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1、植物组织中过氧化氢酶的活性测定紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【仪器与用具】 紫外分光光度计;冷冻离心机;研钵;容量瓶;刻度吸管;恒温水浴;分析天平【试剂】1. 0.05mol/L pH7.0磷酸缓冲液2. 0.2mol/L H2O2溶液:30% H2O2 11.36ml溶于磷酸缓冲液中,定量至250ml。3.0.05 mol/LTris-Hcl缓冲液(pH7.0)【材料】正常生长或经逆境处理的新鲜植物组织【方法步骤】 1.酶液提取:称取剪碎混匀的植
2、物样品(如叶片等)1.00g置与预冷的研钵中,加入适量预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂冰浴研磨成匀浆后,转入10ml容量瓶中,并用缓冲液冲洗研钵数次,合并冲洗液,并定容到10ml。取提取液5ml于离心管中,在4、15000g下离心15min,上清液即为过氧化氢酶粗提液。4下保存备用。2.CAT活性测定(1)取10ml具塞试管,加2ml酶提取液于沸水浴中加热煮死,冷却备用。(2)取10ml具塞试管,3支为测定管(3个重复),1支为对照,按下表加入试剂:表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表管 号S1S2S3S4Tris-Hcl1.01.01.01.0粗酶液(ml)0.10.10.1
3、0.1(煮死酶液)蒸馏水(ml)1.7(4)1.7(4)1.7(4)1.7(4) 将上述4支试管于25水浴中预热3min后,逐管加入0.2ml 0.2mol/L的H2O2溶液,每加完一管立即在紫外分光光度计上测定A240(蒸馏水调零),每隔30s读数一次,共测3min,记录4支试管的测定值。(需用石英比色杯) 3.结果计算: 以1min内A240降低0.1(三支测定管的平均值)的酶量为1个酶活单位(u),先求出3支测定管各自1min内A240降低值,按下式计算CAT活性。 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=式中 A240 = AS0(+As3)AASS123+ AS0加入煮死酶液的对照管吸
4、光值; AS1, AS2,As3样品测定管吸光值; Vt酶提取液总体积(ml); V1测定时用酶液体积(ml); FW样品鲜重(g); 0.1A240每下降0.1为1个酶活单位(u); t加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。 【注意事项】 凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。【思考题】 1.影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?2氧 氢关有生活与酶些些素紫测外酶化收影题扰干验对收有 】意 ) 时后氢氧加 ) 活个 降每 0 )品 )积液测 ) 体取 值吸测 值吸对液入 ) ( 具与性活氢过即度的量测降时反) 吸溶使氧过酶氧吸有波 在 理= 外 ) 光 性活冷化 离性性 ;计,降; 自定; 先度 (酶;量)均管浴测.降析 天内 :计. 杯比用。测管 ,一0每零馏0 上光分即一加液 的 .加逐 热中水管支述 ( ( (液煮. . 置配 测外 -剂剂表照为,个(定 管 取用备冷煮浴液酶 管具 取测测用存下 酶氧为上 下0 、中离 取取 容并洗合钵冲缓,瓶 后浆研砂少液磷 量加钵冷与0 叶如植混取:液 】步组组鲜理经长料0 缓 0至,冲缓于 液 冲酸0 0剂