王镜岩生物化学第三版笔记第六章 核酸.doc

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1、第六章 核 酸核酸是遗传物质1868年瑞士Miesher.从脓细胞的细胞核中分离出可溶于碱而不溶于稀酸的酸性物质。间接证据：同一种生物的不同种类的不同生长期的细胞，DNA含量基本恒定。直接证据：T2噬菌体DNA感染E.coli用35S标记噬菌体蛋白质，感染E.coli，又用32P标记噬菌体核酸，感染E.coliDNA、RNA的分布（DNA在核内，RNA在核外）。第一节 核酸的化学组成核酸是一种线形多聚核苷酸，基本组成单位是核苷酸。结构层次： 核 酸 核苷酸 磷酸 核苷 戊糖 碱基组成核酸的戊糖有两种：D-核糖和D-2-脱氧核糖，据此，可以将核酸分为两种：核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA

2、） P330 表5-1 两类核酸的基本化学组成一、 碱基1. 嘌呤碱： 腺嘌呤 鸟嘌呤2. 嘧啶碱： 胞嘧啶 尿嘧啶 胸腺嘧啶P331 结构式 3. 修饰碱基植物中有大量5-甲基胞嘧啶。E.coli噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶代替C。稀有碱基：100余种，多数是甲基化的产物。DNA由A、G、C、T碱基构成。RNA由A、G、C、U碱基构成。二、 核苷核苷由戊糖和碱基缩合而成，糖环上C1与嘧啶碱的N1或与嘌呤碱的N9连接。核酸中的核苷均为-型核苷 P332 结构式 腺嘌呤核苷 胞嘧啶脱氧核苷DNA 的戊糖是：脱氧核糖RNA 的戊糖是：核糖三、 核苷酸核苷中戊糖C3、C5羟基被磷酸酯化，生成核苷酸。1

3、、 构成DNA、RNA的核苷酸P333表5-32、 细胞内游离核苷酸及其衍生物核苷5-多磷酸化合物ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。环核苷酸cAMP（3，5-cAMP） cGMP（3，5-cGMP）它们作为质膜的激素的第二信使起作用，cAMP调节细胞的糖代谢、脂代谢。核苷5多磷酸3多磷酸化合物ppGpp pppGpp ppApp核苷酸衍生物HSCoA、 NAD+、NADP+、FAD等辅助因子。GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供体。第二节 DNA的结构一级：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。二级：DNA的两条多聚核苷

4、酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。三级：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。一、 DNA的一级结构DNA的一级结构是4种脱氧核苷酸（dAMP、dGMP、dCMP、dTMP）通过3/、5/-磷酸二酯键连接起来的线形多聚体。3/、5/-磷酸二酯键是DNA、RNA的主链结构 。 P334 图 5-1书写方法：5/ 3/：5-pApCpTpG-3，或5ACTG3（在DNA中，3/-OH一般是游离的）在DNA分子中，不变的骨架成分磷酸二酯键被逐渐省略，真正代表DNA生物学意义的是碱基的排列顺序。遗传信息贮存在DNA的碱基排列顺序中，生物界生物的多样性即寓于DNA分子4种核苷酸千变万化的精确的排列顺序中。二

5、、 DNA的二级结构1953年，Watson和Crick根据Chargaff 规律和DNA Na盐纤维的X光衍射数据提出了DNA的双螺旋结构模型。1、 Watson-Crick双螺旋结构建立的根据Chargaff 规律 1950年a. 所有DNA中，A=T，G=C 且A+G=C+T。P334表54。b. DNA的碱基组成具有种的特异性，即不同生物的DNA皆有自己独特的碱基组成。c. DNA碱基组成没有组织和器官的特异性。d. 年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成。 DNA的Na盐纤维和DNA晶体的X光衍射分析。相对湿度92%，DNA钠盐结晶，BDNA。相对湿度75%，DNA钠盐结晶

6、，ADNA。 ZDNA。生物体内DNA均为BDNA。Franklin 的工作2、 Watson-Crick双螺旋结构模型P335 图52a.两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条53，另一条35b.嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧，磷酸与脱氧核糖在外侧。磷酸与脱氧核糖彼此通过3/、5/-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。 宽1.2 nm 宽0.6nm 大沟 小沟 深0.85nm 深0.75nmc.螺旋平均直径2nm 每圈螺旋含10个核苷酸碱基堆积距离：0.34nm螺距：3.4nmd.两条核苷酸链，依靠彼此碱基间形成的氢链结合在一起。碱基平面垂直于螺旋轴。A=T、G=

7、C P336 图54碱基互补原则具有极重要的生物学意义，DNA的复制、转录、反转录等的分子基础都是碱基互补。3、 稳定双螺旋结构的因素碱基堆积力（主要因素） 形成疏水环境。碱基配对的氢键。GC含量越多，越稳定。磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。三、 DNA二级结构的不均一性和多型性（一） DNA二级结构的不均一性1、 反向重复序列（回文序列）DNA序列中，以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同，即对称轴一侧的片段旋转180后，与另一侧

8、片段对称重复。较长的回文结构，在某些因素作用下，可形成茎环式的十字结构和发夹结构。功能还不完全清楚，但转录的终止作用与回文结构有关。较短的回文序列，可作为一种特别信号，如限制性核酸内切酶的识别位点。2、 富含A T的序列高等生物中，A+T与C+G的含量差不多相等，但在它们的染色体的某一区域，A T含量可能很高。在很多有重要调节功能（不是蛋白质编码区）的DNA区段都富含A T碱基对。特别是在复制起点和启动的Pribnow框的DNA区中，富含A T对。这对于复制和转录的起始十分重要，因为G C对有三个氢键，而A T对只有两个氢键，此处双键易解开。（二） DNA二级结构的多型性P339 表5-6 A

9、-、B-、Z-DNA的比较1、 BDNA：典型的Watson-Crick双螺旋DNA右手双股螺旋每圈螺旋10.4个碱基对每对螺旋扭角36螺距：3.32nm碱基倾角：12、 A-DNA在相对湿度75%以下所获得的DNA纤维。A-DNA也是右手双螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。3、 Z-DNA左手螺旋的DNA。天然B-DNA的局部区域可以形成Z0-DNA。4、 DNA三股螺旋在多聚嘧啶和多聚嘌呤组成的DNA螺旋区段，序列中有较长的镜像重复时，可形成局部三股螺旋，称H-DNA。镜像重复：TAT配对C+GC酸对DNA的三链结构常出现在DNA复制、重组、转录的起始或调

10、节位点，第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。四、 环状DNA生物体内有些DNA是以双链环状DNA的形式存在，包括：某些病毒DNA某些噬菌体DNA某些细菌染色体DNA细菌质粒DNA真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA1、 环形DNA的不同构象P340 图5-8 松驰环、解链环、负超螺旋（1）、 松弛环形DNA线形DNA直接环化（2）、 解链环形DNA线形DNA拧松后再环化（3）、 正超螺旋与负超螺旋DNA线形DNA拧紧或拧松后再环化，成为超螺旋结构。绳子的两股以右旋方向缠绕，如果在一端使绳子向缠紧的方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生

11、一个左旋的超螺旋，以解除外加的旋转造成的胁变，这样的超螺旋叫正超螺旋。如果在绳子一端向松缠方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个右旋的超螺旋，以解除外加的旋转所造成的胁变，这样的超螺旋称负超螺旋。对于右手螺旋的DNA分子，如果每圈初级螺旋的碱基对数小于10.4，则其二级结构处于紧缠状态，是正超螺旋。如果每圈初级螺旋的碱基对数大于10.4，则其二级结构处于松缠状态，是负超螺旋。2、 环形DNA的拓扑学特性以260bp组成的线形B-DNA为例，螺旋周数260/10.4=25。P340 图25-8 松驰环、解链环、负超螺旋连环数（L）DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，以L表示

12、。松驰环：L=25解链环：L=23超螺旋：L=23缠绕数（T）DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示松驰环T=25解链环T=23超螺旋T=25超螺旋周数（扭曲数W）松驰环W=0解链环W=0超螺旋W= -2L=T+W比连环差（）表示DNA的超螺旋程度=（LL0）/L0L0是指松驰环形DNA的L值天然DNA的超螺旋密度一般为-0.03-0.09，平均每100bp上有3-9个负超螺旋。负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起，很易解链，易于参加DNA的复制、重组和转录等需要将两条链分开才能进行的反应。3、 拓扑异构酶此酶能改变DNA拓扑异构体的L值。拓扑异构酶酶I（拧紧）能使双链负

13、超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA，每一次作用可使L值增加1，同时，使松驰环状DNA转变成正超螺旋。拓扑异构酶酶II（拧松）能使松驰环状DNA转变成负超螺旋形DNA，每次催化使L减少2，同时能使正超螺旋转变成松驰DNA。五、 染色体的结构1、 大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体是由4.2106bp组成的双链环状DNA分子，约3000个基因。大肠杆菌DNA结合蛋白： 每个细胞H 两个28KD的相同亚基 30000个二聚体HU 两个各9KD的不同亚基 40000个二体聚体HLP1 17KD的亚基 20000个单体P 3KD的亚基 未知这些DNA结合蛋白，使4.2106bp的E.coli染色体DNA压缩成

14、为一个手脚架形结构，结构中心是多种DNA结合蛋白，DNA双螺旋分子有许多位点与这些蛋白结合，形成约100个小区，每个小区的DNA都是负超螺旋，一个小区的DNA有两个端点被蛋白质固定，每个小区相对独立。 图用极微量的DNA酶I处理时，只能使少量小区的DNA成为松驰状态，而其它小区仍然保持超螺旋状态。2、 真核生物染色体主要由组蛋白和DNA组成。组蛋白是富含碱性a.a(Lys、Arg)的碱性蛋白质，根据Lys/Arg比值不同，可分为H1、H2A、H2B、H3、H4五种，均为单链蛋白质，分子量11000-21000。H2A、H2B、H3、H4各两分子对称聚集成组蛋白八聚体。146bp长度的DNA双螺

15、旋盘绕在八聚体上形成核小体。核小体间DNA长度15-100bp（一般60bp）其上结合有H1 图2H2A、2H2B、2H3、2H4组蛋白八聚体 146bpDNA 核小体 串联 染色质 折叠 染色体DNA（直径2nm） 盘绕组蛋白八聚体上，结合H1，压缩比1/7 核小体（一级结构） 螺旋化，压缩比1/6螺线管（二级结构） 再螺旋化，压缩比1/40超螺线管（三级结构） 折叠，压缩比1/5染色单体（四级结构） 总压缩比：1/84001/10000六、 DNA的生物学功能首次直接证明DNA的遗传功能的是Avery的肺炎双球菌转化实验。 P342 14 Avery的肺炎双球菌转化实验第三节 RNA的结构

16、一、 RNA的一级结构RNA是AMP、GMP、CMP、UMP通过3/、5/磷酸二酯键形成的线形多聚体。P343 图5-10 RNA基本结构 组成RNA的戊糖是核糖 碱基中RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中还有一些稀有碱基。 天然RNA分子都是单链线形分子，只有部分区域是A-型双螺旋结构。双螺旋区一般占RNA分子的50%左右。二、 RNA的类型细胞中的RNA，按其在蛋白质合成中所起的作用，主要可分为三种类型。核糖体RNA rRNA 转运 RNA tRNA信使 RNA mRNA 此外，真核生物细胞中有少量核内小RNA（small nuclear RNA snRNA）P344 表5-7 大肠

17、杆菌中的RNA沉降系数：单位离心场中的沉降速度，以S为单位，即10-13秒。如23S rRNA ，单位离心场中沉降 2310-13秒 5S rRNA ，单位离心场中沉降 510-13秒三、 tRNA的结构 tRNA约占全部RNA的15%主要功能：在蛋白质生物合成过程中转运氨基酸。已知一级结构的tRNA有160种，每种tRNA可运载一种特定的a.a，一种a.a可由一种或多种tRNA运载。结构特点分子量在25kd左右，70-90b，沉降系数4S左右碱基组成中有较多稀有碱基 图3末端为CpCpA-OH，用来接受活化的氨基酸，此末端称接受末端。5末端大多为pG或pC二级结构是三叶草形P345 图5-1

18、2 tRNA的二级结构（三叶草模型）1966年Crick对于tRNA能识别几种密码子的现象，提出碱基配对的“摆动学说”：认为除A-U、G-C配对外，还有非标准配对，I-A、I-C、I-U，并强调密码子的5端第1、2个碱基严格遵循标准配对，而第3个碱基可以非标准配对，具有一定程度的摆动灵活性。四、 mRNA的结构mRNA是从DNA上转录而来的，其功能是依据DNA的遗传信息，指导各种蛋白质的生物合成，每一种蛋白质都由一种相应的mRNA编码，细胞内mRNA种类很多，大小不一，每种含量极低。从功能上讲，一个基因就是一个顺反子，原核生物的mRNA是多顺反子，真核mRNA是单顺反子。顺反子：是由顺反试验所

19、规定的遗传单位，相当于一种蛋白质的基因。1、 真核mRNA（1）、 3-端有一段约30-300核苷酸的polyA。 PolyA是转录后，经polyA聚合酶添加上，polyA聚合酶对mRNA专一。原核mRNA一般无polyA。polyA与mRNA半寿期有关，新合成的mRNA，其polyA较长；而衰老的mRNA，其polyA较短。polyA功能：PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。（2）、 5-帽子帽子5末端的鸟嘌呤N7被甲基化，鸟嘌呤核苷酸经焦磷酸与相邻的一个核苷酸相连，形成5-5-磷酸二酯键。P346 帽子结构帽子的功能：可抵抗5核酸外切酶

20、降解mRNA。可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。2、 原核mRNA（多顺反子）原核mRNA由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。没有5/帽子和3/polyA。举列：MS2病毒mRNA，3569 b，有三个顺反子，分别编码A蛋白、外壳蛋白和复制酶三种蛋白质。 图MS2病mRNA5端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5-AGGAGGU-3，位于起始密码子AUG前约10核苷酸处，此序列由Shine和Dalgarno发现，称SD序列。SD序列和核糖体16S的rRNA的3末端富含嘧啶碱基的序列互补，这种互补序列与mRNA对核糖体的识别有关。

21、原核mRNA代谢很快，半寿期几秒至十几分钟。五、 rRNA的结构rRNA占总RNA的80%左右。功能：rRNA是构成核糖体的骨架，与核糖体结合蛋白一起构成核糖体，为蛋白质的合成提供场所。大肠杆菌中有三类rRNA（原核）5S rRNA16S rRNA23S rRNA真核细胞有四类rRNA5S rRNA5.8S rRNA18S rRNA28S rRNA 图 原核核糖体（rRNA部分） 图 真核核糖体（rRNA部分）P346 图5-14 大肠杆菌 5S rRNA 结构第四节 核酸的性质一、 解离性质多聚核苷酸有两类可解离的基团：磷酸和碱基能发生两性解离。磷酸是中等强度的酸，碱基的碱性较弱，因此，核酸

22、等电点在较低的pH范围内。DNA等电点 44.5RNA 等电点 22.5RNA链中，核糖C2-OH的氢能与磷酸酯中的羟基氧形成氢链，促进磷酸酯羟基氢原子的解离。二、 水解性质1、 碱水解室温，0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解，得到2-或3-磷酸核苷的混合物。 图在相同条件下，DNA不被水解。这是因为RNA中C2-OH的存在，促进了磷酸酯键的水解。DNA、RNA水解难易程度的不同具有极为重要的生理意义。DNA稳定 ，遗传信息。RNA是DNA的信使，完成任务后降解。2、 酶水解生物体内存在多种核酸水解酶RNA水解酶 RNaseDNA水解酶 DNase核酸外一切酶核酸内切酶 最重要的：限制

23、性核酸内切酶三、 光吸收性碱基具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有强烈的光吸收，max=260nm1、 鉴定纯度纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85），若大于1.8，表示污染了RNA。纯RNA的A260/A280应为2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。2、 含量计算1 ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA 或：40ug/mL单螺旋DNA（或RNA） 或：20ug/mL核苷酸3、 增色效应与减色效应P347 图5-15 DNA的紫外吸收光谱增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大减色效应：在DN

24、A的复性过程中，摩尔吸光系数减小。四、 沉降特性（DNA）不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），起密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心就可以将它们区分开来，这一方法常用于质粒DNA的纯化。 P348 图516 Cs-Cl密度梯度离心纯化质粒DNA相对沉降常数线型双螺旋分子 1.00松驰双链闭环 1.14切刻双链环 1.14单链环 1.14线型单链 1.30正超或负超螺旋双链环状 1.41坍缩 3.0五、 变性、复性及杂交变性、复性是核酸的重要的物化性质，相对蛋白质来说，核酸可以耐受反反复复的变性、复性。这也是核酸研究技术的基础。1、 变性（1）、 变性：核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链

25、，不涉及共价键断裂。多核苷酸骨架上共价键的断裂称核酸的降解。DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。P350 图5-18变性过程 热变性 因素 酸碱变性（pH小于4或大于11，碱基间氢键全部断裂） 变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛） 260nm吸收值升高。 变性后 粘度降低，浮力密度升高。 二级结构改变，部分失活。 （2）、 熔解温度（Tm）或称熔点：DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。DNA的Tm一般在7085之间。浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完全变性（单链）A260= 1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。

26、（3）、 影响DNA的Tm值的因素DNA均一性 均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围 内。G-C含量与Tm值成正比，G-C含量高，则Tm越高，测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44P351图5-19 图5-20 Tm值与GC含量的关系介质中离子强度其它条件不变，离子强度高，Tm高。P351 图5-212、 复性变性DNA在适当（一般低于Tm2025）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。变性DNA在缓慢冷却时（快速冷却可防止复性），可以复性。DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快。复性速度可用Cot衡量。Co为变性DNA原始浓度molL-1，t为时间，以秒

27、表示。 P352 图5-22，不同DNA的复性时间。A1个核苷酸对（A.U）图上查出Cot1/2=410-6mol.s/L若浓度为Co=1.0m mol/L则复性50%所需时间t=0.004秒若要全部复性，Cot=10-4 t=0.1秒BE.coli 4.2106碱基对图上查出Cot1/2=10 mol.s/L若浓度Co=1.0 umol/L则复性50%所需时间t=107秒，约115天。复性100%Cot=500 mol.s/Lt=5108秒，5758天。对于E.coli ，4.2106bp，浓度达到umol/L级时，浓度已很高。 复性机制：10-20bp成、拉链3、 杂交（DNADNA、 D

28、NARNA）将不同来源的DNA混合加热，变性后，慢慢冷却使它复性。若这些异源DNA之间，在某些区域有相同的序列，则复性时会形成杂交分子。第五节 核酸研究技术一、 核酸的分离纯化要求：尽可能保持其天然状态。 条件温和，防止过酸、过碱。 避免剧烈搅拌，抑制核酸酶。1、 DNA分离纯化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或盐（1mol/L），但不溶于0.14mol/L Nacl中，利用此性质，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。DNA核蛋白可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。2、 RNA的制备（重点介绍mRNA的分离、纯化）用0.14mol/L Nacl

29、使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。去蛋白：盐酸胍、苯酚等必须防止RNA酶对RNA的破坏。二、 核酸的凝胶电泳1、 琼脂糖电泳 核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比 凝胶浓度 DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢。 电流，不大于5V/cm2、 PAGE电泳三、 限制性核酸内切酶（1979年发现）1、 限制修饰系统 图2、 II型核酸内切酶核酸内切酶有I、II、III三种类型，其中II型酶在DNA克隆中十分有用。II型酶的特点：限制和修饰活性分开，蛋白质结构是单一成分，辅助因子Mg2+，位点序列旋转对称（反向重复）。II型酶的切割频率识别位点 4 44=256 6 46

30、=4096 8 48=65536Not I GCGGCCGC限制酶的命名：E.coRI第一位： 属名E（大写）第二、三位： 种名的头两个字母小写co第四位： 菌株R第五位： 罗马字，从该细菌中分离出来的这一类酶的编号。同裂酶：来源不同的限制酶（名称自然不同），识别同样的核苷酸靶序列，产生同样的切割，形成同样的末端。BamH： GGATCC 同裂酶 BstI识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端。同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，但都产生相同的粘性末端。BamHI：GGATCC同裂酶：BstI GGATCC同尾酶：BclI TGATCA BglII AGATCT MboI GATC S

31、au3A GATC星号活力：在一定条件下（低离子强度，碱性pH，或50%甘油），限制酶的特异性降低。结果，它的识别与切割所需的典型的核苷酸序列的数量和种类会发生变化。例如 HindIII AAGCTT四、 DNA物理图谱及构建（限制酶切图谱、DNA酶切位点图谱）在研究某一种DNA时，弄清该DNA分子有哪些限制酶切位点是很重要的。建立物理图谱是进一步分析此DNA的基础，末端标记法构建DNA物理图谱：（1）单酶完全降解和部分降解（2）双酶降解 图五、 分子杂交1、 Southern BlottingP353 图5-23DNA样品 酶切 电泳 变性 转膜 固定 杂交 洗涤 放射自显影变性（NaOH

32、0.5mol/L）转膜（NC膜）固定（80，4-6h）杂交（高盐浓度，68，几小时）Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。可用DNA或RNA探针。2、 Northern Blotting研究对象是mRNA检测可与探针DNA同源杂交的mRNA分子的存在，因而可以研究细胞内特定mRNA的产生，即特定基因的表达。mRNA易形成局部二级结构，因此，总RNA或mRNA需在变性条件下电泳，乙二醛、甲醛可防止RNA形成二级结构。3、 Western Blotting是研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。六、 DNA序列分析（一） 化学裂解法（

33、Maxam-Gilbert 法）DNA一级结构测定原理：利用特异性的化学裂解法，制备出具有同一标记末端，而另一端是长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群在能够分辨长度只差一个核苷酸DNA片段的PAGE上分离。一定浓度的特测片段 32P-GCTACGTA特异性化学裂解在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT在G处：32p-GCTA在C处：32P-G和 32P-GCTA在T处：32P-GC和32P-GCTACG 图硫酸二甲酯特异切割：G甲酸特异切割：G和A肼在Nacl条件下切割：C肼在无Nacl条件下切割：T和C32P *ACTTCGACAA硫酸二甲酯： *ACTTC甲酸： *P *AC

34、TTC*ACTTCG *ACTTCGAC *ACTTCGACA肼（有Nacl）： *A *ACTT *ACTTCGA肼（无Nacl）： *A *AC *ACT *ACTT*ACTTCGA从下往上读：CTACGTA末端G不能读出。（二） 双脱氧终止法英国 Sanger 1955 确定牛胰岛素结构 1958 获诺贝尔化学奖 1980 设计出DNA测序法 1980 再获诺贝尔化学奖合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。 图胰岛素的基因工程：A链21a.a 63个核苷酸 B链30a.a 90个核苷酸（三） 序列分析仪四色荧光基团标记的ddNTP七、 DNA合成（合成探针、引物、基因）1、 化学合

35、成DNA合成仪DNA固相合成（亚磷酸三酯法）合成方向：3 5端5-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护，碱基上氨基用苯甲酸保护3-OH用氨基磷酸化合物活化P353 合成过程 保护： 5-OH、活化3-OH、保护所有NH22、 DNA的酶合成PCR用DNA聚合酶I必备条件：模板DNA（单链）引物DNA聚合酶dATP、 dGTP、dCTP、dTTP 一定浓度的Mg2+链合成方向：5 3端新的DNA链合成，从引物DNA的3-OH开始。 图链的增长反应是引物DNA的3-OH，对脱氧核糖核苷三磷酸的-磷原子亲核进攻的结果。化学合成：方向3 5，不需DNA模板，不用酶。生物合成：方向5 3，需模板，引物，用酶。 计划：6