条斑紫菜丝状体对重金属胁迫的响应及抗性基因gst的克隆与表达-吕娓娓.docx

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1、辽宁师范大学 硕士学位论文 条斑紫菜丝状体对重金属胁迫的响应及抗性基因 GST 的克隆与表 达 姓名：吕娓娓 申请学位级别：硕士 专业：海洋生物学 指导教师：侯和胜 20090501 摘要 条斑紫菜是最具经济价值的栽培海藻之一，也是潮间带藻类的代表性模式物种，具 有很强的抗逆能力，是研究藻类抗逆分子机理的理想材料。 重金属污染会对藻类造成危害，在重金属胁迫下，藻体会通过多种生化途径来体现 自身对重金属的耐受能力。本研究以条斑紫菜丝状体为材料，分析了重金属离子 （ Cu2+ 和 Cd2+)胁迫对其叶绿素 a 含量、过氧化物酶 （ POD)活性以及可溶性蛋白含量的影响。 结果表明，条斑紫菜对 Cd

2、2+具有较高的耐受性。随着 Cu2+和 Cd2+浓度的增加，除了 Cu2+0. lmg/ L 浓度组外，其它各浓度组对条斑紫菜丝状体叶绿素 a 含量、 POD 活性和可 溶性蛋白含量的影响基本上表现为先上升后下降的时间效应关系，且同一重金属离子浓 度越大越早出现下降。 为探索条斑紫菜重金属抗性的分子机制，本实验进一步研究了抗性相关基因 谷 胱甘肽硫转移酶 （ GST)基因。 GST 是一种多功能解毒酶，能够催化谷 胱甘肽和含亲电 子基团的辅基形成谷胱甘肽衍生物，从而达到解毒的目的。本研究利用 RT-PCR 技术克 隆了条斑紫菜GST 基因， BLAST 结果表明该基因属于微粒体谷胱甘肽硫转移酶

3、 （ mGST) 家族，对其进行序列分析发现，该片段含有一个长度为 417bp 的完整开放阅读框，编码 138 个氨基酸，预测蛋白质分子量为 15. 35kDa,理论等电点为 9. 795。疏水性分析表明， GST 基因氨基酸疏水性很强，有 3 个明显疏水区域。信号肽与跨膜结构预测显示条斑紫 菜 GST 是一个具有信号肽的跨膜蛋白。与其他物种 GST 基因编码的氨基酸序列进行比对 分析显示，氨基酸序列相似性为53.63%，由系统发生进化树分析可知，条斑紫菜 GST 基因与莱茵衣藻 （ ED096603.1)和有毒赤潮藻种 （ ABI14355.1)同源关系较近。 运用基因重组技术，成功构建了条

4、斑紫菜 GST 基因原核表达质粒 PGEX-4T-1/GST， 并将重组质粒转化到在 DH5a 中。选用 Cu2+和 Cd2+两种重金属离子研究了转化菌的 重金属耐受性，通过测定转化菌与对照菌的生长曲线发现，表达条斑紫菜 GST 基因的转 化菌对以上两种重金属的耐受性都高于对照菌；而没有重金属 离子存在时，转化菌与对 照菌生长情况基本一致，说明条斑紫菜 GST 基因可能在重金属脱毒中发挥作用。 本研究结果为分析重金属对藻类的影响提供了参考，为更好地理解藻类 GST 及深入 研究其功能奠定了基础，对探索 GST 基因在藻类重金属抗性中的作用具有一定的意义。 关键词：条斑紫菜；重金属；谷胱甘肽硫转

5、移酶；表达分析 Abstract Porphyra yezoensis is one of the most economically important marine crops and is also considered as the representative model algae of the intertidal seaweeds. P. yezoensis has a strong capacity of stress resistance, which makes it an ideal species for the molecular mechanism researc

6、h of alage stress resistance. Heavy metal pollutants are harmful to marine crops. The ability of algae to tolerate heavy metal is determined by multiple biochemical pathways. In this study, the conchocelis of P. yezoensis is taken as experiment material to investigate the effects of heavy metal (Cu2

7、+ and Cd2+) on the contents of chlorophyll a, peroxidase (POD) activity and the soluble protein contents. The results showed that, P. yezoensis has a higher tolerance to Cd2+. With the increase of Cu2+and Cd2+ concentration, the content of chlorophyll a, POD activity and the soluble protein content

8、of the conchocelis appeared a tendency to increased first and then decreased except the groups exposed to lmg/L Cu2+, and the higher the concentrations of the same heavy metal, the earlier the decrease occured. A resistant gene - glutathione S-transferases (GST) gene was studied further to search th

9、e molecular mechanism of the P. yezoensis stress resistance. GSTs is a kind of multifunctional detoxification enzyme which catalyses the conjugation of GSH to a range of electrophilic substrates. The GST gene of P. yezoensis was cloned by RT-PCR technique, the results of BLAST suggested that: this g

10、ene belongs to the gene family of microsomal glutathione S-transferase III and multiple alignment indicated that the deduced amino acid sequence had 53. 63% identity with those of the other species. The cloned cDNA contains an 417bp open reading frame, which encodes for a polypeptide of 138 amino ac

11、id residues with a molecular mass of 15. 35kDa and a pi of 9. 795. The predictions of signal peptide sequence and transmembrane helices in proteins indicated that the GST of P. yezoensis is a transmembrane protein with a signal peptide. The phylogenetic tree showed that it is homology with the Chlam

12、ydomonas reinhardtii (ED096603.1) and Pfiesteria piscicida (ABI14355.1). Using gene recombination technology, the prokaryotic expression vector pGEX-4T-l/GST was successfully constructed and was transformed into E. coli DH5a. The differences between growth curves of the E. coli expressing GST and th

13、e control showed that the coli expressing GST protein had a higher heavy metal-ion (Cu2+and Cd2+) tolerance. However, the growth of E. coli expressing GST was in accord with that of the control group basically when the heavy metal-ion is absent. These results indicate that GST may be involved in hea

14、vy metal detoxification. The results provide some references for researching the effects of heavy metal to alage. The work will contribute to a better understanding of alage GST and help to further analyze the functions of the gene and will make a different for studying resistant mechanism of GST ge

15、ne in alage. Key words: Porphyra yezoensis Heavy metal; Glutathione S-transferases; Analysis of Gene Expression HI 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特 别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其 他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示 谢意。 学位论文作者签名 : 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，

16、及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名 : 指导教师签名 : 伟说 签名円期 : 年 t 月 W 曰 引言 条 斑 紫 菜 （ / ezoemis) 属 于 红 藻 门 （ Rhodophyta ) 、原红藻纲 (Protoflorideophyceae)、红毛菜目 （ Bangiales)、红毛菜科 （ Bangia

17、ceae)、紫 菜属（ Porphyra),为北太平洋西部特有种类，主要分布于我国黄渤海沿岸，以及曰本 列岛和朝鲜半岛沿岸，也是日本和韩国的主要栽培种类 1，由于其富含人体必需的多种 氨基酸、不饱和脂肪酸、多种维生素、胡萝卜素以及无机盐等，营养丰富，口味鲜美， 产品价值高，目前已成为最具经济价值的栽培海藻之一。条斑紫菜的生活史包括叶状配 子体和丝状孢子体两个异型世代 2。由于条斑紫菜具有易于培养，世代周期短等特点， 又是潮间带藻类的代表性模式物种，因此被认为是进行海洋植物特别是多细胞大型藻类 的遗传学、分子生物学及基因组学研究的理想模式生物 3。 重金属污染对条斑紫菜的影响已引起人们广泛关注，

18、目前有一些关于这方面的报 道，主要集中在对其叶状体生长生理影响的研究，冯琢等 4曾报道过 Cu2+胁迫条件下条 斑紫菜甘露醇和丙二醛含量的变化；许云华等 5研究了 Pb2+污染毒害后，条斑紫菜所受 到的影响；邵世光等 6 7研究了 Cd2+和 Hg2+对条斑紫菜的胁迫作用。而关于条斑紫菜重金 属抗性的分子机制研究较少。 目前，有关 GST 的研究多集中在哺乳动物和植物中。在动物中， GST 可以加强体内 有害物质的清除，保护生物体免受侵袭；植物中，主要在解除杀虫剂、除草剂毒性及耐 盐胁迫等方面有深入研究。 本论文通过研究条斑紫菜丝状体对重金属胁迫的生长生理反应，探讨重金属离子对 其生长和代谢的

19、影响，并克隆抗性相关基因 GST 基因，构建其原核表达载体进行表达分 析，为研究条斑紫菜丝状体重金属抗性的分子机理提供一定的依据。 第一章文献综述 1.1 重金属污染对藻类影响概述 重金属是指比重 （ specific gravity)大于 5 的金属（一般指密度大于 4. 5g*cnf3的金属 ） ，约有 45 种，包括铜、铅、锌、铁、钴、镍、猛、镉、汞、鹤、 钼、金、银等。其中锰、铜、锌等元素是生命活动所必需的，但大部分重金属如汞、 铅、镉等并非生命活动所必须，而且所有重金属超过一定浓度对生物体都是有毒 害作用的。构成环境污染的主要重金属有汞、镉、铅、铬等对生物毒性强的金属， 其次是具有一

20、定毒性的金属，如铜、锌、镍等 8。在环境科学中重金属指工业上常 用的、对动物和微生物有毒性的元素，砷、硒虽是非金属，但其毒性及某些性质与 重金属相似，故将砷、硒也列入重金属范畴。 重金属通常以天然浓度存在于自然界中，但随着工农业的发展，人类对重金 属的开采、冶炼和加工等活动日益增多，使不少重金属如铅、汞、镉等进入到大 气、水体及土壤中，对环境造成污染。重金属污染具有来源广、不能被降解、危害 时间持久、污染后不易被察觉以及 难以恢复等特点，而且可通过富集作用进入食物链， 由较低级营养水平向较高级营养水平传递和累积，直接或间接地危害到人类的健康和 生态系统的功能 9。 1.1.1 海洋重金属来源及

21、分布 海洋中重金属的来源可分为天然來源和人为来源两大类 1。天然来源如地壳岩石风 化、海底火山喷发、水动力作用、陆地径流、大气输送等方式均可将重金属及其化合物 注入海洋。后者包括油井开采，工厂、矿山、城镇等直接或通过河流向沿海排放含重金 属的污水、污物。 在自然水域中，重金属以各种形态分布在水相、底质及生物体中，表现出不同的生 态效 应和毒性特征。重金属污染物不易溶解，排入水体后，除部分为水生生物吸收外， 其余大部分迅速地由水相转入固相，即被水中各种有机和无机胶体及微粒物质所吸附， 结合到悬浮物和沉积物中，悬浮物是水体重金属污染物迁移的主要载体，沉积物则成为 污染物的主要储存场所，沉积物中的重

22、金属含量往往比水中高出许多倍，有时可达几个 数量级。重金属的浓度及分布受水文、 pH 值、温度等多方面因素的影响，例如当水体 pH 值条件发生变化时，沉积物将会释放吸附的重金属，对水体产生二次污染 “。冬季 水温低，重金属盐类在水中的溶解度小，水体底部 的沉积量大，水中浓度小；而夏季水 温升高，重金属盐类溶解度大，则水中浓度高。 1.1. 2 重金属对藻类生长生理的影响 近年来，由于工农业生产的快速发展，特别是沿海地区轻工业和重工业的快速发展， 使排入水域的重金属污染物质不断增加，污染海域面积越来越大，导致世界范围内海洋 环境的重金属污染日益严重。 藻类是水体中的初级生产者，它们利用光能摄取营

23、养盐，把无机碳转化为有机碳， 并释放氧气，从而直接或间接地为海洋中其它生物提供赖以生存的物质基础 12 13,在水 生态系统的食物链中起着重要的作用。因此，早在三十年代，对藻类与重金属关系的研 究就己经开始； 30 年代到 50 年代，主要集中在重金属对藻类营养方面的研究 14; 50 年代以后，重金属对藻类的毒性作用才开始引起人们的重视。 海水中极微量的重金属对藻类常常是无害的，有一些重金属，如 Cu、 Zn 等，还是 藻类生长发育必需的，但重金属含量过高就会造成污染，危害藻类 15。重金属离子对藻 类的影响主要表现对藻类生长发育的影响，包括细胞形态结构的改变、细胞分裂被阻止、 细胞内含物的

24、破坏、光合作用被抑制、细胞色素减少、细 胞渗透性增加、酶活性被抑制， 并能通过氧化还原反应产生自由基而导致细胞氧化损伤 16。 1.1. 2.1 重金属对藻类生长生理的影响 不同的重金属对藻类生长的影响各不相同。 Hg2+对海洋钙质角毛藻的毒性研究显示 , Hg2+处理 24h 后， lmg/dm3实验组的藻细胞全部破碎死亡；用 Zn2+处理海洋钙质角毛藻时， 0. 01 10mg/dm3 实验组在整个实验期间均未出现藻细胞急性死亡的现象 17。另据张首临 等18研究报道，用 Pb2+处理海洋三角褐指藻 96h 后生长半抑制浓度 EC50 为 0.468mg/L,而 Cu2+对海洋 三角褐指藻

25、生长的抑制作用更加明显， 96h 时其对藻类生长半抑制浓度 EC50 值为0.017mg/L。 对于大型藻类，侯和胜等 |9实验结果表明， Zn2+对裙带菜配子体的毒性 很小，1000nra l/L 时，裙带菜配子体仍有缓慢的生长；但 Cu2+对其抑制效应很强，在 1 umol/L时就显现出抑制效应， 10umol/L 时，配子体生长几乎停止，超过 10urool/L， 配子体逐渐变绿，细胞解体死亡。 重金属对藻类生长的影响随藻类种类和实验条件发生变化。 Hopkin 和 Kain 研究 Hg2+ 对海带不同生长阶段的影响，发现在配子体阶段最为敏感 2。郭文清等 21研究显示，江 篱受到 Cu

26、2t污染 7 天时， 20u g/L 浓度组仍显示促进作用，说明低浓度的 Cu2+能促进江篱的 生长；而在单细胞藻类 (扁藻、硅藻等 )的实验中， Cu2+浓度在 10ug/L 以上时已有明显的 生长抑制作用，说明大型藻类与单细胞藻类相比，具有更强的抗 Cu2+毒性的能力。据报 道 22,岐岖鱼腥藻对 Hg2+十分敏感，浓度低至 2ug/L 时，生长即受到显著抑制， 0.5ug/L 的水平即能使该藻的生长下降；而使普通小球藻生长受到抑制的 Hg2+浓度为 0.2mg/L。 另 有研究表明 23，在Cu2+浓度为 0.05rag/L 时，室内培养的栅藻品系，生长率只有对照的 75%; 而野生种类

27、，即使Cu2+浓度升至 0.4mg/L,仍然能正常生长。 重金属对藻类生长的影响还受到诸多环境因素及自身因素的影响，如重金属离子自 身价态、化合态和结合态不同，对藻类的毒性就不同 24。研究表明，当无机汞 (HgCl2) 浓度为 5u g/dm3时能抑制三角褐指藻细胞分裂，浓度达到 8011 g/dm3,细胞完全停止分裂 ; 而有机汞（甲基汞）浓度仅为 lug/dm3时就能抑制其细胞分裂，浓度为 25ug/dm3时，则 细胞分裂己完全抑制 6，由此可见，有机汞比无机汞对藻类的毒害作用更强。 1.1. 2. 2 重金属对藻类生理及生化功能的影响 重金属对藻类生理及生化功能的影响通常主要表现在：抑

28、制藻类的光合作用，减少 细胞色素，导致畸变以及改变天然环境中藻类的种类组成 22 25。此外，关于重金属对藻 类 DNA、RNA、 蛋白质合成及酶活性等方面的影响也有报道 16。 许多研究表明，重金属胁迫会抑制植物的光合作用，如经 Cu2+处理的谷皮菱形藻， 光合作用受到的抑制比生长更厉害；当 Cd2+处理浓度高于 0.05mg/L 时，小球藻的细胞 分裂中断，叶绿素合成停止。重金属对植物光合作用的影响是通过影响光合作用过程中 的电子传递和破坏叶绿体的完整性而实现的。研究表明， Hg2+能影响光合作用的电子传 递体系，使其光合色素遭到破坏，导致光合速率降低，叶绿素含量下降 22。过量的铅 26

29、 和铜可能引起类囊体结构和功能的破坏，导致叶绿体功能受损 27，从而使光合过程的 PSI、 PSII 之间的联系阻断，光合作用严重受阻。同样高浓度的 Zn2+会抑制藻类的生长 , 影响光合作用，降低叶绿素含量 16。 此外，重金属还影响藻类的 DNA、 RNA、 蛋白质合成及酶活性等方面。邵世光 6等的 研究结果显示，不同浓度 Hg2+处理会破坏条斑紫菜叶状体中的藻胆蛋白。林碧琴 28实验 结果表 明 ， 羊 角 月 芽 藻 在 非 致 死 浓 度 范 围 内 ， 随 着 Cd2+ 浓度增加，羊角月芽藻的 DNAase、 过氧化物酶活性都受到了一定的影响，同时藻体的细 胞分裂和细胞膜透性也受到

30、了一定程度的抑制。赵素达等 29对小球藻硝酸盐还原酶活性 的研究表明，Cd2+在低浓度 (0.05mg/L)短时间 ( 2d)对 NRase 活性有促进作用，而 Cd2+ 浓度大于 0.1 mg/L时对 NRase 活性有明显的抑制作用。许云华等 5用相对低浓度的 Pb2+处 理条斑紫菜叶状体，发现过氧化物酶和酸性磷酸酶等的活性有一定的促进作用。另据报 道， Hg2+易溶于脂质，通过生物膜进行转运和分布，降低了脂溶性，水溶性增强，使其 在组织中蓄积，改变了蛋白质尤其是酶的结构与功能，使细胞代谢紊乱，引起损害作用 3。有资料显示，重金属影响酶活性主要有 2 种可能 :一种是由于重 金属的存在而阻

31、碍 了作为酶辅助因子的金属离子的吸收和利用；另一种是由于重金属与酶蛋白的某些基团 结合形成螯合物，使酶的结构与构型发生变化而影响酶的活性 16。 1.1. 3 藻类对重金属胁迫的反应机制 同其它生物一样，藻类在长期的进化过程中，相应地产生了一系列抵抗重金属胁迫 的防御机制，以达到一定程度的解毒作用。 1.1. 3.1 藻类对重金属的吸附和累积 藻类吸收重金属的机理分为主动吸收和被动吸收两种方式。如 Pb 和 Sr 常存在于 富含多糖的细胞壁和胞间隙中，这主要是被动吸收的结果； Zn 和 Cd 等重金属通常存 在于细胞质中，这是反浓度梯度主动吸收的结果。大型水生植物能从海水中吸收较多的 金属离子

32、并积累起来，这一过程叫做富集。人们早在 50 年代就认识到藻类可以吸收富 集水体中的金属。通过海藻对重金属的吸附研究表明，不同藻类对重金属的吸附能力不 同，而且藻类对重金属的吸附具有选择性。在众多的海洋藻类中，一些大型海藻特别是 褐藻纲的一些种类的吸附能力比其它藻类高出很多，常常作为重金属污染的指示植物。 关于海藻对重金属的吸附机理的研究，目前国内开展得较少，仅限于少数藻类。赵 玲 M等曾研究过海洋赤潮生物 原甲藻吸附重金属的机理；潘进芬 M等对海洋微藻对重金 属的富集机理进行过研究。藻类对重金属的吸收过程包括胞外的快速吸附与胞内的缓慢 富集两个阶段33, 1叩犯73 比 011134等将它们

33、分别称为快相和慢相。在快相中，重金属在 细胞表面通过络合或离子交换被吸附到藻细胞表面，该过程迅速且可逆；而慢相是重金 属跨膜进入胞内富集或扩散的过程。经过对藻类细胞壁的研究发现，藻类细胞壁主要是 由多糖、蛋白质和脂类等物质构成的网状结构，多糖中所含有的一些功能基团如羟基、 羧基、氨基、疏基和磷酸根等 w 363,使得细胞 壁带有一定的负电荷 37，正是这些功能基 团对重金属有较强的络合能力，可以通过离子交换或其它机制与水中的重金属离子结 合，从而使重金属离子不能进入细胞内部而起到解毒作用，其中又以羧基的络合为主， 当把细胞中的羧基脂化后，藻类对 Cu2+和 Al3+的吸附能力显著下降 38。

34、实验表明，莱茵衣藻 （ fiW 胃 _mr/7/?3roW2 ） 的细胞壁缺失突变株较野生 型对重金属毒害更敏感 39。褐藻的细胞壁含有藻酸盐和岩藻聚糖，其中藻酸盐含羧基， 岩藻聚糖含硫酸基团，它们均可与重金属络合。 Kuyucak 和 1 即 14曾推测藻酸盐是 褐藻富集重金属的主要成分，这一推测在后来的实验中也得到了证实 41。许多蓝藻胞外 具有多糖组成的胶鞘、胶被或粘液 42，有些种类在培养过程中能分泌多聚糖，它们分泌 的多糖是一些复杂的阴离子络合物，其中约 80%含有 6-10 种多糖， 90%含有一种或更多 的糖醛酸 43，这些胞外多搪(exaccharide; EPs)能与重金属结合，可对蓝藻起一定保 护作用 42。这些研究结果表明，藻类细胞的某些胞外成分能与重金属结合，从而减少了 进入胞内的重金属离子数量，使胞内细胞 器免受重金属的毒害。 1.1. 3. 2 应激物质与抗氧化胁迫 与其它形式的氧化胁迫相似，重金属胁迫能导致大量活性氧自由基的产生，藻体自 身将产生一种由非酶抗氧化保护剂 (还原型谷胱甘肽 GSH、 抗坏血酸 ASA等 )和抗氧化保 护酶类(超氧化物歧化酶 S0D、 过氧化物酶 P0D、 过氧化氢酶 CAT 等 )组成的保护系统来 清除产生的自由基，以减轻危害 44。 研究发现，各种不同逆境胁迫，如干旱、盐碱、重金属等都有类似的反应机理，通