最新医学微生物学的新挑战幻灯片.ppt

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1、OUTLINE2 2、微生物生理学时期、微生物生理学时期 建立了一套独特的研究方法建立了一套独特的研究方法, ,寻找各种传染寻找各种传染病病原菌病病原菌巴斯德在观察受狂巴斯德在观察受狂犬病感染的兔脊髓犬病感染的兔脊髓 有机物发酵和腐败由微生物引起有机物发酵和腐败由微生物引起 解决葡萄酒和啤酒变酸问题解决葡萄酒和啤酒变酸问题创立巴氏消毒法创立巴氏消毒法 解决蚕茧的解决蚕茧的“微粒子病微粒子病”的疾病，挽救了法国蚕丝的疾病，挽救了法国蚕丝业业 主张传染病是由微生物引起的，并可通过接触、唾主张传染病是由微生物引起的，并可通过接触、唾液及粪便传播液及粪便传播 1919世纪世纪7070年代，研究炭疽病，

2、拯救了畜牧业年代，研究炭疽病，拯救了畜牧业 18811881年研制成功减毒活疫苗年研制成功减毒活疫苗开创人类战胜传染病开创人类战胜传染病的新世纪的新世纪 18851885年，巴斯德第一次治好了被疯狗咬伤的年，巴斯德第一次治好了被疯狗咬伤的9 9岁男岁男孩梅斯特孩梅斯特奠定了免疫学基础奠定了免疫学基础 科赫科赫 科赫科赫 18821882年发现引起结核病的病原年发现引起结核病的病原分离出结核分离出结核杆菌杆菌 创立了微生物学检查方法：固体培养技术、创立了微生物学检查方法：固体培养技术、染色技术、实验动物感染染色技术、实验动物感染 发现炭疽杆菌、霍乱弧菌发现炭疽杆菌、霍乱弧菌 总结了著名的总结了著

3、名的“科赫法则科赫法则” -确立病原微生确立病原微生物物 19051905年获得了诺贝尔医学和生理学奖年获得了诺贝尔医学和生理学奖分离细菌的固体培养基分离细菌的固体培养基KochKoch氏确定病原体四要点氏确定病原体四要点 在每一例患病的病人中，都应找到此种微生物在每一例患病的病人中，都应找到此种微生物 该微生物能被分离，且能在纯培养基中生长该微生物能被分离，且能在纯培养基中生长 培养出的微生物接种于易感动物，一定能导致培养出的微生物接种于易感动物，一定能导致动物产生该病动物产生该病 在实验性发病动物中，一定能观察并重新获得在实验性发病动物中，一定能观察并重新获得此种微生物此种微生物李斯特在石

4、炭酸喷雾下进行手术李斯特在石炭酸喷雾下进行手术 李斯特李斯特 无菌操作奠基人无菌操作奠基人伊凡诺夫斯基伊凡诺夫斯基 病毒的发现者病毒的发现者欧立希欧立希 （Ehrlich） 1910年砷凡纳明抗梅毒年砷凡纳明抗梅毒药的发现者药的发现者1929年青霉素发现者弗莱明年青霉素发现者弗莱明1940年弗洛瑞提纯应用于临床年弗洛瑞提纯应用于临床弗莱明弗莱明 研究微生物的生命活动研究微生物的生命活动DomagkDomagk发现黄胺药发现黄胺药GriffithGriffith发现细菌转化现象发现细菌转化现象新病原微生物的确定方面新病原微生物的确定方面 19741974年从莱姆年从莱姆(Lyme)(Lyme)病

5、患者分得疏螺旋体病患者分得疏螺旋体 19761976年在美国费城一次退伍军人会议期间发生年在美国费城一次退伍军人会议期间发生 肺炎流行肺炎流行, ,次年分离出军团菌次年分离出军团菌 19831983年从慢性胃炎病人活检标本中分离出年从慢性胃炎病人活检标本中分离出 幽门螺杆菌幽门螺杆菌现代微生物学时期现代微生物学时期二十世纪中叶至今二十世纪中叶至今 19861986年我国台湾省分离得肺炎衣原体年我国台湾省分离得肺炎衣原体 19831983年首先在美国发现人类免疫缺陷病毒年首先在美国发现人类免疫缺陷病毒 （HIVHIV） 近期新发现的病毒有肾综合征出血热病毒、新近期新发现的病毒有肾综合征出血热病毒

6、、新疆出血热病毒、疆出血热病毒、B B 组轮状病毒、丙型肝炎病毒和组轮状病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒等戊型肝炎病毒等19731973年以来认识的病原体示例年以来认识的病原体示例年份年份 微生物微生物 疾病疾病1973 1973 轮状病毒轮状病毒 全球性婴儿腹泻的主要原因全球性婴儿腹泻的主要原因1976 1976 小隐孢子虫小隐孢子虫 急性和慢性腹泻急性和慢性腹泻1977 1977 埃博拉病毒埃博拉病毒 埃博拉出血热埃博拉出血热1977 1977 嗜肺性军团杆菌嗜肺性军团杆菌 军团病军团病1977 Hantaan1977 Hantaan病毒病毒 伴有肾综合征的出血热伴有肾综合征的出血热197

7、7 1977 空肠弯曲菌空肠弯曲菌 全球散布的肠病全球散布的肠病1980 HTLV-I T1980 HTLV-I T细胞淋巴瘤白血病细胞淋巴瘤白血病1981 1981 金葡萄菌产毒素株金葡萄菌产毒素株 中毒性休克综合征中毒性休克综合征1982 1982 大肠杆菌大肠杆菌O157O157：H7 H7 出血性肠炎、溶血性尿毒症出血性肠炎、溶血性尿毒症1982 HTLV-II 1982 HTLV-II 毛细胞白血病毛细胞白血病1982 Burgdorferi1982 Burgdorferi螺旋体螺旋体 莱姆病莱姆病1983 HIV 1983 HIV 爱滋病爱滋病1983 1983 幽门螺旋杆菌幽门螺

8、旋杆菌 消化性溃疡病消化性溃疡病1988 HEV 1988 HEV 肠道传播的非肠道传播的非A A、非、非B B型肝炎型肝炎1990 Guanarito1990 Guanarito病毒病毒 委内瑞拉出血热委内瑞拉出血热1992 1992 霍乱弧菌霍乱弧菌O139 O139 与流行性霍乱有关的新株与流行性霍乱有关的新株1992 Hellem1992 Hellem巴尔通氏体巴尔通氏体 猫抓病，杆状血管瘤病猫抓病，杆状血管瘤病1994 Sabia1994 Sabia病毒病毒 巴西出血热巴西出血热1995 G1995 G型肝炎病毒（型肝炎病毒（HGVHGV） 非肠道传播的非非肠道传播的非A A、非、非

9、B B型肝炎型肝炎1995 1995 人类疱疹病毒人类疱疹病毒8 8型型 与爱滋病有关的与爱滋病有关的KaposiKaposi肉瘤肉瘤1996 TSE1996 TSE致病因子致病因子 克罗伊茨非尔特克罗伊茨非尔特- -雅各布病的新变型雅各布病的新变型1997 1997 禽流感病毒禽流感病毒A A（H5N1H5N1） 流感流感 病原微生物的致病机制方面病原微生物的致病机制方面 微生物基因组研究方面微生物基因组研究方面 微生物检测技术方面微生物检测技术方面 防治病原微生物措施方面防治病原微生物措施方面感染性疾病与人类感染性疾病与人类人类已经宣布消灭的疾病：天花在某些地区已经得到控制的疾病：麻疹、脊

10、髓灰质炎、白喉、百日咳、结核、鼠疫正在流行的疾病：伤寒、痢疾、病毒性肝炎、霍乱感染性疾病与人类感染性疾病与人类新发生的传染性疾病新发生的传染性疾病原有微生物的再发原有微生物的再发1、原已存在但未被认为是传染病原已存在但未被认为是传染病例如，消化性溃疡例如，消化性溃疡 ,T,T细胞白血病细胞白血病 2、可能早已存在但未知可能早已存在但未知,技术进步发现或技术进步发现或人畜接触机会增加人畜接触机会增加例如，丙型肝炎例如，丙型肝炎, ,莱姆病莱姆病3、过去确实不存在过去确实不存在,由于微生物发生变异而产生由于微生物发生变异而产生例如，例如， AIDS, O139 ,AIDS, O139 ,耐药菌株耐

11、药菌株, ,禽流感禽流感,SARS,SARS新发生的传染性疾病的原因新发生的传染性疾病的原因u人类的不良行为人类的不良行为进入以前未进入的原始森林和地区进入以前未进入的原始森林和地区采矿采矿 旅游旅游 开垦开垦 嗜食野生动物嗜食野生动物 宠物热宠物热性乱和吸毒性乱和吸毒u气候气候u都市化都市化人口迁移人口迁移 拥挤拥挤 易感人群增加易感人群增加 “贫民区贫民区”u医源性感染和滥用抗生素医源性感染和滥用抗生素u战争战争 贸易贸易 水土流失水土流失u微生物的持续不断变异微生物的持续不断变异新近认识的致病微生物新近认识的致病微生物 禽流感病毒、禽流感病毒、SARSSARS、H1N1H1N1、产、产N

12、DM-1NDM-1细菌细菌产产NDM-1NDM-1细菌细菌超级细菌超级细菌?产NDM-1细菌 产NDM-1细菌：全称“产型新德里金属-内酰胺酶（New Delhi Metallo-lactamase 1, NDM-1）肠杆菌科细菌”，简称“产NDM-1细菌”，是一种对多种抗菌药物广泛耐药的细菌，主要为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌； 特点：属于肠杆菌科细菌，致病力与普通肠杆菌科细菌没有差别；由于产生NDM-1导致广泛耐药，为“泛耐药菌”；主要导致医院感染；源于南亚地区，已在全球播散。 细菌耐药概念 多重耐药（multiple drug resistance, MRD）: 指细菌同时对三种以上结构不同

13、（作用机制不同）抗菌药物耐药，如头孢菌素、喹诺酮类、氨基糖苷类； 泛耐药（pan-drug resistance, PDR）:细菌对本身敏感的所有药物耐药； 超级细菌（superbug）:并非科学概念，一般指PDR与部分MDR，没有确切定义，以下细菌属于此列：MRSA/VRSA;VRE;MDR-PA,PDR-AB;ESBL(+)+AmpC(+) 肠杆菌产碳青霉烯酶肠杆菌（包括产NDM-1细菌）细菌耐药的危害Cosgrove, et al.Clinical Infectious Diseases 2006; 42:S829结果耐药菌感染(33例)敏感菌感染（66例）RR(95%CI)P 值 病死

14、率（%）159-住院时间（天）1171.73（1.14-2.65）0.01矫正住院时间（天）1171.23(0.81-1.87)0.34医疗费用（$）66590222311.710.04产与不产产与不产ESBL大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌感染的后果比较大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌感染的后果比较细菌耐药的危害项目 耐药组 对照组感染结局：% 治愈33.345.4 恶化9.1 4.0病死率%11.7 5.4抗生素使用种数 3.4/3 2.2/2抗生素药费合计(元)均数/中位数5485.87143.3/2820.51849.03278.9/802.5总费用合计（元）均数/中位数74511.7121406.8

15、 /29052.519852.938268.4 /7445.5住院时间（天）33.939.2/21.018.123.7/12.0感染治疗时间（天）22.121.1/15.011.912.5/9.0肖永红 等，抗生素类药物滥用公共问题研究，2008为什么需要关注产NDM-1细菌 泛耐药导致的治疗挑战； 多种肠杆菌科细菌发现； 快速从南亚地区传播到欧美国家； 不仅在医院感染这种发现，同时社区感染这种发现。产NDM-1细菌的发现 2008年在一位印度裔瑞典尿路感染患者中发现对碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌，该菌对所有-内酰胺类抗菌药物耐药，对环丙沙星也不敏感，仅对多粘菌素E敏感； 该患者有多年糖尿病和中风

16、史，经常往返于印度和瑞典之间，此前4月曾因臀部脓肿在印度住院治疗，其后回到瑞典，因尿路感染再度入院； 这株细菌携带一种新型金属-内酰胺酶，研究人员根据患者感染地命名这种酶为NDM-1。 南亚和英国流行情况 Published online August 11, 2010 DOI:10.1016/S1473-3099(10)70143-2产NDM-1细菌种类肠杆菌科埃希菌属大肠埃希菌枸橼酸菌属弗劳地枸橼酸菌、异型枸橼酸菌、无丙二酸枸橼酸菌克雷伯菌属肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、臭鼻克雷伯菌肠杆菌属阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、板崎肠杆菌、聚团肠杆菌摩根菌属摩根摩根菌泛菌属成团泛菌、弥散泛菌普罗威登菌属产

17、碱普罗威登菌、斯氏普罗威登菌、鲁氏普罗威登菌沙雷菌属粘质沙雷菌、液化沙雷菌、深红沙雷菌、居泉沙雷菌变形杆菌属奇异变形杆菌、普通变形杆菌、产粘变形杆菌志贺菌属志贺、宋内、弗氏、鲍氏志贺菌沙门菌属伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、猪霍乱沙门菌、副伤寒沙门菌哈弗尼亚属蜂房哈弗尼亚菌耶尔森菌属鼠疫耶尔森菌，小肠结炎肠耶尔森菌、假结核耶尔森菌传播方式 医院内感染 污染的医疗器械; 污染的医疗用品; 污染的手 跨国传播 跨国医疗旅游产NDM-1细菌感染临床特点 产NDM-1细菌主要表现为多重耐药，致病力与敏感细菌没有差别； 主要引起医院感染；有社区感染报道； 感染危险因素： 危重患者，入住ICU； 长期住院患者；

18、使用广谱抗菌药物，或长期应用抗菌药物； 插管或侵袭性操作； 免疫抑制； 呼吸机应用; 产NDM-1细菌感染临床特点 主要感染类型： 泌尿道感染； 伤口感染； 医院肺炎；呼吸机相关肺炎； 血流感染； 导管相关感染； 感染表现没有特别之处。 碳青霉烯治疗感染无效，提示该类细菌感染可能，需要及时进行检查。实验室诊断 产NDM-1细菌感染临床表现与敏感菌没有差异，临床诊断困难； 对碳青霉烯治疗无效的阴性菌感染需要考虑这类细菌感染可能； 诊断主要依据实验室检查结果； 实验室检查分为三步： 产NDM-1细菌表型筛查美罗培南或亚胺培南纸片法（K-B法，10g纸片）或最低抑菌浓度（MIC）测定法对肠杆菌科细菌

19、进行初步筛查，达到以下标准，需进行表型确认。 K-B法：美罗培南或亚胺培南抑菌圈直径22mm。MIC测定法：美罗培南MIC2mg/L；或亚胺培南对大肠埃希菌、克雷伯菌属、沙门菌属和肠杆菌属MIC2mg/L。 亚胺培南亚胺培南美罗培南美罗培南亚胺培南亚胺培南美罗培南美罗培南产NDM-1细菌表型确认 双纸片协同试验:采用亚胺培南(10g)、EDTA（1500 g） 两种纸片进行K-B法，两纸片距离10-15mm，在含EDTA纸片方向处，亚胺培南抑菌圈扩大，即可判定产金属酶。产NDM-1细菌表型确认 采用亚胺培南（美罗培南）/EDTA复合纸片进行K-B法药敏试验，复合纸片比单药纸片的抑菌圈直径增大值

20、5mm；亚胺培南（美罗培南）/EDTA 复合E试条协同试验测定MIC，单药与复合制剂的MIC比值8;即可判定产金属酶。产NDM-1细菌基因确证 采用NDM-1的基因特异引物进行PCR扩增及产物测序。1.加强对产NDM-1细菌监测 医院重视临床微生物检验，提高细菌耐药监测能力； 临床参考细菌检验结果应用抗菌药物； 定期公布各医院细菌耐药监测结果； 定期回顾细菌耐药流行趋势，及时发现异常耐药现象，早期发现产NDM-1细菌加以控制。2.加强抗菌药物合理使用监管 医疗机构应当有专门抗菌药物合理使用管理小组，开展教育、培训、监督、检查抗菌药物使用情况； 严格执行相关管理规定，特别是抗菌药物分类管理规定。

21、 特殊使用抗菌药物卫生部卫办医政发(2009)38号第四代头孢菌素：头孢吡肟、头孢匹罗、头孢噻利等；碳青霉烯类抗菌药物：亚胺培南/西司他丁、美罗培南、帕尼培南/倍他米隆、比阿培南等；多肽类与其他抗菌药物：万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺等；抗真菌药物：卡泊芬净，米卡芬净，伊曲康唑（口服液、注射剂），伏立康唑（口服剂、注射剂），两性霉素B含脂制剂等。3.加强医院感染的预防与控制 加强医务人员感染控制教育、培训，强化对NDM-1细菌等多重耐药菌感染的预防、控制的认识。 在进行各种侵袭性操作中，严格执行无菌操作。 严格执行医务人员手卫生规范： 医疗机构必须提供充足的手卫生设施。 医务人员在

22、接触病人前后、进行侵入性操作前、接触病人使用的物品或处理其分泌物、排泄物后，必须洗手或用含醇类速干手消毒剂擦手。 3.加强医院感染的预防与控制3.加强医院感染的预防与控制 加强对重点部门尤其是ICU物体表面的清洁、消毒 。 消毒剂：含氯消毒剂、0.5%过氧乙酸、2%戊二醛、0.5%醋酸环己啶-乙醇等； 表面消毒方法：选择不同消毒液擦拭或浸泡。3.加强医院感染的预防与控制 隔离疑似或确诊产NDM-1细菌感染或定植者，预防耐药菌传播。采用接触隔离，将病人安置单独房间，接触患者时需要穿隔离衣、戴手套，相关医疗器械或物品如听诊器、血压计等专用，不能专用的物品，需用后严格消毒。 隔离期间需要定期检测耐药

23、菌情况。 二、原有微生物的再发二、原有微生物的再发 病毒性疾病病毒性疾病 狂犬病、登革热、黄热病狂犬病、登革热、黄热病 寄生虫寄生虫 疟疾、血吸虫病、神经囊尾幼病、棘阿米巴病、内脏疟疾、血吸虫病、神经囊尾幼病、棘阿米巴病、内脏利氏曼病、弓形虫病、贾第虫病利氏曼病、弓形虫病、贾第虫病 、棘球幼病、棘球幼病 细菌性细菌性 A A群链球菌、战壕热、鼠疫、白喉群链球菌、战壕热、鼠疫、白喉 、结核、百日咳、结核、百日咳、沙门菌属、肺炎球菌、霍乱沙门菌属、肺炎球菌、霍乱、多重耐药菌株的流行多重耐药菌株的流行多重耐药菌株的流行多重耐药菌株的流行u葡萄球菌葡萄球菌u肠球菌肠球菌u肺炎链球菌肺炎链球菌u肠杆菌科

24、肠杆菌科u结核分支杆菌结核分支杆菌多重耐药的结核杆菌多重耐药的结核杆菌 是指病人排出的是指病人排出的TBTB至少已对至少已对INHINH和和RFPRFP产生耐药或对产生耐药或对5 5种基本抗痨药物（种基本抗痨药物（INHINH、RFPRFP、链霉素、乙胺丁醇、链霉素、乙胺丁醇、砒嗪酰胺）中的两种以上（包括两种）耐药者砒嗪酰胺）中的两种以上（包括两种）耐药者 发生原因：单一化疗、不合理化疗、不规律化疗发生原因：单一化疗、不合理化疗、不规律化疗 对策：对策：合理化疗，预防合理化疗，预防MTBMTB出现出现加强检测，及时检出加强检测，及时检出MTB MTB 约有约有75%75%的临床分离株存在的临床

25、分离株存在RNARNA聚合酶聚合酶亚单位基因亚单位基因(rpo B)(rpo B)发生突变，对发生突变，对RFPRFP耐药耐药肠杆菌科肠杆菌科 对对三代头孢菌素耐药的肠杆菌科在临三代头孢菌素耐药的肠杆菌科在临床大量出现床大量出现 主要耐药机制主要耐药机制: :产生超广谱产生超广谱-内酰胺酶内酰胺酶( (Extend-Extend-spectrum -Lactamases,ESBLs)spectrum -Lactamases,ESBLs)持续产持续产型型-内酰胺酶内酰胺酶肠球菌肠球菌 可引起多种临床感染 对头孢菌素、林可霉素、磺胺类呈现天然耐药,对氨基糖甙类部分天然耐药 现已出现耐万古霉素的肠球

26、菌(VRE)耐万古霉素的肠球菌耐万古霉素的肠球菌(VRE)(VRE) 由由VanA,VanBVanA,VanB和和VanCVanC控制控制 VanAVanA对万古霉素和替考拉宁高度耐药对万古霉素和替考拉宁高度耐药 VanBVanB对万古霉素高度耐药对万古霉素高度耐药, ,对替考拉宁敏感对替考拉宁敏感 VanCVanC对万古霉素和替考拉宁高度耐药对万古霉素和替考拉宁高度耐药 选用氯霉素红霉素四环素及利福平或其它选用氯霉素红霉素四环素及利福平或其它药物药物葡萄球菌葡萄球菌 对甲氧西林耐药的葡萄球菌对甲氧西林耐药的葡萄球菌 对万古霉素中度敏感的葡萄球菌对万古霉素中度敏感的葡萄球菌 对万古霉素耐药的葡

27、萄球菌对万古霉素耐药的葡萄球菌对甲氧西林耐药的葡萄球菌对甲氧西林耐药的葡萄球菌 由由mecAmecA基因编码的基因编码的PBP2aPBP2a与现有的与现有的-内酰胺类抗生素亲和力极低内酰胺类抗生素亲和力极低 常伴有大内环酯类、林可霉素类和其常伴有大内环酯类、林可霉素类和其它抗生素的多重耐药它抗生素的多重耐药 常呈异质性表达常呈异质性表达 万古霉素是唯一有确切疗效的药物万古霉素是唯一有确切疗效的药物 凝固酶阳性和阴性的葡萄球菌均有较凝固酶阳性和阴性的葡萄球菌均有较高的发生率高的发生率MRSAMRSA的调控机制的调控机制 调控基因调控基因 mec I, mec RImec I, mec RI Me

28、c I Mec I 为阻遏基因，其编码产物为为阻遏基因，其编码产物为mec Imec I蛋蛋白，为白，为mec Amec A基因的抑制子（基因的抑制子（repressor)repressor) Mec RI Mec RI 为诱导剂激活基因，在诱导剂存为诱导剂激活基因，在诱导剂存在时编码在时编码mec RImec RI蛋白，是一种辅助诱导因蛋白，是一种辅助诱导因子（子（co-inducer),co-inducer),解除对解除对mec Imec I蛋白对蛋白对mec mec A A基因的抑制基因的抑制对万古霉素中度敏感的对万古霉素中度敏感的葡萄球菌（葡萄球菌（VISA or GISA)VISA

29、or GISA)u对万古霉素的对万古霉素的MICMIC在在8-16ug/ml8-16ug/mlu已有数起报道、主要发生在已有数起报道、主要发生在MRSMRS中中u测定困难：异源性表达、生长缓慢、测定困难：异源性表达、生长缓慢、常规方法不能识别（常规方法不能识别（K-BK-B法、法、MicroScan rapid plate)MicroScan rapid plate)uVitek Vitek 旧版软件不能测定（只能测到旧版软件不能测定（只能测到4ug/ml4ug/ml万古霉素），新版能测定万古霉素），新版能测定三、自动化技术在微生物学三、自动化技术在微生物学检验中的应用检验中的应用 数码及数值

30、鉴定技术数码及数值鉴定技术 常见的鉴定系统常见的鉴定系统 常见的鉴定系统常见的鉴定系统 VITEK AMSVITEK AMS系统系统 icroScanicroScan系统系统 BD BD BD Phoenix SystemBD Phoenix System BBL Crystal 半自动细菌鉴定系统半自动细菌鉴定系统BBL Crystal AutoReader自动细菌鉴定自动细菌鉴定系统系统 使用自动化鉴定仪的局限性使用自动化鉴定仪的局限性 所有实验室工作人员必须认识仪器的局限性。所有实验室工作人员必须认识仪器的局限性。 细菌的分类系统随着人们对细菌本质认识的加深细菌的分类系统随着人们对细菌本

31、质认识的加深而不断演变，及时补充和修改数据库是自动化鉴而不断演变，及时补充和修改数据库是自动化鉴定仪生存的根本定仪生存的根本 要加强对自动化仪器的日常维护和质控要加强对自动化仪器的日常维护和质控 自动化鉴定仪得出的结果，必须要与其它已获得自动化鉴定仪得出的结果，必须要与其它已获得的生物性状（如标本来源、菌落特征及其它的生的生物性状（如标本来源、菌落特征及其它的生理生化特征）进行核对，以避免错误的鉴定。理生化特征）进行核对，以避免错误的鉴定。四、分子生物学在微生物检验应用四、分子生物学在微生物检验应用 核酸杂交核酸杂交( (生物芯片）生物芯片） 核酸扩增技术核酸扩增技术 靶扩增系统，包括靶扩增系

32、统，包括PCRPCR、TMATMA、SDASDA； 探针扩增系统，包括探针扩增系统，包括QbetaQbeta复制酶、复制酶、LCRLCR； 标记扩增技术。标记扩增技术。 多重多重PCRPCR，RT-PCRRT-PCR，nest-PCRnest-PCR，RAPD, RAPD, PCR-SSCPPCR-SSCP等技术等技术- -细菌鉴定及分类细菌鉴定及分类分子生物学分子生物学- -耐药性检测耐药性检测 耐药基因的检测耐药基因的检测 糖肽类：糖肽类：vanAvanA，vanBvanB，vanBvanB2 2,vanC,vanC1 1，vanCvanC3 3，vanDvanD。 -内酰胺类：内酰胺类：

33、mecAmecA，blablaTEMTEM，blablaROB-1ROB-1，blablaSHVSHV，blablaIMPIMP，blablaMIR-1MIR-1，blablaOXAOXA，blablaPER-1PER-1，blablaPER-2PER-2，blablaOXY-1OXY-1，blablaOXA-10/11OXA-10/11喹诺酮类：喹诺酮类：gyrAgyrA，gyrBgyrB，parE parE 乙胺丁醇：乙胺丁醇：embBembB，吡嗪酰胺，吡嗪酰胺pncApncA。利福平。利福平rpoBrpoB。 链霉素：链霉素：rpsLrpsL，rrsrrs。 异烟肼：异烟肼：katGk

34、atG，inhAinhA，ahpC ahpC 应用基因技术进行分型和鉴定应用基因技术进行分型和鉴定 DNADNA杂交可得出杂交可得出DNADNA之间核苷酸顺序的互补程之间核苷酸顺序的互补程度，从而推断不同细菌基因组间的同源性。度，从而推断不同细菌基因组间的同源性。 目前最常用的是复性速率法目前最常用的是复性速率法同一菌的复性率为同一菌的复性率为100%100%80%-90%80%-90%的同源为同一种内同一亚种的细菌的同源为同一种内同一亚种的细菌60%-70%60%-70%同源性为同一种内不同亚种的细菌同源性为同一种内不同亚种的细菌20%-60%20%-60%同源则是同一属中的不同菌种同源则是

35、同一属中的不同菌种 这种方法还可对新菌种或表型性状差别很小这种方法还可对新菌种或表型性状差别很小而难以肯定的菌株做出较可靠的判定，并可而难以肯定的菌株做出较可靠的判定，并可修正其他方法的分类和鉴定错误修正其他方法的分类和鉴定错误 rRNA-DNArRNA-DNA杂交杂交 变性变性rRNArRNA与变性与变性DNADNA混合时，混合时，rRNArRNA与其互补与其互补的的DNADNA链形成杂交双链，链形成杂交双链，rRNArRNA分子与异源分子与异源DNADNA杂交时，也能在其同源区形成互补双链，这种杂交时，也能在其同源区形成互补双链，这种杂交双链的稳定性与其同源性成正相关，适于杂交双链的稳定性

36、与其同源性成正相关，适于细菌属及属上水平的分类研究。现最常用的是细菌属及属上水平的分类研究。现最常用的是硝酸纤维膜结合法硝酸纤维膜结合法 16S rRNA16S rRNA序列测定序列测定 rRNArRNA分子具有高度保守性，在所有的细胞生物分子具有高度保守性，在所有的细胞生物中都存在，在长期的进化中，中都存在，在长期的进化中，16SrRNA16SrRNA的总碱的总碱基数有所不同，保守的部分使不同序列很容易基数有所不同，保守的部分使不同序列很容易相互对齐进行比较相互对齐进行比较 在在16S16S和和23S rRNA23S rRNA的间隔区，各菌种的长度是的间隔区，各菌种的长度是不一样的，利用包含

37、不一样的，利用包含16S16S和和23S rRNA23S rRNA部分序列部分序列的引物对间隔区进行扩增，分析其长度多态，的引物对间隔区进行扩增，分析其长度多态，或结合或结合RFLPRFLP技术进行分析来鉴定菌种技术进行分析来鉴定菌种 此外限制性内切酶长度多态性分析（此外限制性内切酶长度多态性分析（RFLPRFLP）、脉冲场凝胶电泳（、脉冲场凝胶电泳（PFGEPFGE）、随机引物扩增）、随机引物扩增法（法（RAPDRAPD）等技术常用于菌株间的差异比较）等技术常用于菌株间的差异比较五、病毒变异的临床意义五、病毒变异的临床意义病毒突变体的起源病毒突变体的起源某些病毒的基因突变率可高达某些病毒的基

38、因突变率可高达1010-3-31010-4-4（例如逆转录病毒（例如逆转录病毒HIVHIV），），而有些病毒突变率仅为而有些病毒突变率仅为1010-8-81010-11-11（如疱疹病毒），相当于细胞（如疱疹病毒），相当于细胞DNADNA的自发突变率。大多数的自发突变率。大多数RNARNA病毒的突变率要远远高于病毒的突变率要远远高于DNADNA病毒病毒诱发突变诱发突变 突变具有双重作用，病毒突变可使其抗原性发生改变突变具有双重作用，病毒突变可使其抗原性发生改变, ,从而逃逸从而逃逸免疫应答，但大多数突变是有害的，并会产生许多缺陷颗粒免疫应答，但大多数突变是有害的，并会产生许多缺陷颗粒人工突变人

39、工突变 现代分子生物学技术可以对病毒基因组进行突变，如直接诱发寡现代分子生物学技术可以对病毒基因组进行突变，如直接诱发寡核苷酸突变和基于核苷酸突变和基于PCRPCR的基因突变技术已得到广泛应用。现在的基因突变技术已得到广泛应用。现在结合酶消化技术（引起基因缺失）和接头扫描技术（形成基因结合酶消化技术（引起基因缺失）和接头扫描技术（形成基因插入），可以在病毒基因组的任何特异性位点，准确安全地诱插入），可以在病毒基因组的任何特异性位点，准确安全地诱导出几乎任何类型的突变。这类突变可成为人工突变。导出几乎任何类型的突变。这类突变可成为人工突变。病毒突变的类型病毒突变的类型 生化标志物基因突变生化标志

40、物基因突变：耐药基因突变，导致病毒毒力改变的特异突变；耐药基因突变，导致病毒毒力改变的特异突变；形成多态性，使蛋白质和核酸电泳迁移率发生改变以及对灭活剂形成多态性，使蛋白质和核酸电泳迁移率发生改变以及对灭活剂的敏感性改变。的敏感性改变。 缺失突变：缺失突变：在某些方面与无义突变相似，但可以是一个或在某些方面与无义突变相似，但可以是一个或多个病毒基因缺失，也可以是基因组中非编码调控区（如多个病毒基因缺失，也可以是基因组中非编码调控区（如启动子等）的缺失。启动子等）的缺失。自发缺失突变体通常可在病毒群体中累积，生成大量缺陷自发缺失突变体通常可在病毒群体中累积，生成大量缺陷- -干扰（干扰（D.I.

41、D.I.）颗粒。尽管这些颗粒不具有感染性，但仍有一定的遗传学上）颗粒。尽管这些颗粒不具有感染性，但仍有一定的遗传学上的意义，有人认为它们在某些病毒感染过程中以及发病机理方面的意义，有人认为它们在某些病毒感染过程中以及发病机理方面起着重要作用。通过重组，可以使基因缺失病毒回复突变为野生起着重要作用。通过重组，可以使基因缺失病毒回复突变为野生型病毒，但发生频率通常比较低。型病毒，但发生频率通常比较低。 肝炎病毒的变异及基因分型概述肝炎病毒的变异及基因分型概述n HAVHAV为小为小RNARNA病毒科成员，现已被归入嗜病毒科成员，现已被归入嗜肝肝RNARNA病毒科。人源病毒科。人源HAVHAV存在存

42、在4 4个基因型个基因型（ 型），型间核苷酸同源性型），型间核苷酸同源性85%,85%.85%.不同基因型的不同基因型的HAVHAV抗原性相同，抗原性相同，因此，因此，HAVHAV只有一个血清型只有一个血清型n HBVHBV为嗜肝为嗜肝DNADNA病毒科成员，可分为病毒科成员，可分为6 6个基个基因型因型（基因型（基因型AFAF）, ,不同地域、人种的不同地域、人种的HBVHBV基因型可能有着不同的分布。基因型的基因型可能有着不同的分布。基因型的差异与致病性、抗病毒治疗效果、预后等的差异与致病性、抗病毒治疗效果、预后等的关系尚无明确结论，尚待进一步研究关系尚无明确结论，尚待进一步研究肝炎病毒的

43、变异及基因分型概述肝炎病毒的变异及基因分型概述n HDV HDV是一种是一种RNARNA缺陷病毒现被归类于卫星病毒科成员。世界缺陷病毒现被归类于卫星病毒科成员。世界各地各地HDVHDV不同分离株的核苷酸变异在不同分离株的核苷酸变异在11%11%17%17%之间。之间。HDVHDV可分为可分为3 3个基因型个基因型 ，大部分分离株为，大部分分离株为型，型，型和型和型分别型分别在日本和南美多见。在日本和南美多见。n HCVHCV为黄病毒科成员，该病毒变异较大，目前至少存在为黄病毒科成员，该病毒变异较大，目前至少存在6 6个个以上的基因型以上的基因型。HCVHCV的基因型与致病、预后、干扰素的治疗的

44、基因型与致病、预后、干扰素的治疗等密切相关，需引起高度重视。等密切相关，需引起高度重视。n HEVHEV为环状病毒科成员，感染后导致急性肝炎，临床表现和为环状病毒科成员，感染后导致急性肝炎，临床表现和发病经过与甲型肝炎有一定差异，比如妊娠妇女感染的死亡发病经过与甲型肝炎有一定差异，比如妊娠妇女感染的死亡率较高；发病者年龄分布不明显；更容易发生瘀胆；重型肝率较高；发病者年龄分布不明显；更容易发生瘀胆；重型肝炎的发生率高于甲肝；患病后无终身免疫等等。世界各地的炎的发生率高于甲肝；患病后无终身免疫等等。世界各地的HEVHEV分离株可分为分离株可分为2 2个基因型个基因型，即缅甸型和墨西哥型，我国，即

45、缅甸型和墨西哥型，我国、东南亚各国及印度流行的为缅甸型。、东南亚各国及印度流行的为缅甸型。HBV-HBV-生物学特性生物学特性 不完全闭合环状双链不完全闭合环状双链DNADNA S S、C C、P P和和X 4X 4个个ORFsORFs S S基因基因 C C基因基因 P P基因基因 X X基因基因S S基因区变异基因区变异 S S基因区包括前基因区包括前S1S1、前、前S2S2及及S S基因，分别编码前基因，分别编码前S1S1蛋白、前蛋白、前S2S2蛋白及主蛋白蛋白及主蛋白 前前S1S1蛋白能调节蛋白能调节HBsAgHBsAg的分泌；它的第的分泌；它的第212147aa47aa是是HBVHB

46、V与靶与靶细胞上特异受体结合的主要部位，但第细胞上特异受体结合的主要部位，但第3 377aa77aa均参与均参与HBVHBV感感染靶细胞的过程染靶细胞的过程 前前S2S2蛋白蛋白N N末端的末端的5 5个个aaaa是自被感染细胞内分泌完整病毒颗粒是自被感染细胞内分泌完整病毒颗粒所必需的。所必需的。前前S1S1起始码下游第起始码下游第230230碱基，可突变形成终止码，碱基，可突变形成终止码，并影响前并影响前S2S2起始码，这种突变与起始码，这种突变与HBVHBV逃避干扰素治疗和宿主免逃避干扰素治疗和宿主免疫清除有关疫清除有关 HBV DNAHBV DNA第第2995-3177nt2995-31

47、77nt位于前位于前S S开放读码框开放读码框(ORF)(ORF)内，但其内，但其缺缺失可削弱前失可削弱前S S的免疫性的免疫性，但仍能保留与肝细胞的结合位点，但仍能保留与肝细胞的结合位点，有有利于利于HBVHBV逃避机体的免疫攻击，形成慢性携带状态逃避机体的免疫攻击，形成慢性携带状态。S S基因区变异基因区变异 HBsAgHBsAg第第99-169aa99-169aa是诱导中和抗体产生的决是诱导中和抗体产生的决定簇定簇。124-137aa124-137aa和和138-l47aa138-l47aa，特别是第，特别是第142142，l44l44，145aa145aa三处突变，包括典型的三处突变，

48、包括典型的“疫苗疫苗逃避株逃避株”145145甘氨酸甘氨酸精氨酸。精氨酸。这些突变可削这些突变可削弱或改变弱或改变HBsAgHBsAg的免疫原性，降低的免疫原性，降低HBsAgHBsAg被被HBIGHBIG识别的能力；识别的能力； 这些突变可能是长期免疫压力筛选的结果。这些突变可能是长期免疫压力筛选的结果。P P基因区变异基因区变异 P P基因区编码基因区编码HBV DNAHBV DNA聚合酶聚合酶(DNAP)(DNAP)，其自然突变率与，其自然突变率与逆转录病毒逆转录病毒gaggag基因相近，每年约为基因相近，每年约为2 21010-4-4碱基位点碱基位点 抗抗HBVHBV药物胞苷类似物拉咪

49、呋啶药物胞苷类似物拉咪呋啶(1amivudine)(1amivudine)和鸟苷类似和鸟苷类似物泛昔洛韦物泛昔洛韦(famciclovir) (famciclovir) ，主要作用于，主要作用于DNAPDNAP，通过与底，通过与底物物dNTPdNTP竞争结合以抑制竞争结合以抑制HBVHBV的逆转录和复制的逆转录和复制 HBVHBV耐药株的突变就发生在耐药株的突变就发生在DNAPDNAP基因内。基因内。DNAPDNAP催化中催化中心由心由“酪氨酰酪氨酰(Y)(Y)、蛋氨酰、蛋氨酰(M)(M)、天冬氨酰、天冬氨酰(D)”(D)”基序基序(YMDD (YMDD motif)motif)组成，是组成，

50、是DNAPDNAP发挥催化活性所必需的关键结构。发挥催化活性所必需的关键结构。针对核苷类药物的抗病毒治疗，病毒针对核苷类药物的抗病毒治疗，病毒YMDDYMDD中中MM突变为异突变为异亮氨酸亮氨酸(I)(I)或缬氨酸或缬氨酸(V)(V)。发生突变以后可能使病情加剧（。发生突变以后可能使病情加剧（即所谓反跳），对所用药物产生耐受即所谓反跳），对所用药物产生耐受S S基因区和基因区和P P基因区变异的相互影响基因区变异的相互影响 由于由于S S基因区完全重叠于基因区完全重叠于P P基因区内，特别是基因区内，特别是HBsAgHBsAg决定簇区和决定簇区和DNAPDNAP致第致第454-524aa(45