酵母双杂交实验流程.doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上模块七 蛋白质之间的相互作用1. 实验目的本实验以重组质粒和酵母细胞为材料，学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术；让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用；掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。2. 实验原理1989年Fields和Song等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识（即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与），提出并建立了酵母双杂交系统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，近几年得到了广泛的运用和发展。相比于其它蛋白质筛选系统，酵母双杂交系统具有以下优点：

2、（1）检测在真核活细胞内进行，在一定程度上代表细胞内的真实情况。（2）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。（3）检测结果是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库，能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。（5） 通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型、X-Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先，经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于

3、细胞核内，因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的初期阶段，由于仅仅采用b-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系，这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制，因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA 结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生“假阳性”结果。产生“假阴性”结果的原因可能有许多蛋白质间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、磷酸化和

4、二硫键形成，还有些蛋白的正确折叠和功能有赖于某些非酵母蛋白的辅助等。现在的酵母双杂交系统大都采用多种报告基因，如AH109酵母株含有三类报告基因ADE2、HIS3、MEL1/lacZ，这三类报告基因受控于三种完全不同、异源性的GAL4-反应元件和三类启动子元件-GAL1、GAL2以及MEL1（如图6-1-1）。通过这种方法就消除了两类最主要的假阳性，一类是融合蛋白可以直接与GAL4结合位点结合或者是在结合位点附近结合所带来的假阳性；另一类是融合蛋白和某种转录因子结合后再结合到特定的TATA盒上所带来的假阳性。ADE2一种报告基因就已经能够提供较强的营养选择压力，这时选择性地使用HIS3报告基因

5、，一来可以降低假阳性率；二来可以控制筛选的严格性（如果需要筛选与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白，就可以同时使用ADE2、HIS3两种报告基因；如果只需要筛选与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白，就可以使用ADE2或HIS3两者中的一种）。MEL1和lacZ分别编码a-半乳糖苷酶和b-半乳糖苷酶，可以作用于相应的底物X-a-Gal和X-b-Gal使酵母变蓝。其中，a-半乳糖苷酶是外分泌酶，在酵母表面就能直接检测到；b-半乳糖苷酶是内分泌酶，需要将酵母破碎后才能检测到。用蓝斑显示酵母细胞内两个蛋白的相互作用的方法不仅具有较高的敏感性，而且蓝斑的深浅还可以反映两个蛋白相互作用的强弱。随着酵母双杂交系统

6、的广泛应用，这一系统得到了不断的完善及改进，除了经典的双杂交系统以外，同时也衍生出单杂交系统、三杂交系统、反向酵母双杂交系统、hSos/Ras募集系统（hSos/Ras recruitment systems）、泛素分裂系统（Split-ubiquitin systems）、双诱饵系统（Dual-bait systems）等一系列相关系统，根据这些系统的不同特点，可以分别应用于蛋白质与DNA、RNA的相互作用、蛋白质复合体之间的相互作用、膜蛋白质之间的相互作用、筛选阻断蛋白间相互作用的药物等一系列领域，对经典的酵母双杂交系统起到了很好的补充，并有力地推动了酵母双杂交系统的发展与应用。酵母双杂交

7、系统的原理是利用转录激活因子在结构上是组件式的，即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域（DNA binding domain, DB）和转录激活结构域（activation domain, AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。根据转录因子的这一特性，将BD 与已知的诱饵蛋白质X 融合，构建出BD-X质粒载体；将AD 基因与cDNA 文库，基因片段或基因突变体（以Y表） 融合，构建AD-Y质粒载体。两个穿梭质粒载体共转化至酵母体内表

8、达。蛋白质X 和Y的相互作用导致了BD与AD在空间上的接近，从而激活UAS 下游启动子调节的酵母菌株特定报告基因（如LacZ，HIS3，LEU2）等 的表达（图6-1-2），使转化体由于HIS3 或LEU2 表达，而可在特定的缺陷培养基上生长，同时因LacZ 表达而在X-a-Gal 存在下显蓝色。酵母双杂交原理示意图XRNAPolymeraseDBDReporter genePreyBaitADYExpressionUAS3. 实验仪器微量取液器（2 L；20 L；200 L；1,000 L）、低温离心机、台式离心机、琼脂糖凝胶电泳系统、蛋白凝胶电泳系统、凝胶成像系统、半干转移系统、恒温摇床、

9、恒温孵箱、通风橱、制冰机、振荡器、恒温金属浴、无菌接种环、10 cm培养皿、15 cm培养皿。4. 实验试剂（1）裂解缓冲液（Cracking buffer）： 尿素8 mol/LSDS5 %Tris-HCl（pH 6.8）40 mmol/LEDTA0.1 mmol/L溴酚蓝0.4 mg/ml（2）各种基础培养基和营养缺陷培养基：minimal SD base，minimal SD agar base，YPD medium，YPD agar medium，-Leu DO supplement，-Trp DO supplement，-Leu/-Trp DO supplement，-Leu/-Tr

10、p/-His DO supplement，-Leu/-Trp/-His/-Ade DO supplement，腺苷酸（adenine），PEG8000，Carring DNA，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO），TE/LiAC buffur，PEG/LiAC，X-a-gal或X-b-gal。（3）酵母质粒提取试剂盒，LB培养基，羧苄青霉素和卡那霉素。（4）蛋白标准。（5）Z-buffer（pH7.0）： Na2HPO47H2O16.1 g/LNaH2PO4H2O5.5 g/LKCI0.75 g/LMgSO47H2O0.246 g/L（6）Z-buffer/X-b-G

11、al液体： Z-buffer100 mlb-巯基乙醇0.27 mlX-b-Gal储存液1.67 ml5. 实验方法酵母的复苏与表型验证：（1）复苏前12 天，配制YPDA 琼脂并于高压消毒后倒板。（2）用无菌接菌环在酵母冻存管中挑取一小团酵母细胞，接种到YPDA 琼脂板上。（3）30 倒置孵育35天。（4）待酵母长到直径23 mm后，将其接种到不同营养缺陷型培养基上进行表型验证。质粒转化酵母细胞（常规转化）：（1）挑取一直径约23 mm的酵母克隆接种到0.5 ml YPDA培养基中。（2）剧烈震荡使细胞凝块均匀分散。（3）将细胞转移到含有新鲜YPDA培养基的锥形瓶中。（4）30，250 rpm

12、，振荡孵育1618 hr，直到稳定期（OD 6001.5）。（5）将过夜培养物转移到含有新鲜YPDA培养基的椎形瓶中，进一步扩增酵母细胞。（6）30 ，230270 rpm，振荡孵育使OD600达到0.5 0.1（一般需要3 hr）（7）将细胞转移到数个50 mL离心管中，转速1 000 g，室温离心5 min。（8）弃去上清，加入2550 mL消毒H2O，振荡重悬、清洗并收集细胞。（9）转速1 000 g，室温离心5 min，弃上清（10）加入1 mL新鲜配置的无菌的1 TE / LiAC重悬细胞。（11）准备1.5 mL无菌EP管，在每个管中加入需要转染的质粒以及担体（carrier）DN

13、A。小量转化大量转化质粒DNA0.1 mg20200 mgcarrier DNA0.1 mg2 mg*7 每管中加入感受态细胞的体积根据酵母细胞的数量以及铺板的大小而定，通常小量转化每管加入100 mL 的感受态细胞；大量转化每管加入1 mL 的感受态细胞。如果长出来以后克隆太密则可适量减少每管中加入的感受态细胞的体积；反之则可适当增加感受态细胞的体积。（12）加入经1 TE/LiAC重悬的感受态细胞，轻柔混匀。质粒DNACarrier DNA感受态细胞（13）每个管中加入适量体积的1PEG/LiAC，高速震荡混匀。（14）30 ，200 rpm，振荡孵育0.5 hr。（15）加入适量体积的D

14、MSO，温和颠倒混匀，不要振荡。（16）42 水浴热休克15 min，对于大量转化，应经常摇动以混匀。（17）置于冰上510 min，室温12,000 g离心细胞5 sec。 （18）移去上清，根据铺的板数加入适量体积的1TE重悬细胞。（19）铺板，倒置平板于30 孵育直到克隆出现。转化酵母菌结果检测目的蛋白在酵母细胞中的表达：（1）挑取一直径约2 mm、含有目的蛋白基因片段的BD/X新鲜酵母克隆于5 mL 相应营养缺陷液体培养基中，30 、230 rpm振荡孵育16 hr。（2）将过夜培养物在50 mL YPDA培养基中扩大培养，30 ，220250 rpm，使OD600值达到0.40.6。

15、（3）1,000 g离心5 min，弃上清。（4）加入30 mL H2O，重悬细胞。1,000 g，离心5 min，弃上清，加入液氮速冻沉淀。（5）待液氮挥发完全以后，按照100 mL/7.5 OD600的比例加入cracking buffer重悬细胞并移入到一个1.5 mL的EP管。（6）按80 mL/7.5 OD600的比例向EP管中加入酸性玻璃微珠（glass beads）。70 加热10 min。剧烈震荡1 min。（7）12,000 g，4 离心5 min。将上清转移到一个新的1.5 mL EP管中，置于冰上。（8）100 水浴中35 min，剧烈震荡1 min。（9）12,000

16、g，4 离心5 min。将两次上清合到一个EP管中。（10）取20 mL上清，加入上样缓冲液，100 变性5 min。（11）SDS-PAGE电泳后，采用Western blot技术检测目的蛋白在酵母细胞中的表达情况。小规模酵母杂合（mating）：（1）在无菌的1.5 mL EP管，加入0.5 mL 2 YPDA培养基。（2）挑取直径约23 mm、新鲜的含有表达质粒pGBKT7-X的AH109酵母克隆和含有表达质粒pGADT7-Y的Y187酵母克隆于上述EP管中。（3）剧烈震荡1 min，使酵母细胞完全悬浮。（4）30 ，200 rpm振摇孵育2024 hr。（5）将杂交混合液按1:100稀

17、释到0.5YPDA培养基中，取100 mL铺到SD/-Trp/-Leu/X-a-Gal板上。（6）倒置平板于30 孵育直到克隆出现。BD-protein XY187MatingSD/-His/-Leu/X-a-GalSD/-Ade/-His/-Leu/-Trp /X-a-Gal SD/-Ade/-Leu/-Trp/ X-a-GalAD-protein YAH109酵母杂交操作步骤流程图滤纸转移法检测b-半乳糖苷酶的分泌：（1）待酵母长到直径1.53 mm大小时，取无菌、大小合适的Whatman滤纸贴在酵母板上。（2）待滤纸被琼脂板上的水分基本浸湿后，揭下滤纸，这时酵母克隆被转移到了滤纸上。（3

18、）将附着有酵母克隆的滤纸在液氮中速冻10 sec以上。（4）将新配制Z-buffer/X-b-Gal液体滴在另一无菌的Whatman滤纸上，并完全浸湿滤纸。（5）将附着有酵母克隆的滤纸小心地贴放在浸有Z-buffer/X-b-Gal的滤纸上。（6）室温孵育816 hr等待蓝斑出现。滤纸转移法检测b-半乳糖苷酶的表达量诱饵蛋白的文库筛选：酵母双杂交文库筛选操作流程图QDO/X-a-Gal plateQDO/X-a-Gal plateQDO/X-a-Gal platePick out positive clone LB/Kan+BD-baitY187MatingTDO/x-a-GalDDO/X-a

19、-GalAD-libraryAH109QDO/X-a-GalRetransform into AH109Mating with BD/VectorMating with BD/baitMating with BD/lamDDO plateDDO plateSD/-LeuDDO plateExtracting plasmids Thransform DH5Extracting plasmids （1）挑取一新鲜、直径为23 mm的BD-bait酵母AH109于50 ml SD/-Trp液体培养基，30 ，250270 rpm，1618 hr，培养至OD600值0.8。（2）1,000 g离心5

20、min，弃上清。用剩余的5 mL左右残液重悬细胞。（3）室温水浴融化冻存的文库（约1 mL），轻柔震荡，留取10 mL文库用于文库滴度测定（文库滴度测定方法见后）。（4）快速将步骤2和步骤3的两种液体混合到2 L的烧瓶中并加入45 mL 2YPD/Kan（Kan50 mg/mL）轻柔震荡；用1 mL 2YPD/Kan冲洗装文库的离心管两次，并将冲洗液加入到烧瓶中。（5）30 过夜孵育（2024 hr）并轻柔震荡（3050 rpm）。（6）将杂交混合液转移到一无菌离心瓶中，1,000 g离心10 min，弃上清。再用50 mL 2YPD/Kan冲洗杂交瓶两次，将两次冲洗液混合在一起重悬细胞。（7

21、）1,000 g离心1 0 min，弃上清。用10 mL的0.5YPD/Kan重悬细胞，并估算重悬后的总体积，铺板。（8）倒置平板于30 孵育821天直到克隆出现。（9）挑取阳性克隆于300 mL YPDA和150 mL消毒甘油的混合液中，冻存于-80 。阳性克隆验证：（1）用接种环挑取单个阳性克隆接种到新的SD/-Trp/-Leu/-His/ X-Gal 平板上，30 倒置平板孵育。（2）待阳性克隆长出后，再用接种环挑取单个阳性克隆，接种到新的SD /-Trp/-Leu/-His/X-Gal 平板或SD/-Trp/-Leu/-Ade/ -His/X-Gal 平板上，倒置平板于30 孵育。（3

22、）挑取单个阳性克隆于5 mL YPDA/Kan培养基中30 ，250270 rpm振摇1216 hr。（4）使用酵母质粒微量抽提试剂盒提取质粒。（5）将提取到的质粒混合物（BD/bait、AD/cDNA）采用经典转化法转化DH5a大肠杆菌，铺LB抗生素平板。LB平板中的抗生素与AD/cDNA载体所带的抗性一致，这样最终得到的克隆只含有AD/cDNA。（6）挑取单个阳性克隆于5 mL LB培养基（含相应抗生素）中37 ，250270 rpm振摇1216 hr。（7）提取质粒，做PCR鉴定。（8）将pGADT7-cDNA表达质粒转入AH109酵母株中将pGBKT7-bait表达质粒转入Y187酵母

23、中，待克隆长出对带有AD-文库蛋白的AH109酵母克隆进行自激活验证，另外再将带有AD-文库蛋白的AH109酵母克隆与带有BD-bait蛋白的Y187酵母克隆进行杂交，验证阳性克隆的真实性。500bp2 000bp500bp2 000bp500bp2 000bp500bp2 000bp文库cDNA片段的PCR鉴定文库滴度的测定：（1）将预留的10 mL文库与10 mL LB混合均匀。（2）取1 mL混合液到1 mL LB培养基中，混合均匀，制成稀释溶液A（1:103）。（3）再从溶液A中取1 mL到1 mL LB培养基中，混合均匀，制成稀释溶液B（1:106）。（4）从溶液A中取1 mL到50

24、 mL LB培养基中，混合均匀，铺板。（5）从溶液B中分别取50 mL和100 mL铺板。（6）将板倒置3031 ，孵育3648 hr。（7）克隆计数并计算文库滴度（cfu/mL），计算文库滴度的方法如下：A：克隆数 103 103 2 = cfu/mLB：（克隆数/铺板体积） 103 103 103 2 = cfu/mL6. 注意事项（1）酵母双杂交对照的设定常规的酵母双杂交操作时一般会设定阳性对照、阴性对照以及显色系统对照三种对照，以MATCHMAKER GAL4酵母双杂交筛选系统为例：阳性对照：pGADT7-T + pGBKT7-53，其中T蛋白和53蛋白是已经明确在酵母细胞内能够发生结

25、合并启动报告基因表达的两种蛋白。阴性对照：pGADT7-T + pGBKT7-lam，其中已经明确T蛋白和lam蛋白在酵母细胞内不能发生结合。系统显色对照，pGADT7-Pcl1，该表达质粒转入酵母细胞就能引起b-半乳糖苷酶和a-半乳糖苷酶的分泌，从而检测显色系统是否有问题。（2）假阳性现象 多种原因可能造成假阳性结果，常见的有以下三种： 筛到的文库蛋白自身具有转录活性，能够启动报告基因的表达这种情况需要对筛到的候选蛋白进行自激活验证。酵母细胞内可能同时含有不止一种文库蛋白，其中的一种文库蛋白可以与诱饵蛋白相互及结合。这种情况需要对阳性克隆再次划板23次，以确保每一个酵母克隆中只含有一种文库蛋

26、白和诱饵蛋白；另外划板的次数也不宜过多，否则会出现蛋白表达质粒丢失的情况。其他一些不明原因造成的假阳性这种情况需要将筛到的候选文库质粒和表达诱饵蛋白的质粒重新共转入酵母细胞或者通过酵母杂交的方式重新验证，如有必要可以将pGADT7-cDNA质粒与pGBKT7-bait质粒的载体对调构建成pGADT7-bait与pGBKT7-cDNA并重新在酵母细胞中验证，真正的阳性结合在对调以后也能在酵母细胞中做出阳性结果。（3）常见的问题及参考方案转化效率过低尽量使用新鲜的培养基以及新鲜的、且直径大小在23 mm左右的酵母克隆，以确保酵母的活力；可将用于转化的质粒在使用前进行乙醇沉淀，以提高质粒的纯度和浓度

27、。杂交效率偏低可能由于表达的融合蛋白对酵母细胞有毒性，在某些情况下在液体培养基中生长不好的酵母换到琼脂糖固体培养板上时，会生长得比较好，这种情况可以采用共转化的方法进行试验；或者将单转的酵母克隆分别铺到5块10 mm的培养板上，待克隆长出来以后，刮取所有克隆于5 mL 0.5YPDA中。重悬后再按照常规杂交操作步骤进行操作。背景过高当使用HIS3作为报告基因时，由于HIS3基因具有一定程度的泄漏表达，可能会出现背景过高的情况，这时可以使用适量的HIS3蛋白竞争性抑制剂3-AT（3-amino-1,2,4-triazole）以降低背景；或者再增加一种更加严格的报告基因的筛选如Ade。诱饵蛋白具有自激活现象可以采用克隆突变的方法将产生自激活一段氨基酸序列敲除或突变，但这种方法可能会破坏两蛋白之间的相互作用。专心-专注-专业