PCR自测题.doc

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1、PCR自测题一、名词解释1.PCR 2.变性3.退火4.延伸5.逆转录PCR6.停滞效应7.共享引物PCR8.多重PCR9.反向PCR10.原位PCR11.LCR二、单项选择题1PCR反应中，所设计引物的长度一般为（ ） A510核苷酸 B. 1530核苷酸 C. 30个核苷酸C 引物设计时GC含量在引物中一般为4555D 按经验，引物自身存在的连续互补序列一般不超过3个碱基E 两个引物之间不应存在互补序列，尤其避免3端的互补重叠F 引物的3端可以游离而不影响PCR反应的进行6. 以下关于PCR的说法正确的是（ ）A PCR的模板可以是DNA也可以是RNAB PCR的模板必须从组织细胞中分离出

2、来C PCR反应的特异性取决于引物和模板DNA的结合位点。D PCR反应初期，目的DNA片断的增加呈指数扩增。E PCR反应一般需要含102105拷贝的模板7以下关于PCR反应条件错误的是（ ）B PCR缓冲液中加入二甲基亚砜有利于破坏模板的二级结构，提高反应的特异性。C Mg浓度过高会降低TaqDNA酶的活性，Mg浓度过低又会使酶催化非特异性扩增增强。D 4种dNTP应以等摩尔浓度配制，以减少错配误差。E 引物浓度一般为0.5-1umol/L8. PCR反应时应设立哪种对照（ ）A.阴性对照B.阳性对照C.试剂对照D.以上答案都正确9. 逆转录反应体系包括（ ）B. RNA模板，四种dNTP

3、C. RNA酶抑制剂D. 合适的缓冲液体系E. 逆转录酶F. 寡聚胸腺嘧啶核苷酸引物10. 有关PCR的模板说法正确的是 ( )A. 模板可以是DNA也可以是RNAB. 大多数PCR反应中对DNA模板纯度要求不高C. 模板用量低D. 标本处理的基本要求是除去杂质11. 以下有关RT-PCR反应的说法你认为正确的有( )A. 反应体系一般有20l B. 反应体系中有缓冲液, 四种dNTP, MgCl2, DTT, 牛血清白蛋白, Oligo(dT)引物RNA模板和逆转录酶C. 逆转录于42进行,随后即进行PCRD. RT-PCR的最终反应过程依然是以DNA为模板的PCR反应12. PCR的产物累

4、积的特征是( )B. 反应初期,目的DNA片断呈指数扩增C. PCR进行到一定时间出现反应中的停滞效应D. 到达平台期的的PCR循环数取决于反应体系中酶的耗竭程度E. PCR平台期的出现多数不可避免F. 到达平台期时若扩增目的DNA片断不足,可继续加入模板,酶和缓冲液进行PCR反应13. 有关Mg2+在PCR中的作用说法不正确的是( )A. Taq DNA 酶的活性维持需要Mg2+B. Taq DNA酶的活性与反应体系中的Mg2+总浓度有关C. Mg2+过低,酶催化非特异性扩增增加D. Mg2+过高会降低酶的活性E. 总量应低于dNTP的量, 常用1.5mmol/L14. PCR中使用的底物d

5、NTP应该是( )A. 使用前应将pH值调至7.0-7.5B. dNTP浓度高可以加快反应速度,但却增加了出错率C. 降低反应速度可以提高反应特异性D. PCR中, 4种 dNTP必须按一定比例配制E. Mg2+会与dNTP结合,应注意二者浓度之间的关系15. Taq DNA酶的特点是( )A. 75-80时具有最高的聚合酶活性B. 活性的维持需要Mg2+的参与C. Taq DNA酶和klenow片断一样具有校正功能D. Taq DNA酶的忠实性很高E. 具有类似末端转移酶的活性16. 有关引物的说法正确的是( )A. 引物浓度一般为0.1-1.5mol/LB. 引物与模板的的比至少为108:

6、1C. 引物浓度过高会引起错配和非特异扩增,降低扩增效率D. 引物Tm值位于55-80较理想17. PCR反应温度应该是( )A. 为使DNA变性完全,变性温度越高,时间越长越好B. 按模板DNA的复杂程度来调整变性温度和变性时间C. 于反应管中加入1-2d 石蜡油防止反应液的蒸发D. 温度越高时间越长, dNTP破坏增加,对PCR反应产生不利影响18.有关退火温度正确的是( )A. 引物与模板退火温度一般在45-55B. 退火温度过低,使非特异扩增增加C. 退火温度过高, PCR扩增含量下降D. 退火时间一般为1-2分钟E. Tm值的允许范围内,应该选择较低的退火温度19.延伸温度应有如下特

7、点( )A. 一般为72B. PCR延伸时间越长, 产物的得率越高C. Taq DNA酶在延伸温度时有较高的酶活性D. PCR延伸时间根据待扩增片断的长度而定20.PCR循环次数设定时应注意( )B. 应由最初靶分子浓度而定C. 理论上20-25个循环后, PCR产物累积达最大值D. PCR的循环次数一般为25-30次E. 循环次数过多时会引起停滞效应21.PCR样品制备时应注意( )B. 应有专门的区域制备模板C. 提取DNA样品和RNA样品时要带手套且经常更换D. 纯化样品对污染有极大的影响E. 普通分子克隆工具不能用做样品的处理和靶序列F. 提取核酸所用的试剂要求新鲜配制或者适当储存未经

8、使用的试剂.22.操作中应该注意( )A. 使用的溶液应该没有核酸,核酸酶B. 试剂水都是高质新鲜蒸馏水C. 工具(枪头,试管) 都是一次性并且高压灭菌D. 应有专门的操作区E. 试剂应该分装保存23. PCR反应总为阴性时应该( )A. 增加Taq DNA酶的浓度B. 增加靶DNA的量C. 增加扩增循环或者降低退火温度D. 提纯样品E. 取10l扩增液再行PCR24. PCR反应出现非特异产物时,应该采取的措施是( )A. 增加退火温度B. 降低Taq DNA酶浓度C. 减少退火及延伸时间D. 减少引物浓度E. 减少扩增循环次数25.PCR可以广泛应用于( )A. 遗传性疾病的基因诊断B.

9、检测癌基因C. 检测病原微生物D. 法医鉴定E. DNA序列测定26.对RNA的体外扩增过程,描述正确的是( )A. 分为循环相和非循环相B. 也具有变性,复性,延伸三步C. 反应体系中含有dNTP和NTP两种类型的核苷酸D. 反应中含有两种特异性引物E. 待测RNA作为模板进入循环相27.RNA-PCR技术的特点为( )A. 扩增效率高B. 扩增时间短C. 特异性不强D. 需严防DNA的污染28.下列说法错误的是( )C. RNA-PCR中, 非循环反应与循环反应不处在同一反应体系D. RNA-PCR中,扩增产物以2的指数递增E. 反应温度一般为37-42, 时间一般为30分钟到1小时F.

10、RNA-PCR需采用25个循环达到需要量G. 依赖于逆转录酶, RnaseH和T7RNA聚合酶共同作用29. 利用PCR技术测序有下列哪几种方法( )A. 双链直接测序B. 基因扩增转录测序C. 不对称PCR产生单链测序D. 双链克隆后测序 四、填空题1. PCR反应体系含有 ， ， ， 。2. PCR反应的基本过程为 , ,3. 引物与模板的退火温度一般为 ，延伸温度一般为 4. PCR循环次数一般设定为 ，过多的循环次数会导致 的出现。5. ， ， 可用于LCR产物的检测。6. 引物3端最佳碱基选择是 和 。7. PCR的标本处理的基本要求是 8. PCR的反应体系一般选用 。9. PCR

11、反应的缓冲液提供了PCR反应 与 常用的为 10. PCR的反应体系中，Mg2的浓度一般保持在 ,常用的是 11. TaqDNA聚合酶具有 ，缺乏 因此无 。12. 在变性过程中，为防止反应液的蒸发，可在反应管中加入 13. PCR反应时应设立以下实验对照： , , .14. 定量PCR必须设立 五、简答题1、简述PCR反应的基本步骤。2、简述PCR模板的种类及制备方法。3、简述PCR产物的积累规律。4、简述PCR的基本反应。5、简述PCR实验应注意的事项。6、简述连接酶链反应的基本原理。7、简述RNA体外扩增的特点。六、论述题1、试述PCR的基本原理及引物设计原则。2、试述PCR技术的特点。

12、3、试述PCR反应条件的优化。4、试述PCR的主要类型及其工作原理。参考答案及题解一、名词解释1、PCR: 即聚合酶链式反应。在模板，引物，4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异性地扩增位于两段已知序列之间的DNA区段地酶促合成反应。2、变性：于PCR反应体系中，通过加热使温度至95左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应模板。3、退火： PCR反应中，经变性后将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA模板互补区域结合，形成杂交链的过程。4、延伸：当反应体系温度升至70左右时，TaqDNA聚合酶催化以引物为起始点的53延伸反应，形成新生DNA链。5、逆转录PCR：以

13、mRNA为原始模板进行的PCR反应。6、停滞效应：PCR中后期，随着目的DNA扩展产物逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，DNA扩增产物的增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。7、共享引物PCR：利用3条引物扩增两种不同的DNA序列，其中一条引物与两种待扩增序列都互补，它与另两条引物分别组成两对PCR引物，此种PCR常用于细菌学鉴定，确定同一种属细菌的不同种类。8、多重PCR：在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中不同序列的PCR过程。9、反向PCR：利用连接酶将一段未知序列两端连接成环状，利用单一限制酶原点切开已知序列，据已知序列的碱基顺序设计3端和5端引物扩增未知序

14、列。10、原位PCR：以组织固定处理细胞内的DNA或者RNA作为靶序列，进行PCR反应的过程，不必从组织细胞中分离模板DNA或RNA。11、LCR：连接酶链反应，又称连接酶扩增反应，是以DNA连接酶将某一DNA链的5磷酸与另一相邻链的3羟基连接为基础的循环反应, 特点是能准确分析基因序列中的单个碱基突变。二、单项选择题1、B PCR的引物设计长度一般为1530个核苷酸，过短影响PCR特异性而过长却会提高相应的退火温度，并使延伸温度TaqDNA聚合酶的最适温度，影响产物的生成 2、C 含量过低，反应的特异性不高。但是含量太高又会使引物的Tm值升高，不利于PCR反应的进行3、D 引物的3端碱基是延

15、伸的起点，必须与模板严格配对结合，但是5端的的碱基可以游离，而不影响引导新生DNA链合成4、A 5、C TaqDNA聚合酶活性与反应体系中的游离Mg2+浓度相关6、D LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5磷酸与另一相邻链的3羟基连接为基础的循环反应, 特点是能准确分析基因序列中的单个碱基突变7、A 原位PCR不必从组织细胞中分离模板DNA或RNA,经扩增后，大部分产物留在细胞内，再可以结合原位杂交或者PCR标记引物的显色技术而广泛应用于组织胚胎学和肿瘤学的研究8、C Tm4（G+C）2（A+T）9、B TaqDNA聚合酶缺乏35外切酶活性，因而没有校正功能10、C 锚定PCR首先通过分离细

16、胞的总RNA或mRNA，逆转录生成cDNA，后在cDNA3末段加上poly尾。再通过poly锚定引物和与cDNA特异配对的引物共同进行PCR扩增11、B 多重PCR可以扩增一份DNA样品中的不同序列，因此可以检测是否存在某些基因片段的缺失和突变。12、B PCR反应中，四种dNTP必须等摩尔浓度配制，以减少反应的错配率并提高使用效率。13、C Taq DNA聚合酶具有末端转移酶的功能, 能催化dNTP加到DNA的3-OH端, 但对dNTP的聚合能力不同, 对dATP的聚合能力高于其他三种核苷酸,故而PCR的产物末端总是带有两个A.14、D PCR扩增位于两个特异性引物之间的DNA片断, 扩增的

17、特异性由引物特异性来决定. PCR反应本身符合酶促反应动力学, 是一种酶促反应15、C Taq DNA聚合酶具有良好的热稳定性, 广泛应用于PCR反应.16、C PCR反应的特异性由引物的特异性决定, 它特异地扩增位于两个引物间的DNA片断.17、C LCR需要设计两对引物, ,采用DNA连接酶,将某一DNA链的5磷酸与另一链的3羟基连接.它并不具有PCR的高度敏感性.三、多项选择题1.A B 在Tm值允许的范围内，选择偏高的退火温度可以减少引物和模板的非特异性结合，提高PCR反应的特异性；退火时间一般选择30秒1分钟，足以使引物和模板结合完全2.A B C D 隔离不同的操作区, 分装试剂，

18、减少重复取样所致的误差, 严格实验操作污染, 设立实验对照3.A B4.A B C D E5.B C DA PCR的引物设计长度一般为1530个核苷酸，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度TaqDNA聚合酶的最适温度，影响产物的生成。 引物的3端碱基是延伸的起点，必须与模板严格配对结合6. A C D E 原位PCR无需从组织细胞中分离模板7.B DB Mg浓度过低会降低TaqDNA酶的活性，Mg浓度过高又会使酶催化非特异性扩增增强。引物浓度一般为0.1-0.5mol/L8. A B C D9. A B C D E10. ABCD PCR反应的模板可以是DNA,也可以是RNA(先逆转录生成c

19、DNA, 后行PCR反应), 大多数用途的PCR对DNA模板的要求并不严格(大量的实验数据表明存在一定量的蛋白质或者SDS对实验过程影响不大),并且模板用量很低但依然要达到一定的水平.对于PCR的标本处理最基本的就是出去杂质.11.AD 反应体系中应该还包括RNA酶抑制剂, 当逆转录反应于42进行后,应该将反应混合物加热再955分钟,灭活逆转录酶,然后取2l反应产物行以DNA为模板的PCR反应12. BD PCR的扩增过程遵循酶的催化动力学原理,在PCR的反应初期, 目的DNA片断呈指数扩增, 随着目的DNA产物的积累,酶的催化反应趋于饱和,出现平台期.并且到达平台期所需的PCR循环数目取决于

20、样品中模板的拷贝数,PCR扩增效率,DNA聚合酶的种类和活性,以及非特异产物的竞争等因素.13.BCDE Mg2+过低,会显著降低酶的活性, 过高又使酶催化非特异性扩增增强, Taq DNA酶的活性与反应体系中的游离Mg2+有关, 而Mg2+又和引物,模板,dNTP分子中的磷酸基团结合从而使游离Mg2+浓度下降,所以Mg2+的总量应该高于dNTP的量.14.ABCE PCR反应中,应该使四种dNTP等摩尔浓度配制,以减少错配误差和提高使用效率15. ABE TaqDNA酶没有3-5的外切酶活性因而没有校正功能.并且TaqDNA酶体外扩增DNA的忠实性是所有已知忠实性的DNA聚合酶中最低的.16

21、. BCD 引物的浓度一般是0.1-0.5mol/l17. BCD 变性温度过高时间过长, TaqDNA酶容易失活, dNTP破坏增加,对PCR反应产生不利影响18. ABC 在Tm值的允许范围内,选择偏高的退火温度可以减少引物与模板之间的非特异结合,提高PCR反应的特异性,退火时间一般为30秒至1分钟.19.ACD 延伸时间过长易发生非特异性扩增20. ABCD 理论上20-25次循环后PCR产物累积达最大值,但是实际上每次PCR产物得率达不到100%, 所以一般设定为25-30次21.ABCDE22. ABCDE23.ABCDE24. ABCDE25.ABCDE26.ACD RNA的体外扩

22、增不需经过变性,复性; 并且进入循环相的是反义RNA.27.AB RNA-PCR技术的特异性很强,由于只有4-6次循环, 错配率减低了很多. 并且因为反应没有热变性,所以双链DNA不能作为模板扩增, 所以不必防止DNA的污染28.ABD RNA-PCR中,循环相和非循环相处于同一反应体系,产物的扩增以10的指数递增,所以只需要4-6次循环即达到所需量.29. ABCD四、填空题：4 耐热的TaqDNA聚合酶，化学合成的寡核苷酸引物，四种dNTP，合适的缓冲液体系。5 变性，退火， 延伸6 4555， 727 2530次， PCR反应“平台效应”。8 核素标记法，荧光素标记法，地高辛标记法9 G

23、，C。10 除去杂质，并部分纯化标本中的核酸11 50100ul。12 合适的酸碱度，某些离子，1050mmol/L的Tris-HCl（室温 pH 8.38.8，72时为pH 7.2）。13 0.22.5mmol/L, 1.5mmol/L14 53聚合酶活性， 35外切酶活性，校正功能。15 12滴液体石蜡16 阳性对照，阴性对照，试剂对照17 内参照五、简答题1. PCR反应的基本步骤包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。（1）变性（denaturation）：加热使双链DNA变为单链;（2）退火（annealing）：当温度降至引物的Tm值左右或以下，引物与DNA模板互补区结合，形成杂

24、交链，这一过程称退火。当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA的分子数大大超过模板DNA的分子数，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少；（3）延伸（extension）：耐热DNA聚合酶按53方向催化以引物为起始点的延伸反应。1、2. DNA和RNA均可作为PCR的模板。DNA可以直接作模板加入反应体系进行扩增，RNA的扩增需要逆转录为cDNA后才能进行PCR扩增，故又称这种扩增方式为RT-PCR。DNA模板的制备通常采用去垢剂破坏细胞，除杂质，乙醇沉淀核酸或水煮沸溶解细胞。RNA模板的制备可采用RNA提取试剂盒、酸性硫氰酸

25、胍-酚-氯仿法、异硫胍氯化铯密度梯度分离法、SDS-酚-氯仿法。制备RNA模板时，要注意防止RNA水解。3. PCR产物的积累规律：PCR反应过程遵循酶促动力学规律。在反应初期，反应产物以指数方式累积。随着反应的进行，体系中的各成分的比例发生变化，扩增速度逐渐放慢。反应后期，酶的催化反应趋于饱和，反应曲线出现拐点而进入反应的“平台期”。达到平台期所需的PCR循环次数取决于反应体系中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶的种类和活性、引物质量、以及非特异性扩增条带的竞争等诸多因素。4.（1）以DNA为模板的反应：反应体系一般选用50100l体积；其中含有缓冲液、MgCl、明胶或牛血清白蛋白、

26、引物、4种dNTP、模板DNA、TaqDNA聚合酶。封上矿物油防止高温反应时液体的挥发，即可进行PCR反应。（2）以mRNA为模板的反应：以mRNA为原始模板进行的PCR反应称为逆转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)。首先将mRNA逆转录生成cDNA，然后再进行PCR反应。逆转录反应体系一般选用20l体积，其中含有RNA酶抑制剂、缓冲液、种dNTP、MgCl2、DTT、牛血清白蛋白、oligo(dT)12-18引物，RNA模板、逆转录酶。逆转录反应在42进行，随后将反应混合物加热在95，5分钟，灭活逆转录酶。取2l反应产物，按DNA为模板的PCR反应

27、步骤、进行扩增反应。5. 由于PCR反应极强的扩增能力和检测的灵敏性，微量样品污染便有可能导致假阳性结果的出现。为此在实验操作中应谨防污染的发生，并设置严格的对照，以提高PCR结果的正确性。在有条件的情况下，PCR实验室应设.样品制备区、PCR操作区及反应产物分析区；在进行PCR反应时，应设阳性对照、阴性对照和试剂对照；扩增反应总是阴性结果（无产物）时应采取的措施：取10l扩增混合液作模板再进行PCR扩增；增加TaqDNA聚合酶的浓度；增加靶DNA的量；若模板为粗制品，提纯样品；增加扩增循环次数；适当降低退火温度；出现非特异性产物时应采取的措施：增加退火温度；减少TaqDNA聚合酶的浓度；减少

28、退火及延伸时间；减少引物浓度；减少扩增循环次数。6. LCR的基本原理是设计两对引物，分别与模板双链DNA分子的一条链互补。然后用连接酶将两邻接的引物连接起来，如果模板链没有碱基突变，那么引物就可以与模板完全互补，两引物就通过磷酸二酯键连接成为下轮扩增的模板，如果模板链上有突变，在两个引物的连接处有一个或多个碱基不能配，那么两条引物就不被连接。因此没有连接产物就表明靶分子上至少有一个不配对碱基对。7. RNA体外扩增特点：（1）反应中不需对核酸进行变性与复性；（2）其原理与PCR相似，反应分非循环相与循环相；（3）依赖于逆转录酶，RNase H和T7RNA聚合酶的共同作用；（4）反应体系中含两

29、种特异性引物，分别用A，B表示，其中引物A含T7RNA聚合酶识别的启动子，它与待测RNA的3端序列互补，引导合成cDNA的第一链。引物B与cDNA第一链的3端序列互补，如果打算扩增全长的RNA，则引物B的序列与原始RNA的5端序列一致。5.反应体系中含有dNTP和NTP两种类型的核苷酸，dNTP用于合成cDNA，NTP用于合成RNA。六、论述题1. PCR技术又称聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）技术，是一种在体外（试管、切片）扩增核酸的技术。该技术模拟体内天然DNA的复制过程。其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两

30、段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。PCR作为一个体外酶促反应，其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。引物设计一般遵循下列原则：（1）引物长度一般为1530个核苷酸。（2）碱基随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。G+C的含量为4555%。3端和5端引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54C。（3）避免发夹结构形成，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过

31、3bp。（4）两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3端的互补重叠。（5）引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。（6）引物3端碱基一定要与模板DNA配对，最佳碱基选G和C。（7）引物的5端可以修饰，如加限制酶位点，引入突变位点，起始密码子，终止密码子等。2. PCR技术的特点：1）操作简便：完全自动化的操作，在循环期间，无须专人守侯，非常方便。（2）省时：一个PCR反应周期，包括9495变性3060秒5065退火3050秒7075延伸5090秒；再加上预变性510分钟最后一次循环后在7075继续延伸10分钟，假设n=30个循环完成后，一般只需要22.5小时，就可完成扩增反应。（3）灵敏度高：从理论上讲，一根头发，一个精细胞，一个二倍体细胞内的DNA都可得到扩增。单个细胞的PCR技术现已广泛地被采用。一般，PCR反应中模板的加入量约为102拷贝的靶序列,就可以进行PCR 反应。（4）特异性强：特异性是指PCR发生错误引发的频率，特异性还反映了导致无关扩增产物的错配发生的频率。PCR反应只是在一对引物之间引发，因此，对反应液进行核酸电泳时，只能得到一条清晰的确定大小的条带。（5）模板材料易获得：许多标本均能用于PCR反应，如细