维生素A和维生素E的测定方法.pdf

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1、维生素 A 和维生素 E 的测定方法（HPLC）杨月欣教授等杨月欣教授等高效液相色谱法高效液相色谱法最小检出量分别为最小检出量分别为 VAVA：；：； -E -E：；：； -E -E：；：； -E -E：。：。1. 1.原理原理食物中的维生素食物中的维生素 A A 及维生素及维生素 E E 经皂化提取以后，将其不可皂化的部分提取到有机溶剂中。用经皂化提取以后，将其不可皂化的部分提取到有机溶剂中。用 HPLCHPLC 法法测定维生素测定维生素 A A 及维生素及维生素 E E 的含量。的含量。2. 2. 适用范围适用范围GB12388-90GB12388-90 本法适用于各种食物和饲料的测定本法

2、适用于各种食物和饲料的测定3. 3. 仪器仪器（1 1） 高压液相色谱仪（带紫外检测器）高压液相色谱仪（带紫外检测器）（2 2） 六孔恒温水浴锅六孔恒温水浴锅（3 3） 旋转蒸发器旋转蒸发器（4 4） 高纯氮气高纯氮气（5 5） 高速离心机高速离心机4. 4. 试剂试剂本实验所用试剂皆为分析纯，所用水皆为蒸馏水本实验所用试剂皆为分析纯，所用水皆为蒸馏水无水乙醇：重蒸，不含有醛类物质无水乙醇：重蒸，不含有醛类物质检查方法：取检查方法：取 2ml2ml 银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入 10%10%氢氧化钠溶液，加热，放置氢氧化钠溶液，加热，

3、放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。脱醛方法：取脱醛方法：取 2g2g 硝酸银溶于少量水中。取硝酸银溶于少量水中。取 4g4g 氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入 1L1L 乙醇中，振摇乙醇中，振摇后，放置暗处两天（不时摇动，促进反应），经过滤，置蒸馏瓶蒸馏，弃去初蒸出的后，放置暗处两天（不时摇动，促进反应），经过滤，置蒸馏瓶蒸馏，弃去初蒸出的 50ml50ml。当乙醇中：。当乙醇中：10%10%抗坏血酸溶液（抗坏血酸溶液（VcVc） W/VW/V 临用前配制临用前配制50%50%氢氧化钾溶液（氢氧化钾溶液（KOHKOH

4、） W/VW/V无水乙醚无水乙醚 重蒸，不含过氧化物重蒸，不含过氧化物4.4.14.4.1 过氧化物检查方法：用过氧化物检查方法：用 5ml5ml 乙醚加乙醚加 1ml10%1ml10%碘化钾溶液，振摇碘化钾溶液，振摇 1min1min，如有过氧化物则放出游离碘，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加水层呈黄色或加 4 4 滴滴% %淀粉液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。淀粉液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。去除过氧化物的方法：重蒸乙醚时，瓶中放入铁丝或铁末少许。弃去去除过氧化物的方法：重蒸乙醚时，瓶中放入铁丝或铁末少许。弃去 10%10%初馏液和初馏液和 10%10%残馏液。残馏液。p

5、HpH 1-141-14 试纸试纸无水硫酸钠无水硫酸钠 Na2SO4Na2SO4甲醇甲醇 色谱纯或分析纯重蒸后使用色谱纯或分析纯重蒸后使用重蒸水重蒸水 蒸馏水中加入少量高锰酸钾重蒸后使用蒸馏水中加入少量高锰酸钾重蒸后使用苯并苯并e e芘标准液芘标准液 称取苯并称取苯并e e芘（纯度芘（纯度 98%98%），用脱醛乙醇配制成），用脱醛乙醇配制成 1ml1ml 相当于相当于 5g5g 苯并苯并e e芘的芘的内标溶液。内标溶液。维生素维生素 A A 标准液标准液 视黄醇（纯度视黄醇（纯度 85%85% SigmaSigma 公司）用脱醛乙醇溶解维生素公司）用脱醛乙醇溶解维生素 A A 标准品，使其浓

6、度大约为标准品，使其浓度大约为 1m1ml l 相当于相当于 1mg1mg 视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。维生素视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。维生素 E E 标准液标准液 - -生育酚（纯度生育酚（纯度 95%95%SigmaSigma 公司），公司）， - -生育酚（纯度生育酚（纯度 95%95% SigmaSigma 公司），公司）， - -生育酚（纯度生育酚（纯度 95%95% SigmaSigma 公司）。用脱醛乙醇分别公司）。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素溶解以上三种维生素 E E 标准品，使其浓度大约为标准品，使其浓度大约为 1ml1ml 相当于相

7、当于 1mg1mg。临用前用紫外分光光度法分别标定此三。临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素种维生素 E E 的准确浓度。的准确浓度。5. 5. 操作步骤操作步骤本实验需避光操作本实验需避光操作(1)(1) 样品皂化样品皂化 称取样品于三角瓶中，加称取样品于三角瓶中，加 30ml30ml 无水乙醇，振摇三角瓶，使样品分散均匀。加入无水乙醇，振摇三角瓶，使样品分散均匀。加入 5ml5ml 10%10%抗抗坏血酸和苯并坏血酸和苯并e e芘标准液芘标准液 2ml2ml，混匀。最后加入，混匀。最后加入 10ml10ml 氢氧化钾边加边振摇。于沸水浴上回流氢氧化钾边加边振摇。于沸水浴上回流 30m

8、in30min 使使样品皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。样品皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。(2)(2) 样品萃取样品萃取 将皂化后的样品移入分液漏斗中，用将皂化后的样品移入分液漏斗中，用 50ml50ml 水分水分 2 2 次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用 10100ml0ml 无水乙醚分两次洗皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。轻轻振摇分液漏斗无水乙醚分两次洗皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。轻轻振摇分液漏斗 2min2min，静置分层，弃去，静置分层，弃去水层。然后每次用约水层。然后每次用约 100ml100ml 水将乙醚液洗至中性，约水将乙

9、醚液洗至中性，约 4-54-5 次。次。(3)(3) 浓缩浓缩 将乙醚提取液经无水硫酸钠将乙醚提取液经无水硫酸钠（约（约 5g5g）滤入滤入 150ml150ml 旋转蒸发瓶内，旋转蒸发瓶内，用约用约 15ml15ml 乙醚冲洗分液漏斗及乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠无水硫酸钠 2 2 次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发器上，于次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发器上，于5555水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中乙醚剩下约乙醚剩下约 2ml2ml 时，取下蒸发瓶，立即用氮气将乙醚吹干。加入时，取下蒸发瓶，立即用氮气将乙醚吹干。加入 2ml2ml 乙醇溶液，充分混合

10、，溶解提取物。乙醇溶液，充分混合，溶解提取物。将乙醇液移入塑料离心管中，于离心机上以将乙醇液移入塑料离心管中，于离心机上以 30003000 转转/min/min 离心离心 5 5 分钟。上清液供色谱分析。分钟。上清液供色谱分析。(4)(4) 标准曲线的制备标准曲线的制备 将维生素将维生素 A A 和维生素和维生素 E E 标准品配置成标准溶液（约标准品配置成标准溶液（约 1mg/ml1mg/ml），制备标准曲线前用紫），制备标准曲线前用紫外分光光度法标定其准确浓度。标准浓度的标定方法外分光光度法标定其准确浓度。标准浓度的标定方法 取维生素取维生素 A A 和维生素和维生素 E E 标准液若干

11、微升，分别稀释标准液若干微升，分别稀释至乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用比吸光系数计算该维生素的浓度。测定条件如下至乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用比吸光系数计算该维生素的浓度。测定条件如下标标 准准比吸光系数比吸光系数 E1%cmE1%cm波波 长长 ，nmnm视视 黄黄 醇醇18351835325325生育酚生育酚7171294294生育酚生育酚298298生育酚生育酚298298浓度计算：浓度计算：X1=X1= A/E1/100S10-3A/E1/100S10-3式中式中 X1X1：某维生素浓度，：某维生素浓度，mg/mlmg/ml；A A：维生素的平均紫

12、外吸光值；：维生素的平均紫外吸光值；S S：加入标准的量，：加入标准的量，LL；E E：某种维生素：某种维生素 1%1%比吸光系数；比吸光系数；S10S10-3-3：标准液稀释倍数。：标准液稀释倍数。本法采用内标两点法进行定量。把一定量的维生素本法采用内标两点法进行定量。把一定量的维生素 A A、维生素、维生素 E E 及内标苯并及内标苯并e e芘液混合均匀，选择合适芘液混合均匀，选择合适的灵敏度，使上述物质的各峰高约为满量程的的灵敏度，使上述物质的各峰高约为满量程的 70%70%，作为高浓度点，高浓度的，作为高浓度点，高浓度的 1/21/2 为低浓度点（内标苯并为低浓度点（内标苯并e e芘的

13、浓度值不变），用此二种浓度的混合标准进行色谱分析。根据微处理机装置，按说明用二点内芘的浓度值不变），用此二种浓度的混合标准进行色谱分析。根据微处理机装置，按说明用二点内标法进行定量。标法进行定量。液相色谱分析液相色谱分析仪器所需条件仪器所需条件预柱：预柱：ODSODS 10m10m，4mm4mm。分析柱：分析柱：ODSODS 5m5m，25cm25cm。流动相：甲醇：水流动相：甲醇：水=98=98：2 2。混匀，临用前脱气。混匀，临用前脱气。紫外检测器波长：紫外检测器波长：300nm300nm。量程。量程。进样量：进样量：20L20L 进样定量环。进样定量环。流速：。流速：。6. 6. 计算计

14、算X=C/mV100/1000X=C/mV100/1000X X：某种维生素的含量，：某种维生素的含量，mg/100gmg/100g；C C：由标准曲线上查到某种维生素含量，：由标准曲线上查到某种维生素含量，g/mLg/mL；V V：样品浓缩定容体积，：样品浓缩定容体积，mLmL；mm：样品质量，：样品质量，g g；用微处理机二点内标法进行计算时，按计算公式计算或由微机直用微处理机二点内标法进行计算时，按计算公式计算或由微机直接给出结果。接给出结果。7. 7. 注意事项注意事项（1 1） 维生素维生素 A A 极易被破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器。极易被破坏，实验操作应在微

15、弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器。（2 2） 在皂化过程中，应每在皂化过程中，应每 5 5 分钟摇一下皂化瓶，使样品皂化完全。分钟摇一下皂化瓶，使样品皂化完全。（3 3） 提取过程中，振摇不应太剧烈，避免溶液乳化而不易分层。提取过程中，振摇不应太剧烈，避免溶液乳化而不易分层。（4 4） 洗涤时，最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加。洗涤时，最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加。（5 5） 无水硫酸钠如有结块，应烘干后使用。无水硫酸钠如有结块，应烘干后使用。（6 6） 在旋转蒸发时，乙醚溶液不应蒸干，以免被测样品含量有损失。在旋转蒸发时，乙醚溶液不应蒸干，以免被测样品含量有损失。（7 7） 用高纯氮吹干时，氮气不能开的太大，避免样品吹出瓶外结果偏低。用高纯氮吹干时，氮气不能开的太大，避免样品吹出瓶外结果偏低。