DNA甲基化.ppt

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1、2明星熊猫明星熊猫“滚滚滚滚”为什么为什么是是的？的？v 19421942年，年，Conrad Hal Waddington Conrad Hal Waddington 提出提出表观遗传学表观遗传学( ( Epigenetics)Epigenetics)的概念，以此解释物种的的概念，以此解释物种的内在基因内在基因与与外观表现外观表现之之间的关系。间的关系。 基因序列基因序列(Genotype)(Genotype)的改变可能导致功能及表型的改变可能导致功能及表型(Phenotype)(Phenotype)的改变。的改变。 基因型通过一些基因型通过一些“偶然的、不确定的机制偶然的、不确定的机制”决

2、定了不同的决定了不同的表型。表型。 生物的不同特征完全生物的不同特征完全随机随机获得获得Waddingtons epigenetics基因型基因型表型表型Waddingtons epigenetics基因型基因型表型表型DNA双螺旋基因的结构基因表达受多种因素调控基因表达受多种因素调控 现代表观遗传学现代表观遗传学概念：基因的概念：基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型 生物的不同特征由基因生物的不同特征由基因定向定向调控调控表观遗传学的现象（基因表达的调控方式）：表观遗传学的

3、现象（基因表达的调控方式）： 组蛋白修饰 MicroRNA Genomic imprinting真核生物基因表达调控真核生物基因表达调控层次：层次：1、DNA水平调节水平调节2、转录水平调节转录水平调节3、转录后水平的调节转录后水平的调节4、翻译水平调节翻译水平调节5、翻译后加工的调节翻译后加工的调节DNA转录初产物转录初产物RNAmRNA蛋白质前体蛋白质前体mRNA降解物降解物活性蛋白质活性蛋白质DNA水平调节水平调节转录水平调节转录水平调节转录后水转录后水平的调节平的调节翻译调节翻译调节mRNA降解降解的调节的调节翻译后加翻译后加工的调节工的调节核核细胞质细胞质 DNA甲基化主要形成甲基化

4、主要形成5-mC和少量的和少量的N6-甲甲基嘌呤（基嘌呤（N6-mA）及）及7-甲基鸟嘌呤（甲基鸟嘌呤（7-mG） 结构基因中广泛存在着相邻的两个结构基因中广泛存在着相邻的两个CG，其中胞嘧啶的，其中胞嘧啶的5 位碳原子通常被甲基化位碳原子通常被甲基化, 且两个甲基集团在且两个甲基集团在DNA 双链大沟中呈特定三维结构（双链大沟中呈特定三维结构（CpG）CpG 岛（岛（cpg island） 结构基因组中结构基因组中70% 90% 的独立的独立CpG 都被甲基都被甲基化化, 未甲基化未甲基化的的CpG 成簇地聚集形成成簇地聚集形成CpG 岛岛主要位于结构基因的启动子和第一外显子区域，主要位于结

5、构基因的启动子和第一外显子区域，约有约有60以上基因的启动子含有以上基因的启动子含有CpG岛。岛。 是结构基因启动子的是结构基因启动子的核心序列核心序列和和转录起始点转录起始点 CPG island的功能：通过甲基化与去甲基化，调控下游基因的表达的功能：通过甲基化与去甲基化，调控下游基因的表达 基因表达的调控开关基因表达的调控开关 在发育和分化中调控基因的表达；在发育和分化中调控基因的表达；l特征性表型基因的表达（肤色、毛发）特征性表型基因的表达（肤色、毛发） lX染色体的失活（染色体的失活（X-inactivation ） DNA甲基化生物学作用 IAP: intracisternal A

6、particle 去甲基化：灰鼠基因（agouti）仅微量表达 甲基化：基因超量表达X染色体的失活（染色体的失活（X-inactivation ）l 生长发育过程中，雌性哺乳类动物细胞中的两生长发育过程中，雌性哺乳类动物细胞中的两条条X染色体其中一条失去活性的现象。染色体其中一条失去活性的现象。l 避免因拥有两条避免因拥有两条X染色体而产生染色体而产生 双倍双倍的基因产物，保持和雄性动物的基因产物，保持和雄性动物 X染色体染色体数量数量及及功能功能上的一致性。上的一致性。X染色体上存在一个与染色体上存在一个与X染色体失活有密切联系的染色体失活有密切联系的核心部位。核心区命名位核心部位。核心区命

7、名位X染色体失活中心染色体失活中心（X-chormosome inactivation center，Xic），其定位），其定位在人在人Xq13区（区（Barr氏小体浓缩部位）。氏小体浓缩部位）。研究发现失活的染色体上研究发现失活的染色体上DNA序列都呈序列都呈高度甲基高度甲基化化，导致绝大多数基因转录处于，导致绝大多数基因转录处于关闭关闭状态。状态。X-chromosome inactivation雌性家猫的一条雌性家猫的一条X染色体完全失去活性染色体完全失去活性RainbowCopy CatAllieX染色体失活染色体失活DNA 甲基转移酶甲基转移酶(DNMT)的活性的活性 哺乳动物体内有

8、三种哺乳动物体内有三种DNA 甲基化转移酶：甲基化转移酶：Dnmt1、Dnmt3a 和和Dnmt3b。nDNMT1- 持续性持续性DNA 甲基转移酶；与甲基转移酶；与甲基化甲基化相关，缺相关，缺乏引起基因组乏引起基因组低甲基化低甲基化，染色体缺失、重排、突变畸形，染色体缺失、重排、突变畸形nDNMT3a、DNMT3b- 从头甲基转移酶；与从头甲基转移酶；与去甲基化去甲基化相相关，在胚胎干细胞和早期胚胎中高度表达，缺乏引起胚关，在胚胎干细胞和早期胚胎中高度表达，缺乏引起胚胎死亡，在肿瘤组织中广泛高表达胎死亡，在肿瘤组织中广泛高表达SCIENCE VOL 300 18 APRIL 2003正常小鼠

9、正常小鼠 (Dnmt1 +/+) 阳性对照阳性对照DNM1酶缺乏小鼠模型 (Dnmt1 chip/) 实验组实验组Embryonic stem (ES) 细胞 (Dnmt1 /) 阴性对照阴性对照l Dnmt1 chip/小鼠小鼠Dnmt1酶的表达量明酶的表达量明显减少，大约为正常显减少，大约为正常小鼠的小鼠的10%lDnmt1 chip/小鼠体重仅小鼠体重仅为正常小鼠为正常小鼠66%l 80%的小鼠在的小鼠在4-8个月内个月内产生产生T细胞性淋巴瘤细胞性淋巴瘤lc-myc癌基因在癌基因在Dnmt1 chip/小鼠中异常高表达小鼠中异常高表达 组蛋白的甲基化组蛋白的甲基化n 真核生物的组蛋白真

10、核生物的组蛋白N 末端或末端或C 末端氨基酸残基可生乙酰末端氨基酸残基可生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等共价修饰，并影响基因转化、甲基化、磷酸化、泛素化等共价修饰，并影响基因转录。录。n H3K9 的甲基化与的甲基化与DNA 的甲基化在基因的沉默机制中具的甲基化在基因的沉默机制中具有有协同协同作用作用 n H3K4 的甲基化的甲基化拮抗拮抗DNA 甲基化所产生的基因沉默甲基化所产生的基因沉默 RNA 干扰干扰n 一般认为一般认为RNA 干扰干扰( RNAi) 是正常生物体内抑制特定是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象基因表达的一种现象 翻译、转录后翻译、转录后水平水平n siRNA 指导

11、指导DNA 甲基化甲基化(RdDM) 现象证实：现象证实：siRNA 可以通过可以通过DNA 甲基转移酶甲基转移酶Dnmt1和和Dnmt3b介导介导DNA 甲基化甲基化 DNA水平水平正常生物DNA甲基化 DNA甲基化始发于胚胎早期，随着组织细胞甲基化始发于胚胎早期，随着组织细胞分化发育，基因组分化发育，基因组DNA经历了去甲基化、区域性经历了去甲基化、区域性的重新甲基化以及组织特异基因选择性的去甲基的重新甲基化以及组织特异基因选择性的去甲基化的过程。最后，这种化的过程。最后，这种DNA甲基化模式就相对稳甲基化模式就相对稳定下来。定下来。肿瘤组织的DNA甲基化 肿瘤中普遍存在肿瘤中普遍存在DN

12、A甲基化状态的改变，其特点甲基化状态的改变，其特点是是总体总体的甲基化水平的甲基化水平降低降低与与局部局部的甲基化水平的甲基化水平升高升高。 低甲基化可诱导低甲基化可诱导原癌基因原癌基因和转座子成分活化，基和转座子成分活化，基因印迹缺失以及染色体不稳定性增加，最终诱发肿瘤因印迹缺失以及染色体不稳定性增加，最终诱发肿瘤 在整体低甲基化的水平下，某些在整体低甲基化的水平下，某些抑癌基因抑癌基因发生高发生高甲基化，导致基因沉默，对肿瘤抑制能力低下甲基化，导致基因沉默，对肿瘤抑制能力低下DNA甲基化与肿瘤的关系肿瘤细胞的特征：肿瘤细胞的特征：n癌基因低甲基化癌基因低甲基化 被激活；被激活；n抑癌基因高

13、甲基化抑癌基因高甲基化 被沉默被沉默 甲基化水平与肿瘤生物学特性密切相关，甲基化水平与肿瘤生物学特性密切相关，DNA甲甲基化水平越基化水平越低，低，染色体越染色体越容易容易发生功能异常，肿瘤的发生功能异常，肿瘤的浸润能力就越浸润能力就越高高，临床分期也愈，临床分期也愈晚晚常见易被甲基化的抑癌基因与修复基因及其作用 基因基因基因沉默对肿瘤的意义基因沉默对肿瘤的意义肿瘤类型肿瘤类型APC对细胞增殖、迁移、粘附、骨架重组及染色质稳定性失去调节作用乳腺癌、肺癌、食管癌、结肠癌、胃癌、胰、 肝癌BRCA1与DNA 修复与转录激活有关乳腺癌、卵巢癌 CDKN2A/p16周期素依赖性蛋白激酶抑制剂GIT 、

14、头与颈部瘤、NHL、肺癌 DAPK1钙/钙调素-依赖的丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶; 凋亡抑制肺癌E-cadherin增强增殖、侵袭与转移乳腺癌 、甲状腺癌、胃癌ER激素抵抗乳腺癌、前列腺癌GSTP1失去对致癌物活性代谢产物的解毒作用前列腺癌、乳腺癌、肾癌hMLH1缺损DNA错配修复,基因点突变结肠癌、胃癌、子宫内膜瘤、卵巢癌MGMTp53-相关基因，与DNA 修复及耐药性有关肺癌、脑瘤P15细胞的过度激活与增殖非白血性白血病、淋巴瘤、鳞状细胞癌、肺癌 RASSF1A失去了对G1/S负调控抑制作用肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、鼻咽癌Rb不能抑制DNA复制和细胞分裂必需的基因转录成视网膜细胞瘤、少突神经

15、胶质(细胞)瘤VHL错误的降解RNA结合蛋白质，改变RNA稳定性肾细胞癌缩写: APC, adenomatous polyposis coli; BRCA1, breast cancer 1; CDKN2A/p16, cyclin-dependent kinase 2A; DAPK1, death-associated protein kinase 1; ER, estrogen receptor; GSTP1, glutathione S-transferase Pi 1; hMLH1, Mut L homologue 1; MGMT, O-6 methylguanine-DNA methy

16、ltransferase; RASSF1A, Ras association domain family member 1; Rb, retinoblastoma; VHL, von Hippel-Lindau; GIT, gastrointestinal tract; NHL, non-Hodgkins lymphoma. 有学者研究认为有学者研究认为,DNA甲基化是继基因结构变异甲基化是继基因结构变异即突变和缺失之后的第即突变和缺失之后的第3种抑癌基因失活机制。种抑癌基因失活机制。n CpG岛保护因子缺乏岛保护因子缺乏 n DNMT3高表达和高表达和DNMT复合体调控障碍复合体调控障碍 n

17、 复制周期时间错误复制周期时间错误n DNA甲基化导致遗传不稳定性。甲基化导致遗传不稳定性。Milutinovic S, DNA methyltransferase inhibition induces the transcription of the tumor suppressor p21(WAF1/CIP1/ sdi1) J . J Biol Chem, 2000, 275 (9) : 6 353 - 6 359.肿瘤的早期诊断肿瘤的早期诊断 基因启动子区域的基因启动子区域的CpG岛甲基化能沉默基因转岛甲基化能沉默基因转录，在正常细胞中是一种调节基因表达的手段。录，在正常细胞中是一种调节

18、基因表达的手段。然而抑癌基因发生异常甲基化是在然而抑癌基因发生异常甲基化是在肿瘤早期肿瘤早期就发就发生而且生而且一直一直进行的，导致恶性肿瘤表型的表达进行的，导致恶性肿瘤表型的表达 Kuester 报道在报道在88.19% ( 24 /27 ) 食管食管Barretts化生病例和化生病例和100% (13 /13)的上皮内瘤变病例中检测到的上皮内瘤变病例中检测到MGMT基因异常甲基基因异常甲基化，提示化，提示MGMT甲基化是食管腺癌早期频繁发生的事件。甲基化是食管腺癌早期频繁发生的事件。 Kelavkar 等发现等发现ALDX15基因在前列腺上皮内瘤变、前列腺癌基因在前列腺上皮内瘤变、前列腺癌

19、中以异常甲基化存在；而在正常前列腺细胞系中是以非甲基化中以异常甲基化存在；而在正常前列腺细胞系中是以非甲基化状态存在，说明其异常甲基化与前列腺癌的发生关系密切状态存在，说明其异常甲基化与前列腺癌的发生关系密切。1.KUESTER D, et al. Silencing of MGMT expression by promoter hypermethylation in the metap lasia -dysp lasia - carcinoma sequence of Barretts esophagus. CancerLett, 2009, 275 (1) : 117 - 126.2.KE

20、LAVKAR P, et al. DNA methylation paradigm shift: 15 - Lipoxygenase - 1 up regulation in p rostatic intraep ithelial neop lasia and p rostate cancer by atyp ical p romoter hypermethylation. Prostaglandins Other Lip id Mediat,2007, 82 (1 - 4) : 185 - 197. 优点：优点：DNA甲基化检测具有早期、无创、快捷、甲基化检测具有早期、无创、快捷、灵敏度高等

21、特点。（血液、粘膜上皮标本）灵敏度高等特点。（血液、粘膜上皮标本）缺点：特异性不足缺点：特异性不足肿瘤的预后分析肿瘤的预后分析甲基化改变与肿瘤分级、分期有明显的相关性。甲基化改变与肿瘤分级、分期有明显的相关性。l RASSF1A甲基化在低分化肺癌中比在高分化中甲基化在低分化肺癌中比在高分化中更常见更常见l 在结直肠癌在结直肠癌Dukes分期分期C和和D 的病例中的病例中CDKN2A, p16 的甲基化率比的甲基化率比A 和和B 期的增高期的增高DAS PM, DNA methylation and cancer. J ClinOncol, 2004, 22 (22) : 4 632 - 4 6

22、42DNA异常甲基化可促进肿瘤的侵袭和转移异常甲基化可促进肿瘤的侵袭和转移l 乳腺癌中乳腺癌中Cyclin D2, RAR - , Twist, RASSF1A和和H IN - 1的甲基化改变与淋巴结、骨的甲基化改变与淋巴结、骨、脑、肺转移有关、脑、肺转移有关MEHROTRA J, et al. Very high frequency of hypermethylated genes in breast cancermetastasis to the bone, brain, and lung . Clin Cancer Res, 2004, 10 ( 9 ) :3 104 - 3 109.甲

23、基化可作为肿瘤复发的独立预测因子。甲基化可作为肿瘤复发的独立预测因子。l 口腔鳞状细胞癌时存在口腔鳞状细胞癌时存在RECK基因甲基化的患基因甲基化的患者复发率明显增高者复发率明显增高甲基化影响生存期甲基化影响生存期l 膀胱癌中膀胱癌中APC, GSTP1和和TIG1基因发生异常甲基因发生异常甲基化时基化时,患者存活时间明显缩短患者存活时间明显缩短LONG N K, et al. Hypermethylation of the RECK gene p redicts poor p rognosis in oral squamous cell carcinomas J . Oral Oncol,

24、2008, 44 (11) : 1 052 - 1 058.ELL INGER J, et al. Hypermethylation of Cel - Free Serum DNA IndicatesWorse Outcome in Patients With Bladder Cancer. J Urol, 2008, 179 (1) : 346 - 352.肿瘤的去甲基化治疗肿瘤的去甲基化治疗 DNA甲基化程度依赖于甲基化程度依赖于DNMT活性。正常甲活性。正常甲基化模式的建立需要基化模式的建立需要DNMT1和和DNMT3的共同作的共同作用，用， DNMT1是是DNMT3启动启动CpG核苷酸

25、从头甲基核苷酸从头甲基化的保证，而化的保证，而DNMT3则使甲基化水平稳定在正常则使甲基化水平稳定在正常需要水平（去甲基化）需要水平（去甲基化） 抑制抑制DNMT活性药物是治疗肿瘤的新希望活性药物是治疗肿瘤的新希望 胞苷类似物胞苷类似物通过共价键与通过共价键与DNMT形成不可逆的形成不可逆的复合物从而竞争性抑制其活性复合物从而竞争性抑制其活性,使使DNA甲基化随细甲基化随细胞分裂进行性丢失胞分裂进行性丢失,部分地逆转肿瘤的恶性表型。部分地逆转肿瘤的恶性表型。n 5-Azacytidine 5-氮杂胞苷氮杂胞苷 n 5-aza-2-deoxycytidine 5-杂杂-2脱氧胞苷脱氧胞苷n Decitabine 4-氨基氨基-1-(2-脱氧脱氧-D-赤式赤式-顺顺-呋喃核糖呋喃核糖)-1，3，5-三嗪三嗪-2(氢氢)-1 地西他滨地西他滨 优点：新型抗肿瘤药物优点：新型抗肿瘤药物 缺点：缺点：n 无基因特异性无基因特异性,不能选择性地活化沉默的目的基因，从而不能选择性地活化沉默的目的基因，从而会引起整体的低甲基化会引起整体的低甲基化; n 药物的活化作用可逆，疗效依赖于药物的持续存在药物的活化作用可逆，疗效依赖于药物的持续存在;n 大剂量应用时会对正常细胞有毒副作用大剂量应用时会对正常细胞有毒副作用 是否会诱发第二肿瘤？是否会诱发第二肿瘤？LOGO