2022年Agilent实验原理及步骤[收 .pdf

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1、Agilent 实验原理及步骤名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 8 页 - - - - - - - - - 一、总 RNA 抽提（ TRIzol 法）1.每 2107细胞加入1 ml Trizol，在旋涡震荡器上混匀；对于组织样品，每100mg组织可以加入 1 ml Trizol，用液氮研磨或采用电动匀浆器充分打碎组织块。2.加入约 1/5 体积的氯仿，上下颠倒充分混匀1 分钟左右，室温下静置5 分钟。3.4， 12,000 rpm 离心 15 分钟后小心取

2、出上清液，将上清夜转入新的1.5 ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置 5 分钟。 （15ml 离心管用7,500rpm 离心20min）4.4， 12000 rpm 离心 10 分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5 体积的 70% 乙醇， 4 ，12000 rpm 离心洗涤沉淀15 分钟。 （15ml 离心管用7,500rpm 离心 20min）5.去上清，沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解沉淀，测定OD260和 OD280值。( optional) 对于从组织样本抽提的总 RNA，为了更好的去除基因组DNA 的污染， 可以采用无 RNA 酶的 DNA酶 I 处理，

3、从而提高样品纯度。二、总 RNA 质量检测（琼脂糖电泳以及Lab-on-a-chip 电泳检测 ）（一）琼脂糖胶电泳1、配置用 DEPC 处理的电泳缓冲液 50 TAE ，高压灭菌后待用。2、使用电泳槽前用3H2O2浸泡 15min，然后用 DEPC处理的水冲洗，倒入适量1 TAE电泳缓冲液。3、称取适量琼脂糖，加入1 TAE电泳缓冲液，制备1的胶（注意使用专用的溶液和相关设备，避免引入外源RNA 酶） 。4、用专用 6 Loading buffer做指示剂，取 10l 上样电泳（电压 100 伏）15min。5、关闭电源，取出电泳胶，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像。6、评价总 RNA或

4、mRNA 质量（见 FAQ ） 。通过目测28S 和 18S 的亮度比例可以初步评价总RNA的质量。一般认为名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 8 页 - - - - - - - - - 28S:18S 2 可以初步判定总 RNA 质量较好，如图1 所示。图 1 1agrose 胶电泳人胎盘总RNA28S 18S （二） Lab-on-chip 1、胶制备取出 400l RNA gel Matrix，加入Spinfiter柱子，离心过滤凝胶（1500 g， 1

5、0min ） 。2、 取出 130l 过滤胶到 1.5mlEppendorf 管中，再加入 2lRNA Dye Concentrate ，在 vortexer上振荡混匀。3、用 RNA ZAP 清洁操作区，同时在Electrode cleaner中加入 350lZAP，放入Lab on chip正确位置，合盖清洁探头1min。4、再用另外一 Electrode cleaner中加入 350lDEPC 处理的H2O,重复步骤 3。5、移开 Electrode cleaner,让探头自然干燥。6、取出一新的 RNA Chip，吸取 9l 步骤 2 制备的凝胶加入 G 孔中。7、 将 chip 放置

6、于带有活塞（plunger） 的水平台上（chip priming station） ， 将 plunger拉杆向上拉倒 1ml 刻度出，再将 chip priming station 的盖子合上，压紧chip。同时向下推动拉杆至底部并维持30 秒左右，松开让拉杆自动弹开。8、从 chip priming station 上取出 chip，用放大镜检查是否有气泡存在，如果在微通道中有气泡， 需要重复步骤 7。再在标有 G 的两个孔中各加入9l 步骤 2 制备的凝胶，在标有的孔中加入5Lrna 6000 Nano Marker 。同时在 12 个加sample 的孔中滴加 5l RNA 6000

7、 Nano Marker （不能空一个孔） 。9、取 1l RNA 6000 ladder 滴加到标有的孔中，再各取1l 样品（ RNA ）名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 8 页 - - - - - - - - - 加入 12 个样品孔中，并将chip 放入 IKA Vortexer上，在 set-point振幅处振动 1min（注意：必须卡紧 chip ，否则在振动过程中会跳出来） 。10、振荡好后的 chip 在 5min 之内必须放入 Agilent

8、 2100分析仪上，按照软件提示进行 RNA 电泳操作。11、评价 RNA 质量。见（ FAQ ）如图 3 所示，为经过 Agilent 2100分析得到的完整的人胎盘总RNA 。Fluor escenceTime (seconds)0510152025 19 24 29 34 39 44 49 54 59 64 69具体操作步骤参考人cDNA表达谱芯片使用手册, SBC-H-HC-100-22 ，具体结果见样品质检报告 。 Lab-on-chip参照 Agilent 2100 分析仪操作手册， 制备凝胶， 按照软件提示进行RNA电泳操作，评价RNA 质量。三、总 RNA 的纯化（QIAGEN

9、 RNeasy Mini Kit）如果总RNA的纯度不高，会影响探针的标记效率和芯片杂交结果。所以使用QIAGEN RNeasyKit 纯化总 RNA ，详细操作原理和方法见RNeasy Mini Protocol 。1、取总 RNA100 g 溶解于 100 l RNase free 水中，加入350 lBuffer RLT 并充分混匀。2、加入 250 l 无水乙醇， Tip 头充分混匀。3、将共计 700 l 含总 RNA 的溶液转入套在2 ml 离心管内的RNeasy 柱子内，8000 g 离心15-30sec，弃去滤过液。4、吸取 500 lBuffer RPE 到 RNeasy m

10、ini 柱子内，8000 g 离心洗涤1530sec，弃去滤过液， 再用 500 lBuffer RPE 在 8000 g 离心洗涤 2 min， 弃去滤过液和2 ml 的套管，将 RNeasy mini 柱子转入一新的1.5 mlEppendorf 管中。5、吸取40 lRNase free 的水，8000 g 离心洗脱 1 min。6、重复步骤5 一次。四、cDNA 第一链和第二链一步法合成1、 取 2ug total RNA 于 1.5ml 离心管中，如下配置反应溶液：名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精

11、心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 8 页 - - - - - - - - - 总 RNA 2ug T7 Promotor primer 5ul Rnase-free Water X ul 总体积11.5ul 2、 65保温 10 分钟，冰浴5 分钟注意：5First Strand Buffer 在使用之前于65保温 3-4 分钟，并震荡混匀后离心。3、 配置如下 cDNA合成体系：5First Strand Buffer 4ul 0.1M DTT 2ul 10mM dNTP mix 1ul MMLV-RT 1ul RNase OUT 0.5ul 总体积8.5ul 2.2r(u

12、l) 3.3r(ul) 4.3r(ul) 5.3r(ul) 6.3r(ul) 7.3r(ul) 8.3r(ul) 9.3(ul) 10.3(ul) 5First Strand Buffer 8.8 13.2 17.2 21.2 25.2 29.2 33.2 37.2 41.2 0.1M DTT 4.4 6.6 8.6 10.6 12.6 14.6 16.6 18.6 20.6 10mM dNTP mix 2.2 3.3 4.3 5.3 6.3 7.3 8.3 9.3 10.3 MMLV-RT 2.2 3.3 4.3 5.3 6.3 7.3 8.3 9.3 10.3 RNase OUT 1.1

13、1.65 2.15 2.65 3.15 3.65 4.15 4.65 5.15 4、 将上述 mix 加入变性后冰浴的RNA 中混匀5、 40保温 2h 五、荧光标记 cRNA 合成1、 cDNA合成结束后将离心管放65保温 15 分钟，冰浴5 分钟。注意：50%PEG使用之前40保温1分钟。2、如下配置Transcription mix ：Rnase-free Water 5.7ul 4Transcription Buffer 20ul 0.1M DTT 6ul NTP Mix(ATP,GTP,CTP,UTP) 16ul 50% PEG 6.4ul Rnase OUT 0.5ul Inorg

14、anic Pyrophosphatase 0.6ul aa-UTP(25mM) 4ul T7 RNA Polymerase 0.8ul 总体积60ul 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 8 页 - - - - - - - - - 2.2r(ul) 3.2r(ul) 4.3r(ul) 5.3r(ul) 6.3r(ul) 7.4r(ul) 8.4r(ul) 9.4(ul) 10.4ul) Rnase-free Water 12.54 18.24 24.51 30

15、.21 35.91 42.18 47.88 53.58 59.28 4Transcription Buffer 44 64 86 106 126 148 168 188 208 0.1M DTT 13.2 19.2 25.8 31.8 37.8 44.4 50.4 56.4 62.4 NTP Mix 35.2 51.2 68.8 84.8 100.8 118.4 134.4 150.4 166.4 50% PEG 14.08 20.48 27.52 33.92 40.32 47.36 53.76 60.16 66.56 Rnase OUT 1.1 1.6 2.15 2.65 3.15 3.7

16、4.2 4.7 5.2 Inorganic Pyrophosphatase 1.32 1.92 2.58 3.18 3.78 4.44 5.04 5.64 6.24 aa-UTP 8.8 12.8 17.2 21.2 25.2 29.6 33.6 37.6 41.6 T7 RNA Polymerase 1.76 2.56 3.44 4.24 5.04 5.92 6.72 7.52 8.32 3、 加入 60ul Transcription mix并混匀4、 40保温 2h，冰上放置。六、cRNA 纯化（QIAGEN RNeasy Mini Kit ）1、加入 20ul Rnase-free W

17、ater, 加入 350 lBuffer RLT 并充分混匀。2、加入 250 l 无水乙醇， Tip 头充分混匀。3、将共计 700 l 含总 RNA 的溶液转入套在2 ml 离心管内的RNeasy 柱子内，8000 g 离心15-30sec，弃去滤过液。4、吸取 500 lBuffer RPE 到 RNeasy mini 柱子内，8000 g 离心洗涤1530sec，弃去滤过液， 再用 500 lBuffer RPE 在 8000 g 离心洗涤 2 min， 弃去滤过液和2 ml 的套管，将 RNeasy mini 柱子转入一新的1.5 mlEppendorf 管中。5、吸取30 lRNa

18、se free 的水，静置 1 min ， 8000 g 离心洗脱 1 min。6、吸取 30 lRNase free 的水，静置1 min ， 8000 g 离心洗脱1 min。七、cRNA 浓度测定注：一般 cRNA 产量在 10-40ug 左右 ,个别样本产量比较低名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 8 页 - - - - - - - - - 八、cRNA 探针后标记 (所用试剂室温放置 ) 1、取上述 cRNA 4ug 并浓缩至 6.66ul。2、加

19、10ul DMSO 混匀3、加 3.4ul 0.3M sodium bicarbonate buffer,pH 9.0并混匀。4、将上述 20ulcRNA 混合物加入到荧光染料中并混匀。5、 室温即 25 度保温 1 小时。6、 加 9ul 4M Hydroxylamine混匀后室温即25 度保温 15 分钟。九、cRNA 探针纯化（QIAGEN RNeasy Mini Kit ）1、加入 70ul Rnase-free Water, 加入 350 lBuffer RLT 并充分混匀。2、加入 250 l 无水乙醇， Tip 头充分混匀。3、将共计 700 l 含总 RNA 的溶液转入套在2

20、ml 离心管内的RNeasy 柱子内，8000 g 离心15-30sec，弃去滤过液。4、吸取 500 lBuffer RPE 到 RNeasy mini 柱子内，8000 g 离心洗涤1530sec，弃去滤过液， 再用 500 lBuffer RPE 在 8000 g 离心洗涤 2 min， 弃去滤过液和2 ml 的套管，将 RNeasy mini 柱子转入一新的1.5 mlEppendorf 管中。5、吸取30 lRNase free 的水，静置 1 min ， 8000 g 离心洗脱 1 min。6、吸取 30 lRNase free 的水，静置1 min ， 8000 g 离心洗脱1

21、min。十、cRNA 探针定量Cy3 探针 浓度（ pmol/ul） =A552/0.15 Cy5 探针 浓度（ pmol/ul） =A650/0.25 十一、芯片杂交1、 cRNA 的片段化：Cy3 cRNA X ul （ 100 pmol）Cy5 cRNA X ul （ 50 pmol）10 control target 50ul Rnase-free Water Xul 总体积240ul 2、 加入 Fragmentation Buffer 10ul ，轻轻混匀后60保温 30 分钟（不超过30 分钟）。3、 加入 250ul Hybridization Buffer 轻轻混匀离心。4、

22、 取 490ul 杂交溶滴加在盖玻片上，盖上芯片并密封芯片于杂交盒中，60滚动杂交16小时。十二、芯片洗涤（室温25 度洗涤）1、 洗液配置：洗液 1（ 1升） ：DEPC-H2O 700ml 20SSPE 300ml 20%N-Lauroylsarcosine 0.25ml 洗液 2（ 1升） ：DEPC-H2O 997ml 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 8 页 - - - - - - - - - 20SSPE 3.0ml 20%N-Lauroylsarcosine 0.25ml 洗液 3：Stabilization and Drying Solution 2、 取出芯片于洗液1 中洗涤 1 分钟3、 再将芯片放入洗液2 中洗涤 1 分钟4、 最后将芯片放入洗液3 中洗涤 30 秒。十三、芯片扫描Agilent 扫描仪名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 8 页 - - - - - - - - -