9、MLL-F10、MLL-ENL、MLL-ELL等。MLL-AF4融合基因由t（4；11）（q21；q23）易位形成，是前B-ALL中最为常见的11q23易位，由M

25、LL和AF4基因融合形成，具有6种不同的剪接体，分别为e9e5、e9e4、e10e5、e10e4、e11e5、e11e4。MLL-AF4融合基因在不同年龄段的发生率不同，婴儿ALL中最多见，发生率为40-60%，在儿童和成人中较低，约为5%。在婴儿ALL中检测出MLL-AF4提示预后良好，而相反若在成人ALL中检测出MLL-AF4则提示预后较差。在小儿ALL中出现MLL-AF4时，年龄的不同预后并不一致。MLL-AF6 融合基因由t(6;11)(q27;q23)易位形成，主要发生在AML的M4和M5a分型中，在儿童AML患者中的比例为2-5%，成人患者中较少出现。MLL-AF9融合基因由t(9

26、;11)(p22;q23)易位形成，是11q23异常中最常见的易位形式，主要出现在AML的M5a患者中，在儿童AML患者中发生率为8-10%，在成人中为1-2%，总的预后良好，但是患者的年龄等各种指标的差别也决定预后的差异。根据报道，含有MLL-AF9的小鼠能够导致AML的发生，但单纯的MLL基因异常不会导致白血病发生，表明MLL重排形成融合基因或有伙伴染色体基因的参与是白血病发生的必需条件。MLL-AF10融合基因由t(10;11)(p13;q23)易位形成，主要见于儿童AML-M5患者中，预后不良，且变异复杂易位更常见。MLL-ELL融合基因由t(11;19)(q23;p13.1)易位形成

27、，在AML患者中的发生率较低，已有报道显示其主要在M5a分型中出现，以成年人为主，预后不良，2年无病生存率50%。MLL-ENL融合基因由t(11;19)(q23;p13.3)易位形成的，可见于前B-ALL、前T-ALL、M4、M5、M1、M2多种白血病中，以婴幼儿患者为主，发生率较低。因此对MLL重排形成的这些融合基因的检测，对临床的分型诊断、治疗及预后判断都具有重要价值。TEL基因又称为ETV6基因，定位在12号染色体短臂上，能够编码ETS家族转录因子，编码的蛋白包含两个功能结构域：能够与其他蛋白相结合的PNT结构域和C末端DNA结合结构域。对小鼠的TEL基因进行Knockout实验，研究

28、结果发现该基因对造血能力和血管网络发生的维持必不可少。TEL-AML1融合基因是儿童白血病常见的融合基因，由t（12；21）（p13；q22）易位，导致12号染色体上的TEL基因与21号染色体上的AML1基因融合形成，见于25%的前体B细胞ALL，在儿童的普通ALL中也有较高的表达（1020%），未见于成熟的B-ALL和T-ALL中。TEL和AML1编码对正常造血功能具有关键作用的核酸转录因子，融合基因的形成扰乱了TEL的正常功能，并形成转录抑制子抑制AML1靶基因的表达，最终导致白血病的发生。目前已报道的转录亚型有两种：较多的是TEL的5号外显子与AML1的2号外显子结合（90%），较少的是

29、TEL的5号外显子与AML1的3号外显子结合（10%）。对于TEL-AML1阳性的ALL患者的预后情况现在仍然存有争议，但是有报道认为TEL-AML1融合基因对患者的4年无病生存率相关，是预后良好的重要指标。因而临床中对TEL-AML1的检测，主要用于对辅助ALL分型，监测MRD和预后情况。目前，临床或实验室用于白血病相关融合基因检测的方法有多种，常见的包括如荧光原位杂交（FISH）、巢式RT-PCR、实时定量RT-PCR、多重RT-PCR+寡核苷酸芯片等。荧光原位杂交（FISH）技术是通过标记荧光素的单链DNA（特异性探针）和与其互补的DNA（标本）杂交，通过荧光信号的数量和位置反应标本相应

30、特异性基因的情况。用于白血病相关融合基因的检测中，FISH定量准确、形象直观、特异性较强，但是对操作要求较高，成本较高，灵敏度最高达10-2，不能满足临床对于白血病和MRD检测水平的要求，应用受到限制。实时定量RT-PCR（Real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction）技术检测白血病融合基因的方法，是在实时定量PCR的基础上，增加逆转录过程，可用来检测融合基因的mRNA水平。实时定量PCR技术是在普通PCR反应中加入能与PCR产物结合的荧光探针或荧光染料，并使它们发出的荧光信号随着扩增产物的增加而成

31、比例增长，通过荧光探测仪实时检测每一个循环结束后的荧光强度，通过与标准曲线对比得出定量结果，可以直接检测目的基因的起始数量。实时定量PCR技术中SYBR Green法和Taqman探针法两种最为常用：前者采用SYBR Green染料来监测扩增过程，随着扩增反应的进行，游离状态不发荧光的SYBR Green染料非特异性结合到DNA双链中产生荧光；后者采用Taqman探针，该探针能被Taq酶水解，探针的5端带有荧光报告基团，3端带有荧光淬灭基团，当两个基团靠近的时候报告基团不发出荧光，随着扩增反应的进行，5端的报告基因由于探针被水解而脱离下来而产生荧光。SYBR Green法价格便宜，能够和任意的

32、模板引物搭配，但容易受到非特异性扩增的影响；Taqman探针法更为准确，但是必须设计特异性的探针与引物模板配合，价格较贵。实时定量RT-PCR技术将逆转录过程和PCR过程结合起来，无需开盖，一步法操作，减少污染机会；操作简便、特异性强、灵敏度高；扩增过程中闭管操作，实时数据监测，降低了污染机会，减少假阳性结果；无需电泳，大大缩短了操作时间，减少了操作的繁琐；通过定量内参基因来评价操作质量，减少了假阴性结果。该方法成本也较低，适合在临床应用中开展。巢式RT-PCR是一种变异PCR，使用两对PCR引物扩增同一个片段。第一对PCR引物扩增和普通PCR相似，第二对引物称为巢式引物，引物它们结合在第一次

33、PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增片段。巢式PCR特异性强，如果第一次扩增出错，则第二次继续进行扩增的概率极低，但是最后的结果需要用电泳实验观察，总体流程繁琐，无法准确定量检测白血病融合基因。多重巢式RT-PCR+寡核苷酸芯片检测方法，是在巢式RT-PCR的基础上，在两轮PCR中都平行设置针对多组融合基因的引物，同时检测多种融合基因的剪接体，所有基因的第二轮上游引物在合成时用荧光素在5端进行荧光标记，所有分型探针再3端进行氨基修士。这样经过多重巢式PCR，一次可以扩增出多种可能存在的融合基因，再与所有分型探针在芯片上杂交，鉴定具体的融合基因类型。该方法灵敏度较高，能够同时检

34、测多种融合基因，但成本较高，操作较为复杂。2008年WHO关于白血病分型的标准中将BCR-ABL、PML-RAR、AML1-ETO融合基因等一些常见的染色体异常归纳入白血病基本诊断标准，更说明了对这些融合基因的检测，对于白血病的诊断和治疗具有重要的意义：检测结果不仅可以为白血病诊断分型和预后判断提供重要依据，减少人为主观的判断，使白血病的诊断分型更加科学化和规范化，同时也是白血病微小残留病变（MRD）检测的基础，对白血病的临床个性化治疗的开展具有重要的推动作用。参考文献1. J Gabert, E Beillard, VHJ van der Velden, et al. Standardiza

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