WB实验步骤详细总结.docx

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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-dateWB实验步骤详细总结WB实验步骤详细总结蛋白提取（所有操作在冰上进行）1. 裂解1) 配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF在-20保存，提前一天4解冻）取2ml裂解液，加20l PMSF混匀2) 称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600l上述1中液体（加入液体与组织比例为20：1），冰上静置10min2. 匀浆先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头

2、，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min3. 离心（在基础4楼416室）1) 自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（，两个标记，加少量超纯水，号是为了离心平衡，对称放置）2) 将离心机预冷至4为止，以120010r/min离心15min3) 用移液枪将上层清液取出放入号管中4. 变性（上样缓冲液：样品=4：1）将样品转移至23个0.5mlAP管中加上样缓冲液，100变性10min仪器屏幕：S500：10S5100000：10时间（时：分钟）温度（）5. 保存变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4保存，点

3、样是取出即可用WB实验步骤1. 清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。2. 配制分离胶1) 准备：1ml枪（蓝色枪头），200l枪（黄色枪头）10l（白色枪头）2) 10%分离胶的配置：（用50ml烧杯。1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板）5.91ml超纯水4.95ml丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效3.75mlPh8.8TrisHCL150l10%SDS150lAP（催化剂促凝作用）9lTEMED混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡）3. 灌胶沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml移液枪，不要将移液管

4、内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止4. 水封立即用1ml超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响电泳效果，等待20-30min5. 浓缩胶的配制（5%）4.13ml超纯水1ml丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效750lPh6.8 TrisHCL60l10%SDS60lAP（催化剂促凝作用）6lTEMED搅拌混匀立即灌胶至溢出，插入梳子（10孔或15孔）凝胶30min或20min6. 电泳（电泳液最多使用两次）1) 安装电泳装置低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔出防止拔歪）2) 点样（不易时间过长

5、，防止样品条带扩散）Mark4l（Protern ladder）推荐9，实际4已经足够 样品8l7-10l均可内参挑齐即可组数少时尽量靠中间点样，边缘易跑歪3) 连接电泳仪电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳先调电压至70mV，跑约20min。（Mark跑开，分出彩带即可）再调电压至120mV，跑约60min。（不能跑过下面的玻璃板）注：Mark的条带从红色条带往下依次为：7055403520，待测蛋白的分子量再哪一区域就在哪一段剪。用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。放入装有转移液的皿中浸泡7. 转膜（转移液可用3-4次）1)

6、 剪四层滤纸（大小与膜相，近可大不可小）浸入转移液皿中。然后再讲其剪成与胶一致大小（胶始终保持湿润）2) 剪PVDF膜（用上述滤纸，勿用手直接接触PVDF膜），然后用甲醇活化10s以上3) “夹三明治”再大塑料盆中加入少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、两层滤纸胶膜两层滤纸（胶的大分子量条带在上方，即在右上方）4) 安装转膜装置：黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。加入转膜液至满（否则仪器无法启动）5) 打开开关，调节电流至100mA，转膜2h（恒流）盆中加满冰转膜成功标志：胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色8. 封闭1) 配制5%脱脂奶粉：小烧杯中混匀加入皿中2.5g脱脂奶

7、粉50mlTBST2) 将膜取出放入上述加入了5%脱脂奶粉中的皿中常温慢摇60min（转移液回收其余清理掉，转移液可以重复利用2次）9. 一抗1) 用TBST配，每一格加5ml TBST，再分别加入抗体抗体的量：2l（Psmad2l）免抗1:10005l：5ml58（分子量）2l（Psmad2l）免抗1:50010l：5ml58Jnk免抗1:10005l：5ml双带内参（小鼠抗GAPH）单抗，中杉金桥1:50001l：5ml362) 膜上用圆珠笔标记，分别放入小格中（正面朝上）3) 4冰箱中，慢摇过夜（正面朝上，摇床416室）10. 洗脱用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。11.

8、 二抗1) 用3%的脱脂奶粉小烧杯中混匀加入皿中1.5g的脱脂奶粉50mlTBST2) 每格吸入5ml 3%脱脂奶粉，抗体与奶粉比例均为1:5000，即加入1l注意：吸入微升时，一定要检查是否吸到液体，一抗用鼠抗则二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用免抗3) 膜分别加入小格，慢摇1-2h（常温）12. 洗脱用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。13. 显影：U盘所需物品A液，B液（显影液。4保存）200l枪+枪头（黄）膜（置于皿中）1) 开机后自动预冷，温度降到1-20才可2) 显影液现配现用（A液：B液=1：1）3) 膜正面朝上放于暗箱，（即大分子量再左上角）用移液枪吧显影液均匀涂在膜上4) 先点击自动曝光，看下效果，显示不清晰再手动该曝光时间，内参一般显影15s（影像的条带粗细深浅一致则说明已调齐）内参好说明各步实验操作均无误，目的蛋白结果好坏就取决于抗体的专一性。5) 每张图保存多张不同清晰度的以备用，拷贝至U盘试剂配方：-