质粒浓缩步骤.doc

《质粒浓缩步骤.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《质粒浓缩步骤.doc（6页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date质粒浓缩步骤质粒浓缩：Vml质粒浓缩：VmlVml 1TAE或水2V ml混匀离心，最大转速10min取上清1/10V ml NaAc（pH 5.2） 4Vml 冰醋酸置于-20，10min离心，最大转速1015min10. 弃上清11. 70%酒精洗两次（最大转速），酒精要吸干（离心两次，第一次倒干净，第二次空转吸净）12. 室温晾干13. 水溶，计算好体积，与加入

2、的其余物质吻合1. 加入 1/10 体积的乙酸钠（3 mol/L ，PH=5.2）于 DNA 溶液中充分混匀，使其 最终浓度为 0.3 mol/L；2. 加入 2 倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于- 20中 1530 分钟；3. 12,000 g 离心 10 分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；4. 加入 1/2 离心管容量的 70乙醇，12000g 离心 2 分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；5. 于室温下将开盖的 EP 管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干；6. 加适量的 ddH2O 溶解 DNA 沉淀。浓缩原理： 首先，向酶切体系添加1/10体积浓度为3M的

3、NaAc，混匀后，整个体系的Na+浓度就是0.3M（生理盐水的Na+浓度大约为0.15M）。这么多的Na+均匀地分散到DNA表面，屏蔽掉DNA链上PO4-的负电荷，有利于DNA链的压缩。否则的话，PO4-彼此排斥，DNA就不容易聚集。 接着，向整个体系添加2倍体积的无水乙醇。乙醇和水的互溶性很好，加进去后，乙醇就把DNA表面的水膜夺走。换句话说，水和乙醇混去了，原本溶解在水中的DNA只好被挤了出来。第一步加入的Na+平衡了PO4-的电荷，被挤出来的DNA就轻易堆积在一起了。经过离心（12,000 rpm 5 min），被挤出来的DNA就全部被甩到了离心管底部。把上清倒掉，剩下DNA。然而，这时的DNA不纯，还混有酶切体系留下来的盐分，以及变性了的酶。酶变性了，量也不多，不用清除。 向离心管中加入足够量的70%乙醇。这时候，既有足够的乙醇保证DNA不溶于水，又有足够的水把盐份从DNA沉淀里溶解出来。你可以选择短暂离心，或者静置1分钟，来溶解盐分。然后，去干净上清，这样剩下的DNA就不含多余的盐分等杂质，从而不会影响后续实验。 把沉淀烘干，最后用适量的水（或者TE溶液，tris保持弱碱性；EDTA螯合金属离子，抑制依赖于金属离子的DNAse；这样的DNA溶液质量更高）溶就可以了。-