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1、发酵法生产发酵法生产L L天冬酰胺酶天冬酰胺酶 学生模拟组建运营一个学生模拟组建运营一个L天冬酰胺酶生产企天冬酰胺酶生产企业,撰写计划书业,撰写计划书(在理论教学期间完成在理论教学期间完成)。 市场部:市场部:L天冬酰胺酶的结构、功能、天冬酰胺酶的结构、功能、用途,用途,L天冬酰胺酶市场状况与销售预测,天冬酰胺酶市场状况与销售预测,竞争对手状况与分析。竞争对手状况与分析。 技术部:确定技术部:确定L天冬酰胺酶生产的工天冬酰胺酶生产的工艺流程及工艺参数,编制生产操作规程,艺流程及工艺参数,编制生产操作规程,确定生产车间的布局。确定生产车间的布局。 品控部:制定品控部:制定L天冬酰胺酶的质量标天冬
2、酰胺酶的质量标准,生产取样分析操作规程,质量检测标准,生产取样分析操作规程,质量检测标准和操作规程。准和操作规程。 总经理:协调监督各部工作,最后拿总经理:协调监督各部工作,最后拿出完整的计划书。出完整的计划书。L-天冬酰酶生产工艺天冬酰酶生产工艺l一、结构与性质一、结构与性质l 由四个相同亚基组成,有由四个相同亚基组成,有222个对称轴,个对称轴,每个亚基含每个亚基含326个氨基酸残基。个氨基酸残基。l 用于儿童急性淋巴细胞白血病用于儿童急性淋巴细胞白血病 、单细胞、单细胞白血病、淋巴肉瘤、胰腺癌等。白血病、淋巴肉瘤、胰腺癌等。l 机理:机理:l 降低人体内天冬酰胺和谷氨酰胺浓度,降低人体内
3、天冬酰胺和谷氨酰胺浓度,正常细胞可自我合成,癌细胞不具备这种正常细胞可自我合成,癌细胞不具备这种能力,从而受到抑制。能力,从而受到抑制。l 性状:性状:l 白色粉末,微吸湿,溶于水,不溶于有白色粉末,微吸湿,溶于水,不溶于有机溶剂。机溶剂。l二、生产工艺二、生产工艺l1 工艺路线工艺路线l2 工艺过程及控制要点工艺过程及控制要点l(1)菌种培养菌种培养l 采取大肠杆菌采取大肠杆菌AS1-375,普通牛肉培养,普通牛肉培养基,接种后于基,接种后于37培养培养24h。 l(2) 种子培养种子培养l 16玉米浆,接种量玉米浆,接种量11.5,37通气搅拌培养通气搅拌培养48h。l(3)发酵罐培养发酵
4、罐培养l 玉米浆培养基,接种量玉米浆培养基,接种量8,37通气通气搅拌培养搅拌培养68h,离心分离发酵液,得菌体,离心分离发酵液,得菌体,加加2倍量丙酮搅拌,压滤,滤饼过筛,自然倍量丙酮搅拌,压滤,滤饼过筛,自然风干成菌体干粉。风干成菌体干粉。 l(4) 提取、沉淀、热处理提取、沉淀、热处理l 每千克菌体干粉加入每千克菌体干粉加入0.OlmolL pH8.0的硼酸缓冲液的硼酸缓冲液lOL 37保温搅拌保温搅拌1.5h,降,降温到温到30以后,用以后,用5molL醋酸调节醋酸调节pH4.24.4进行压滤,滤液中加入进行压滤,滤液中加入0.2倍体倍体积的丙酮,放置积的丙酮,放置34h,过滤,收集沉
5、淀,过滤,收集沉淀,自然风干,即得干粗酶。自然风干,即得干粗酶。 l 取粗制酶,加入取粗制酶,加入0.3甘氨酸溶液,调节甘氨酸溶液,调节pH8.8,搅拌,搅拌1.5h,离心,收集上清液,加,离心,收集上清液,加热到热到6030min进行热处理。离心弃去沉进行热处理。离心弃去沉淀,上清液加淀,上清液加2倍体积的丙酮,析出沉淀,倍体积的丙酮,析出沉淀,离心,收集酶沉淀,用离心,收集酶沉淀,用0.01molL,pH8.0磷酸缓冲液溶解,再离心弃去不溶物,磷酸缓冲液溶解,再离心弃去不溶物,得上清酶溶液。得上清酶溶液。 l (5)精制、冻干精制、冻干l 上述酶溶液调节上述酶溶液调节pH8.8,离心弃去沉
6、淀,清液,离心弃去沉淀,清液再调再调pH7.7加入加入50聚乙二醇,使浓度达到聚乙二醇,使浓度达到16。在在25放置放置45天,离心得沉淀。用蒸馏水溶天,离心得沉淀。用蒸馏水溶解,加解,加4倍量的丙酮,沉淀,同法反复倍量的丙酮,沉淀,同法反复1次,沉淀次,沉淀用用pH6.4,0.05molL磷酸缓冲液溶解,磷酸缓冲液溶解,50聚聚乙二醇反复处理乙二醇反复处理1次,即得无热原的次,即得无热原的L天门冬酰天门冬酰胺酶。溶于胺酶。溶于0.5molL磷酸缓冲液,在无菌条件磷酸缓冲液,在无菌条件下用下用6号垂熔漏斗过滤,分装,冷冻干燥制得注号垂熔漏斗过滤,分装,冷冻干燥制得注射用射用L天门冬酰胺酶成品,每支天门冬酰胺酶成品,每支1万或万或2万单位。万单位。l3 检测方法检测方法l 取取lml0.04molL的的L天门冬酰胺,天门冬酰胺,0.5molLpH8.4的硼酸缓冲液,的硼酸缓冲液,0.5ml细细胞悬浮液或酶液,于胞悬浮液或酶液,于37水浴中保温水浴中保温15min后加后加0.5ml15三氯醋酸,以终止反三氯醋酸,以终止反应沉淀细胞或酶蛋白,离心取上清液应沉淀细胞或酶蛋白,离心取上清液1ml。加加2ml奈斯勒试剂和奈斯勒试剂和7ml蒸馏水蒸馏水15min后,后,于于500nm波长处比色测定产生的氨。波长处比色测定产生的氨。