5.2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 课件 （32张PPT）.pptx

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1、资料一：刑侦破案杀手锏法医DNA鉴定技术，需要用到大量凶手DNA。资料二：肝炎病毒感染初期症状并不明显，抽取的血液中病毒含量也很少，在检测技术比较落后的时期常常造成误诊。资料三：新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测、新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测。新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒是用于快速进行体外定性检测新型冠状病毒(RdRp基因、N基因、E基因)的医疗检测用品。它的工作原理是通过提取病人样本中的RNA，进行反转录聚合酶链反应(RT-PCR)，通过扩增反应将样本中微量的病毒信息进行放大，最后以荧光的方式读取信号。如果PCR之后信号为阳性，那么就可以认为样本中存

2、在病毒(已经感染)，反之表明样本中没有病毒(未感染)。资料四：在刑事侦破案件或遗传病的诊断过程中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。现在PCR技术已广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和基因测序。,专题5DNA和蛋白质技术课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段,华师附中汕尾学校杨宇涛,一、基础知识,（一）PCR原理1.多聚酶链式反应（PCR）：一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。2.细胞内

3、的DNA复制（回顾）DNA的基本单位：脱氧核糖核苷酸DNA分子的结构：,含氮碱基,磷酸,5,DNA的羟基(-OH)末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端。,3,3,5,5,一、基础知识,（一）PCR原理2.细胞内的DNA复制（回顾）DNA的基本单位：脱氧核糖核苷酸DNA分子的结构：（两条链）反向平行，双螺旋结构DNA复制的时间：发生在有丝分裂的间期和减数第一次分裂间期DNA复制的场所：细胞核（主要）、线粒体、叶绿体DNA复制的特点：边解旋边复制、半保留复制、多起点复制,一、基础知识,（一）PCR原理2.细胞内的DNA复制（回顾）DNA复制的条件,打开DNA双链,提供DNA复制的模板,合成子链的

4、原料,催化合成DNA子链,工作需要消耗ATP,催化脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键,不能从头开始合成，只能从3端延伸DNA链,子链只从引物3端开始延伸；子链的合成方向总是5端向3端。,使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸,作为DNA复制的起点,一、基础知识,（一）PCR原理3.PCR(体外的DNA复制)的条件DNA分子的热变性原理在80-100的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链重新结合成双链，这个过程称为复性。,一、基础知识,（一）PCR原理3.PCR(体外的DNA复制)的条件耐高温的TaqDNA聚合酶高温解决了打

5、开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。自然引物（细胞内的DNA复制）：RNA引物人工引物（PCR）：DNA单链（主要）或RNA分别与两条模板链相结合的两种引物（引物和引物）,一、基础知识,（一）PCR原理3.PCR(体外的DNA复制)的条件控制温度，但不需解旋酶；DNA模板；四种脱氧核苷酸；耐高温的聚合酶（TaqDNA聚合酶）；分别与两条模板链相结合的两种引物（引物和引物）；需要在一定的缓冲液中进行。,一、基础知识,（二）PCR的反应过程1.PCR的反应步骤：一般要经历三十多次循环，每次循环分

6、为变性、复性和延伸三步2.循环过程变性解旋，94,一、基础知识,（二）PCR的反应过程1.PCR的反应步骤：一般要经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸三步2.循环过程变性解旋，94复性引物与模板链结合，55,不考虑模板链重新结合：模板DNA比引物复杂的多；加入引物的量足够多而模板链数量少；引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。,一、基础知识,（二）PCR的反应过程1.PCR的反应步骤：一般要经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸三步2.循环过程变性解旋，94复性引物与模板链结合，55延伸DNA新链由5端向3端延伸（引物端为新链5端），72（TaqDNA聚合

7、酶最适温度）,第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序列,5,引物,5,引物,5,5,模板DNA,2530次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。,引物数=新增单链数=22n-2,5,引物,5,引物,5,5,模板DNA,引物,引物,一、基础知识,（二）PCR的反应过程1.PCR的反应步骤：一般要经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸三步2.循环过程变性：解旋，94复性：引物与模板链结合，55延伸：DNA新链由5端向3端延伸，723.PCR的反应结果从第二轮循环开始，前一轮循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的

8、延伸。DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，等长DNA从第三轮循环开始出现，这段固定长度的序列呈指数扩增。,例：PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是（）PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNAPCR过程不需要DNA聚合酶PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制ABCD,C,例：PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物延伸而成的DNA单链作模板时将（）A仍与引物结合进行DNA子链的延伸B与引物结合进行

9、DNA子链的延伸C同时与引物和引物结合进行子链的延伸D无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链,B,解析：当有引物延伸而成的DNA单链做模板时，此单链引物端为5端，与它互补的子链此端为3端，因此新子链应从另一端开始合成，即由引物结合延伸DNA的子链。,二、实验操作,（一）设备与用具1.PCR仪一台能够自动调控温度的仪器2.微量离心管进行PCR反应的场所，一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3.微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次,（二）实验操作步骤,二、实验操作,准备移液混合离心反应,（二）实验操作步骤,二、实验操作,准备移液混合离心反应,按照PCR反应体

10、系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。p62（PCR反应体系的配方）,（二）实验操作步骤,二、实验操作,准备移液混合离心反应,用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。,（二）实验操作步骤,二、实验操作,准备移液混合离心反应,过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。注意：A.离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。B.手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。,（二）实验操作步骤,二、实验操作,准备移液混合离心反应,过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。,（二）实验操作步骤,二、实验操

11、作,准备移液混合离心反应,将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。,以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率,（二）实验操作步骤,二、实验操作,准备移液混合离心反应,【注意事项】,避免外源DNA等因素的污染,隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；,分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头。,例：在PCR实验操作中，下列说法不正确的是()A在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头B离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢C用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合D离心的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果,A,三、课题成果评价,（一）理论上DNA扩

12、增数目的计算1.一条DNA，复制n次，DNA为2n2.a条DNA，复制n次，DNA为a2n,三、课题成果评价,（二）实验中DNA含量的测定1.原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关2.过程稀释：2LPCR反应液，加入98L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零,三、课题成果评价,（二）实验中DNA含量的测定1.原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关2.过程测定

13、：取DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值计算：DNA含量（g/mL）50(260nm的读数)稀释倍数50（常数）：1g/ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02,紫外分光光度计,比色杯,B,1如图表示细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增两个过程，两反应过程的条件中相同的是()A模板B原料C酶D能量供应,解析：本题主要考查细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增的知识，意在考查考生对细胞内外DNA复制条件的理解。选项A模板不同，胞内DNA复制以整个DNA分子作为模板，PCR扩增却以一段目的DNA作为模板。选项B原料相同，均以4种脱氧核苷酸为原料。选项C酶不相同，胞内DN

14、A解旋需要解旋酶，延伸需要DNA聚合酶等；胞外PCR扩增通过高温解旋而不需要解旋酶，延伸只需热稳定的TaqDNA聚合酶。选项D能量供应不同，胞内DNA复制过程由ATP提供能量，而PCR扩增主要由外界供能。,D,2下列关于PCR的描述中，正确的是()PCR是一种酶促反应引物决定了扩增的特异性扩增DNA利用了热变性的原理扩增的对象是氨基酸序列ABCD,解析：PCR技术的概念是PCR全称为多聚酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，原理是DNA复制，前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物，条件还包括模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)，具体过程有高温变性：DNA解旋过程；低温复性：引物结合到互补链DNA上；中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。,