2022年聚合链变酶基础知识 .pdf

《2022年聚合链变酶基础知识 .pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2022年聚合链变酶基础知识 .pdf（15页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、名师精编优秀资料聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称 PCR ，是一种 分子生物学技术，用于放大特定的DNA 片段。可看作生物体外的特殊DNA 复制。目录概述PCR 原理PCR 反应体系与反应条件1.标准的 PCR 反应体系2、PCR 引物设计3、模板的制备4、PCR 反应条件的控制PCR 的循环参数1、预变性（ Initial denaturation）2、循环中的变性步骤3、引物退火（Primer annealing）4、引物延伸5、循环数6、最后延伸PCR 步骤1.DNA 变性2.退火3.延伸PCR 检测PCR 反应特点特异性强灵敏度高简便、快速对标

2、本的纯度要求低PCR 仪器PCR 常见问题PCR 实验室的建立方法1、实验室布局2、设置标准概述DNA聚合酶 （DNApolymerase I）最早于1955 年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli则是于 70 年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性，因此不符合使用高温变性的聚合酶链式精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 15 页名师精编优秀资料反应。现今所使用的酶(简称 Taq polymerase),则是聚合酶链式反应示意图1于 1

3、976 年从温泉中的细菌 （ Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80 年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因 修复复制，它是于1971 年由Dr. Kjell Kleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因 复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR 则于 1983 由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE 公司，因此 PE 公司在PCR 界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于 1985 年与 Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PC

4、R的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用， 成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993 年 诺贝尔 化学奖。PCR 原理DNA 的 半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA 在多种酶的作用下可以变性解旋 成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA 的变性和复性，加入设计引物 ，DNA 聚合酶、dNTP 就可以完成特定基因的体外复制。但是， DN

5、A 聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵， 制约了PCR 技术的应用和发展。发现耐热DNA 聚合酶 -Taq 酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90 以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR 技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR 技术得以大精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 15 页名师精编优秀资料taq 酶2量应用，并逐步应用于临床。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性 -

6、退火 - 延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA 的变性： 模板 DNA 经加热至93 左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA 与引物的退火(复性 )：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸： DNA 模板 -引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下， 以 dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性- 退火 - 延伸三过程就可获得更多的“ 半保留复制链” ，

7、而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2 4分钟， 2 3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR 反应体系与反应条件1.标准的 PCR 反应体系10 扩增缓冲液10 l 4种 dNTP混合物200 l 引物10 100 l 模板 DNA 0.1 2 g Taq DNA聚合酶2.5 l Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水100 l PCR 反应五要素：参加PCR 反应的物质主要有五种即：引物 (PCR 引物为DNA 片段，细胞内DNA 复制的引物为一段RNA 链 )、酶 、dNTP 、模板和缓冲液（其中需要Mg2+) 。引物有多种设计方法，与PCR 在实验中的目的决

8、定。但基本原精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 15 页名师精编优秀资料则相同PCRY 3PCR 所用的酶主要有两种来源：Taq 和 Pfu 。分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu 扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择模板即扩增用的DNA ，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：缓冲体系，一般使用HEPES或 MOPS缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；

9、二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；辅助成分，常见的有DMSO 、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA 接触缠绕结构2、PCR 引物设计PCR反应中有两条引物，即5 端引物和3 引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准）， 5 端引物与位于待扩增片段5 端上的一小段DNA 序列相同； 3 端引物与位于待扩增片段3 端的一小段DNA 序列互补。引物设计的基本原则引物长度：15-30bp ，常用为20bp左右。引物碱基：G+C含量以40-60% 为宜， G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或

10、嘧啶核苷酸的成串排列。引物内部不应出现互补序列。两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 端的互补重叠。引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70% ，引物 3 末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。引物 3 端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G 和 C。引物的 5 端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。v 引物设计软件Primer Premier5.0 （自动搜索）* vOligo6 （引物评价）vVector NTI Suit vDNAs

11、is vOmiga vDNAstar vPrimer3 （在线服务）3、模板的制备PCR 的模板可以是DNA ，也可以是RNA 。模板的取材主要依据PCR 的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 15 页名师精编优秀资料血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS 和蛋白酶K 处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA ，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙

12、醇沉淀后用作PCR 反应模板。4、PCR 反应条件的控制 PCR 反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子关于 PCR反应条件控制4镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20 200umol/L TaqDNA聚合酶2.5U （ 100ul ）引物浓度一般为0.1 0.5umol/L 反应温度和循环次数变性温度和时间95 ， 30s 退火温度和时间低于引物Tm值 5 左右，一般在45 55延伸温度和时间72 ， 1min/kb （ 10kb 内）Tm 值 =4(G+C) +2(A+T) 循环次数:一般为 25 30 次。循环数决定PCR 扩

13、增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30 个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“ 平台期 ” 。PCR 的循环参数1、预变性（ Initial denaturation）模板DNA 完全变性与PCR 酶的完全激活对PCR 能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq 酶激活时间为两分钟。2、循环中的变性步骤循环中一般95 ， 30 秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易

14、造成扩增失败。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 15 页名师精编优秀资料3、引物退火（Primer annealing）退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm 值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR 的特异性有较大影响。4、引物延伸引物延伸一般在72 进行（Taq酶最适温度） 。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含 Pfu 及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。5、循环数大多数PCR 含 25

15、-40 循环，过多易产生非特异扩增。6、最后延伸在最后一个循环后，反应在72 维持 5-15 分钟使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。（四）PCR 中的污染和假阳性PCR 中污染主要来自1 样品间交叉污染；2先前PCR 产物遗留（carry-over）PCR 步骤标准的PCR 过程分为三步：1.DNA 变性（ 90 -96 ） ：双链DNA 模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 2.退火（ 25 -65 ） ：系统温度降低，引物与DNA 模板结合，形成局部双链。3.延伸（ 70 -75 ） ：在 Taq 酶（在 72 左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5 端 3 端延

16、伸，合成与模板互补的DNA 链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA 含量即增加一倍。如图所示：现在有些PCR 因为扩增区很短，即使 Taq 酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60 -65 间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。PCR 检测PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB ）染色 凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。精选学习资料 - -

17、- - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 15 页名师精编优秀资料PCR 反应特点特异性强聚合酶链式反应PCR 反应的特异性决定因素为：引物与模板DNA 特异正确的结合；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性 )可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更

18、高。灵敏度高PCR 产物的生成量是以指数方式增加的，能将 皮克 (pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克( g=-6) 水平。能从100 万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达3个 RFU( 空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。简便、快速PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火 -延伸反应，一般在2 4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA 均可作为扩增模板。可直接用临

19、床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA 扩增检测。PCR 仪器pcr 仪器的发展pcr 温度循环至关重要，pcr 扩增仪各参数必须准确。自perk 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 15 页名师精编优秀资料pcr 仪5in elmercetus公司第一台pcr 扩增仪问世以来，现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售pcr 扩增仪。 在短短的几年间，扩增仪经过几代的发展，不断采用新技术，并且进一步朝方便、实用、高智能化和自动化的方向发展。为了便于了解和选购适宜的pcr 实验设备，现将部分国内外pcr 扩增

20、仪列表如下；这些仪器主要用变温铝块、变温水浴及变温气流的方式达到热循环的目的，各有其优缺点。国产1109 型dna扩增仪则是用恒温浴机械手移位式。更接近于手工操作。ptc-51a/b体积小，智能化与自动化程序高，可以兼做套式pcr ，方便实用。以上各种仪器一般都配有微电脑自动控制温度、时间及循环数，可以达到节省劳动力的目的。在采用这些仪器作pcr 试验之前，一般均应实测管内温度变化循环情况，以了解升、降温时管内因热传导造成的温度滞后情况和实际到达的最高、最低温度，用于修正设计的循环参数。温度滞后受到所用eppendorf管材料、壁厚及形状（与铝块孔匹配程度）的影响，这对变温铝块式仪器影响更大些

21、。对于配用制冷机式半导体元件致冷的仪器，在使用低于室温的温度来保冷pcr 反应后小管时，应注意冷凝水的问题，勿使流入仪器内浸湿半导体元件而损坏仪器。国内外生产的几种dna 扩增仪1109 型北京 新技 术 所 与 军 科 院 联 合机 械 臂变 温 水 浴电 子 调 温40 0.5ml 16400 元 /台90a/b型中科院遗传所机械臂变温水浴电热14000 元 /台ptc-51a/b型军事医学科学院变温气流电子调兼作套 式30 0.5ml 12000元 / 台dna thermal cycler perkin elmercetus(美 ) 变温铝块压缩机致冷48 0.5ml us $ 200

22、00.- thermocycler #60 #00 #180 b.braun biotech (德 ) 变 温 水 浴 98 四 档电 热 ， 自 来 水 冷 却60 1.5ml 100 1.5ml 180 1.5ml dm 30000.- automatic temperature cy-cler single block twin block ericomp inc.( 美 ) 变 温 铝 块 25 100 电 热 , 自 来 水 冷 却29 1.5ml 58 1.5ml us $4985.- us $7980.- grant autogen grant instrumant ltd(美

23、) 变温水浴0 99 电热， 自来水冷却或加冷循环器50 1.5ml or 50 1.5ml us $250. plus us $ 15.-for rack(x2) techne phc-1 phc-2 techne ltd.( 英 ) 变温铝块099 三档电热精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 15 页名师精编优秀资料500w水 冷 100w 54 0.5ml 54 0.5ml 24 1.5ml 3383. 3997. - biooven biothrm corp(美 ) 变温气流-150 115v 11a 200 s o

24、f 4 96plate us $ 2990. - trio-thermo-block tb-1 biomertra(德 ) 半导体变温220v 3 20 管分别控温dm12900. - micro cycler e eppendorf(美 ) 变温铝块220v/100v 3 29 管us $ 3500. - PCR 常见问题PCR 产物的电泳检测时间一般为48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及溴乙锭的使用，PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含

25、有杂蛋白质，模板中含有Taq 酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。电泳检测6阴性。需注意的是有时忘加Taq 酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为： 选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD 值，

26、更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变 质 降 解 失 效 。 引 物 设 计 不 合 理 ， 如 引 物 长 度 不 够 ， 引 物 之 间 形 成 二 聚 体 等 。Mg2+ 浓度： Mg2+ 离子浓度对PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR 扩增的精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - -

27、- - -第 9 页，共 15 页名师精编优秀资料特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR 扩增采用的体积为20ul 、 30ul 、 50ul 。或 100ul ，应用多大体积进行PCR 扩增， 是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低， 可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪

28、或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其 PCR 扩增是不会成功的。假阳性出现的PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的 PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序

29、列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR 方法来减轻或消除。出现非特异性扩增带PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循

30、环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93 变性，65 左右退火与延伸)。出现片状拖带或涂抹带PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+ 浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+ 浓度。增加模板量，减少循环次数。克隆 PCR 产物1)克

31、隆 PCR 产物的最优条件是什么？最佳插入片段：载体比需实验确定。1： 1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔 数比 1： 8或 8： 1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液，50ng 质粒 DNA,1Weiss单位的T4连接酶 ，插入片段共10ul 。室温保温1小时，或4过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4过夜。2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结

32、- - - - - - -第 10 页，共 15 页名师精编优秀资料引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？A）涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将1ug/ul质粒 1:100 稀释， 1ul 用于 100ul感受态细胞转化。用SOC 稀释到 1000ul后，用 100ul铺板。培养过夜，产生1000 个菌落。转化率为：产生菌落的总数/铺板DNA 的总量。铺板

33、DNA 的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用 SOC 稀释到 1000u后含10 ng DNA，用 1/10 铺板，共用1 ng DNA 。转化率为：1000 克隆 X10 （ 3次方）ng / 铺板 1 ng DNA ug=10（ 6次方） cfu/ ug 转化 pGEM-T应用 10（ 8次方） cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生20-40 蓝斑（用指定步骤10 （ 8次方） cfu/ug感受态细胞） ， 表明载体失去T。 可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA 连接酶（

34、M1801 ，M1804 ，M1794 ）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。D）用 pGEM-T或 pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（ 10 （ 8次方） cfu/ug ） ，按照指定的实验步骤，可得100 个菌落，其中60% 应为白斑，如产生20-40 蓝斑，没有菌落或少有菌落，连接有问题。4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4过夜。B）插入片段带有污染，使3-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如

35、降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或 pGEM-T Easy载体 3-T 缺失。C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV 过度照射，时有发生。UV 过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。D）带有修复功能的耐热 DNA 聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或 pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸 可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042 ） 。E） 高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率

36、地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如 SURE细胞PCR 反应体系与反应条件标准的PCR 反应体系：10 扩增缓冲液10ul 4种dNTP混合物各 200umol/L 引物各 10 100pmol模板 DNA 0.1 2ugTaq DNA聚合酶2.5uMg2+1 5mmol/L 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、 dNTP 、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA 互补的程度。 理论上， 只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR 就可将模

37、板DNA 在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：引物长度：15-30bp ，常用为 20bp左右。引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb 的片段。引物碱基：G+C 含量以 40-60% 为宜， G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页，共 15 页名师精编优秀资料多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物 3端的碱

38、基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1 1umol或10 100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度目前有两种 Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR 反应约需酶量2.5U( 指总反应体积为100u

39、l 时 )，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度dNTP 的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性， 使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH或1M Tris 。 HCL 的缓冲液将其PH 调节到 7.0 7.5 ，小量分装，-20 冰冻保存。多次冻融会使dNTP 降解。在PCR 反应中，dNTP应为 50 200umol/L，尤其是注意4种 dNTP 的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低 )，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR 产物的产量。d

40、NTP能与 Mg2+ 结合，使游离的Mg2+ 浓度降低。模板 (靶基因 )核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR 成败与否的关键环节之一，传统的DNA 纯化方法通常采用SDS 和蛋白酶K 来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于

41、PCR 扩增。 RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K 法，要防止RNase降解 RNA 。dntp 7精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页，共 15 页名师精编优秀资料Mg2+ 浓度Mg2+ 对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR 反应中，各种 dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+ 浓度为 1.5 2.0mmol/L为宜。Mg2+ 浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR 反应条件的选择PCR 反应条件为温度、时间和循环次数

42、。温度与时间的设置：基于PCR 原理三步骤而设置变性-退火 -延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA 在 90 95 变性，再迅速冷却至40 60 ，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70 75 ，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为 100 300bp时 )可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94 变性， 65左右退火与延伸(此温度Taq DNA 酶仍有较高的催化活性)。变性温度与时间：变性温度低， 解链不完全是导致PCR 失败的最主要原因。一般情况下， 93 94 min足以使模板DNA变性，若低于9

43、3 则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR 产物完全变性，就会导致PCR失败。退火 (复性 )温度与时间：退火温度是影响PCR 特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40 60 ，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约 50% 的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物 的 复 性 温 度 可 通 过 以 下 公 式 帮 助 选 择 合 适 的 温 度 ：T

44、m值 ( 解 链 温度)=4(G+C)+2(A+T) 复性温度=Tm 值 -(5 10 ) 在 Tm 值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR 反应的特异性。复性时间一般为30 60sec ，足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：70 80 150 核苷酸/S/ 酶分子70 60 核苷酸 /S/ 酶分子5524核苷酸 /S/ 酶分子高于 90 时，DNA 合成几乎不能进行。PCR 反应的延伸温度一般选择在70 75 之间，常用温度为72 ，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片

45、段的长度而定，一般1Kb 以内的DNA 片段，延伸时间1min 是足够的。3 4kb的靶序列需3 4min ；扩增 10Kb 需延伸至15min 。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。PCR 实验室的建立方法1、实验室布局PCR 实验室 按规定需要四间，分别是1 试剂储存和准备区、2 标本制备区、3扩增反应混合物配制和扩增区、4扩增产物分析区，布局见图1。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 13 页，共 15 页名师精编优秀资料pcr 实验室图1 四间 PCR 实验室区域设置如果使用全自动分析仪

46、，各区域可适当合并，我们建议将扩增区和产物分析区合并为扩增检测区即共三个间，布局见图2。图 2 三间 PCR 实验室区域设置按国家卫生部的要求，进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂储存和准备区?标本制备区扩增反应混合物配制和扩增区 ?扩增产物分析区，避免发生交叉污染。各工作区必须安装适当的排风设备确保空气流向按单一方向。工作区的墙面、地面、办公用品等必须选用耐消毒药品腐蚀的材料。工作区必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。2、设置标准各工作区域必须配备排风扇、空调、耐腐蚀地面和工作台面、更衣柜、鞋柜、专用办公用品、专用工作服和工作鞋、移动紫外灯等，保证安全卫生

47、需要。根据国家卫生部临床基因扩增检验实验室基本设置标准，各工作区域必备仪器设备如下 ：（ 一 ）试 剂 储 存 和 准 备 区1 2-8 和 -15 冰 箱2 混 匀 器3微量加样器（覆盖1-1000 l）4移动紫外灯（近工作台面）5消耗品 ： 一 次 性 手 套 、 一 次 性 吸 水 纸 、 耐 高 压 处 理 的 离 心 管 和 加 样 器 吸 头 （ 带 滤 心 ）6专用工作服和工作鞋7专用办公用品（二） 标本制备区12-8 冰箱、 -20 或 -80 冰箱2高速台式冷冻离心机3混允器4水浴箱或加热模块5微量加样器（覆盖1-1000 l）6可移动紫外灯（近工作台面）7超净工作台8消耗品

48、：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）9专用工作服和工作鞋10 专用办公用品如需处理大分子DNA ，应具有超声波水浴仪。（三）基因扩增区和产物分析区1全自动定量核酸扩增仪（含计算机、打印机）2微量加样器（覆盖1-1000 l）3 可移动紫外灯（近工作台面）4 消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）5 专用工作服和工作鞋6 专用办公用品各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。3实验室质量管理

49、PCR实验室内工作人员必须参加由国家卫生部或各省临床检验中心举办的临床基因扩增培训班，并持证上岗。PCR实验室通过验收，实验室至少必须应有两个以上持有“ 临床基因检测上岗证” 。 PCR 实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序（SOP ） 、建立系列质量管理文件等，确保实验室精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 14 页，共 15 页名师精编优秀资料日常运行符合国家卫生部的要求，确保检测结果准确、确保实验室卫生安全，确保实验室长期稳定运行。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 15 页，共 15 页