WI-03-28活菌培养计数检验方法.doc

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1、恩施金凰新材料有限公司文件编号WI-03-28版 号A.0活菌计数检验方法页 次1/2生效日期2020/01/021目的 规范及指导生物指示剂（枯草芽孢杆菌菌片）样本中含有的活菌数量的测定。2适用范围 适用于菌片活菌数确认。3内容3.1 仪器设备 净化工作台、恒温培养箱、刻度吸管(1ml)、PBS(磷酸盐缓冲液)、琼脂培养基3.2 操作步骤3.2.1 每批菌片抽取8个菌片样品试验。3.2.2 按要求对检验操作用具进行制备及灭菌，以下操作严格按无菌要求进行。3.2.3 将菌片投入10.0ml PBS无菌试管中，每管一份样品，然后在手掌上用力振敲80次，将菌洗下形成1:10的菌液，作为管。 3.2

2、.4 按稀释级别（次数）需要，准备相应数量的试管，将试管分别排列在试管架上，每管加入9ml PBS，从左到右在试管上标上序号。编 号123456 稀释级别10-110-210-310-410-510-6 3.2.5 用无菌刻度吸管从管内吸取1ml混匀后的菌液样本，加至管内。3.2.6 将管依照前面方法在手掌上用力振敲80次混匀，再吸取出1ml加入管内，依照此方法，直至最后一管。3.2.7 选择适稀释度试管，以吸取其中混合均匀的菌液1ml加入无菌平皿中，每一稀释度接种3个平皿，需接种3个不同稀释度，平皿加样前，应先按组编号，以免弄混。3.2.8 将冷至4045的熔化营养基倒入已加入样液的平皿中，

3、每平皿1520ml。3.2.9 将平皿盖好立刻轻轻摇动均匀，平放于台上，待琼脂凝固后，翻转平皿，使底朝上，置352恒温箱内培养。3.3 观察、计数和报告3.3.1 每日观察细菌生长情况，培养至48小时计算最终结果的菌落数。3.3.2 培养到时间后，计数每个平板上的菌落数，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏，在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算出原始样品中每片中的菌落数，进行报告。恩施金凰新材料有限公司文件编号WI-03-28版 号A.0活菌计数检验方法页 次2/2生效日期2020/01/023.3.3 到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放

4、置于04，但不得超过24小时。3.3.4 计数时应选取菌落数在30300之间的平板。3.3.4.1 若有两个稀释度均在30300之间时，应以二者的比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）决定，比值小于或等于2时，以两个稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；当出现比值大于5时或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查。3.3.4.2 若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则取最低稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告。3.3.4.3 若所有稀释度的平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。3.3.5 若所有稀释度的平板菌落数均不在30300之间，其中一部分小于30或大于300时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。3.3.6 若阴性对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。3.3.7 菌落总数的报告以10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。3.3.8 菌片活菌数结果以cfu/片为单位报告。编制：日期：审核：日期：批准：日期：