人类免疫缺陷病毒抗体检测作业指导书.doc

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1、人类免疫缺陷病毒抗体检测作业指导书（ELISA）1. 原理在微孔条上预包被纯化基因工程人类免疫缺陷病毒I型和II型（HIV-1/HIV-2）抗原（合成肽或基因重组蛋白），采用双抗原夹心法检测血清或血浆中人类免疫缺陷病毒抗体。样品加入包被抗原反应孔，在随后的温育过程中，若样品中含特异抗体，则该抗体与包被抗原形成抗原抗体复合物被吸附到固相，再加入酶标记的HIV-1/HIV-2抗原，最终形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，洗涤除去未结合的游离酶，加入显色剂后显色。2. 标本采集2.1 采集前病人准备：受检者应空腹2.2 标本种类：血清或血浆2.3 标本要求：采集病人静脉血2ml（可用EDTA抗凝），室温

2、放置不超过4小时，分离血清备用。3. 标本储存：2-8C保存不应超过48小时，-20C不应超过3个月，-70C 长期保存，应避免反复冻融。4. 标本运输：密封，室温运输。5. 标本拒收标准：污染、标本量不足、严重溶血或脂血标本不宜作此项检测。6. 试剂6.1 试剂名称：人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒6.2 试剂生产厂家：珠海丽珠试剂有限公司。6.3 包装规格：96Test/Kit6.4 试剂盒组成：包被反应板，HIV酶标记物，阳性对照血清，阴性对照血清，浓缩洗涤液，底物A，底物B，终止液，封口膜，密封袋。6.5 试剂储存条件及有效期：2-8C避光保存，有效期6个月。7. 仪器设备7.1 仪器名

3、称：自动酶标仪7.2 仪器厂家：KBB7.3 仪器型号：ST-3608. 操作步骤8.1 平衡：将试剂盒各组分取出，平衡至室温（18-25C），微孔板开封后，余者及时以自封袋封存。8.2 配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。8.3 编号：将微孔条固定于支架，按序编号。8.4 加样：用加样器在微孔反应条板孔中加入样品50ml；空白孔不加任何液体；阴性对照孔和阳性对照孔，每孔分别加入阴阳对照各50ml，标好位置。对照应在所有标本加完以后再加，以保证阈值准确性。8.5 温育（一）：充分混匀，加上封板膜，置37温育30分钟。8.6 洗

4、涤（一）：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。8.7 加酶：分别在每孔中加入酶标记物50ml，轻拍混匀。8.8 温育（二）：充分混匀，加上封板膜，置37温育30分钟。8.9 洗涤（二）：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。8.10 显色：每孔加入底物A、B各50ml，轻拍混匀，置37暗处20分钟。8.11 终止：每孔加终止液50ml，混匀。8.12 测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各孔OD值（用单波长测定时需设空白对照一孔，30分钟内完成测定，并记录结果）。9. 结果判断与分析9.1 临界值（C.O

5、.）的计算：临界值0.15阴性对照平均OD值。9.2 结果判定：样品OD值S/C.O=1者为阳性样品OD值S/C.O1者为阴性9.3 正常时，阴性对照OD值应=0.80，阴性对照若小于0.08以0.08计算。9.4 若阳性对照OD值超出正常范围或其孔间之差大于30%，应重复试验。9.5 初次试验阳性者应重新取样进行双孔复试，按全国HIV检测管理规范的要求，须将血样或重新采血送HIV确认实验室做确认试验，确认报告阴性者，血可以发放使用；凡确认实验阳性和可疑者，血不能发放使用，统一送确认实验室处理。10. 质量控制：每次测定均做双孔或以上复试；阴阳对照OD值应在要求范围内。11. 参考范围：阴性1

6、2. 临床意义：在血清中HIV抗体的存在表明可能有人类免疫缺陷病毒感染。13. 操作性能：灵敏度、特异性高。14. 方法局限性14.1 只能用作HIV抗体检测的初筛试验。14.2 样品显色深浅与样品中抗体的含量没有一定正相关。15. 病危报警值的处理：初次试验阳性者应重新取样进行双孔复试，按全国HIV检测管理规范的要求，须将血样或重新采血送HIV确认实验室做确认试验；通知防保科和临床申请医生。16. 注意事项16.1 试剂的使用：整个检测工作必须符合全国艾滋病检测工作规范中应严格防止交叉感染，操作时必须带手套，穿工作衣，严格健全和执行消毒隔离制度。所有样品，洗弃液和各种废弃物都应按传染物处理。

7、16.2 HIV-1/HIV-2抗体测定结果的判定必须以酶标仪读数为准。 16.3 样品、酶结合物溶液等应用加液器加注，并经常校对其准确性。16.4 洗涤时各孔均需加满液体，防止孔口有游离酶不能洗静。16.5 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。16.6 微孔板条从冷藏环境中取出时应在室温中平衡至潮气干尽方可使用；未用完者须放入有干燥剂的密封袋中保存。16.7 用于检测的样品应保持新鲜。16.8 剩余样品及废弃物应经121摄氏度高压蒸汽灭菌30分钟，或用5.0g/l次氯酸钠等消毒剂处理30分钟后废弃。16.9 不同批号的试剂组分不可混用。16.10 本试剂的使用单位必须是经当地卫生行政部门批准的HIV初筛实验室；使用人员必须是经过培训的指定人员。17. 当检测系统（仪器）不能工作时，所采取的补救措施：应保证所有操作步骤正确无误；可以比对阴阳对照，肉眼判读；无法准确判读者，应留样待系统正常后复查。18. 参考文献：中华人民共和国卫生部医政司编。全国临床检验操作规程（第二版）。19.其它：必须按规定使用经中国药品生物制品检定所检定并贴有“检定合格“防伪标签的试剂。