基因表达载体的构建ppt课件.pptx

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1、基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定1 1、基因表达载体的构建目的、基因表达载体的构建目的基基因表达载体的构因表达载体的构建建基因工程的基因工程的核心核心使目的基因在受体细胞中稳定存在使目的基因在受体细胞中稳定存在并且并且可以可以遗传给后遗传给后代代使目的基因能够表达和发挥作用使目的基因能够表达和发挥作用2 2、基因表达载体的组成：、基因表达载体的组成： 目

2、的基因目的基因 标记基因标记基因 启动子启动子 终止子终止子启动子：启动子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，它片断，它是是RNARNA聚合聚合酶酶的的结合结合位点位点，驱，驱动基因转录出动基因转录出mRNAmRNA。终止子：终止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终能终止止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了鉴别为了鉴别受体细胞中是否含有目的基受体细胞中是否含有目的基因，从而将因，从而将含含有目的基因的有目的基因的细胞筛选出来细胞筛选出来用用_切切割质割质粒，粒，使其出使其出现切口，

3、现切口，露出露出_。用用_切断目切断目 的基因，使其的基因，使其产产生生_ _ _。3 3、基因表达载体的构建过程、基因表达载体的构建过程将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加再加入入_，形成了一个重形成了一个重组组DNADNA分子分子（重组质粒）（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同种同种限制酶限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体基础上增加了基础上增加了目的基因、

4、启动子、终止子目的基因、启动子、终止子三部三部分结构分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割目的基因既用到限制酶切割目的基因和载体，又用到和载体，又用到DNADNA连接酶将目的基因和载体连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意注意 限制酶的选择：一种限制酶切割结果分析思考讨论： 使用EcoR一种限制酶切割外源DNA和质粒，构建基因

5、表达载体时，可以形成哪些连接产物？下图箭头表示EcoR的酶切位点，EcoR识别序列及切点为GAATTC。质粒自身环化；含目的基因的源DNA自身环化； 质粒和含目的基因的外源外DNA反向连接；质粒和含目的基因的外源DNA正向连接难 点 突 破质粒 抗生素抗性基因质粒EcoREcoREcoR目的基因外源DNA 限制酶的选择： EcoR切割结果分析GAATTC CTTAAGGAATTC CTTAAG目的基因 AATTC G G CTTAAGAATTCCTAAGTAATTCGGCTAAT11221和1连接2和2连接自身环化相互连接1和2连接， 1 和2连接1和2连接，1 和2连接正向反向 限制酶的选择

6、：两种限制酶切割结果分析思考讨论： 选用EcoR和Hind 两种限制酶切割外源DNA和质粒，可以形成哪些连接产物？下图箭头表示两种限制酶的酶切位点，EcoR和Hind识别序列及切点分别为GAATTC，AAGCTT。EcoRHindEcoRHind 目的基因外源DNA质粒和含目的基因的外源DNA正向连接质粒 抗生素抗性基因质粒难 点 突 破 限制酶的选择：EcoR和Hind切割结果分析GAATTC CTTAAGAAGCTT TTCGAA目的基因 AATTC G A TTCGAAGCTCGGCTAAT1122正向连接：1和2连接， 1 和2连接EcoRHindEcoRHind例1、【2012年江苏

7、第32题】图图1 1表示含有目的基因表示含有目的基因D D的的DNADNA片段长片段长度（度（bpbp即碱基对）和部分碱基序列，图即碱基对）和部分碱基序列，图2 2表示一种质粒的结构表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有和部分碱基序列。现有MspMsp、BamBamH H、MboMbo、SmaSma44种限制种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为CCGGCCGG、GGATCCGGATCC、GATCGATC、CCCGGGCCCGGG。请回答下列问题：。请回答下列问题： 若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行，形成重组质粒，那么应选用

8、的限制酶是 。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加 的培养基进行培养。BamH 抗生素B例2、【2016年江苏高考33题】下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：（1 1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用用 两两种限制酶切割。种限制酶切割。BclBcl和和Hind Hind （2 2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添培养基中添加加 。四环素四环素例例3 3、【2

9、019年江苏33题】下图是某基因工程中构建重组质粒的过下图是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒程示意图，载体质粒P0P0具有四环素抗性基因（具有四环素抗性基因（tettetr r) )和氨苄青和氨苄青霉素抗性基因（霉素抗性基因（ampampr r）。）。 为了筛选出转入了重组质粒的菌落，应在筛选平板培养为了筛选出转入了重组质粒的菌落，应在筛选平板培养基中添加基中添加 。 氨苄青霉素123456789添加氨苄青霉素的培养基添加四环素的培养基平板影印培养法基因表达载体的构建概念图基因表达载体的构建使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体的组成目的基因启动子终止子标记基因复制原点目的RNA聚合酶识别和结合部位终止转录鉴别和筛选导入目的基因的受体细胞DNA复制起点基因工程的核心意义作用作用作用作用