第4章-核酸分子的酶切、连接和修饰ppt课件.ppt

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1、第四章第四章 核酸分子核酸分子的酶切、连接和的酶切、连接和修饰修饰第一节 DNA分子的酶切一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）1、限制性核酸内切酶的发现 限制修饰系统限制修饰系统（Restriction modification system）是存在于细菌等一些原核生物体内，可保护自身免于外来DNA（如噬菌体）侵入的一个系统，包括限制和修饰两个方面的作用。 v 限制(Restriction)是指细菌的限制性核酸酶对入侵DNA的降解作用，这就限制了外源DNA侵入所造成的危害。v 修饰(Modification)是指细菌的修饰酶对于自身DNA

2、碱基分子的甲基化等化学修饰作用，经修饰酶修饰后的DNA分子可免遭细菌限制酶的降解作用。 2、限制性内切酶的类型和命名 型和型酶在基因工程研究中的应用价值不大，通常所说的限制性内切酶都是型酶。表4-1 三种限制性内切酶的特点比较 特征I型II型III 型限制修饰活性单一多功能酶限制和修饰活性分开双功能酶蛋白质结构三种不同亚基单一成分两种不同亚基限制作用的辅因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸Mg2+ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸切割位点距特异性位点1000bp外的位置随机切割特异性位点或附近距特异性位点3-端2426bp位置甲基化作用位点特异性位点特异性位点特异性位点识别未甲基化位点进行核

3、酸内切酶切割能能能序列特异性切割否是是在基因工程中应用广泛否是否v使用限制性内切酶寄主菌的种属名称，来命名限制性内切酶 限制酶 来源 剪切方式 EcoR I Escherichia coli RY 13 GAATTC Hind Haemophilus influenzae Rd AAGCTT 3、型限制性内切酶的作用方式（1）识别并切割特异核苷酸序列（2）识别序列都是回文序列 （3）切割后形成各种粘性末端或平整末端G G A T C CC C T A G G5353BamH的识别序列A A G C T TT T C G A A5353Hind的识别序列图4-1 几种型限制性内切酶的识别和切割序

4、列图4-2杂交位点的形成及其切割二、限制性内切酶切割DNA的方法（一）单酶切割DNA样品图4-3 单酶切割的DNA通过互补末端载体DNA的连接G G A T C CC C T A G GBamH的识别序列及切割部位G G A T C CC C T A G GBamH含目的基因的DNA片段BamHG C C T A G535353353535G G A T C CC C T A G G G A T C C G目的基因片段混合、退火G C C T A G G A T C C G G A T C C GG C C T A G质粒载体含目的基因的重组质粒图8-4 同一种限制酶切割DNA产生的粘性末端的

5、连接G C C T A G G A T C C GDNA连接酶图4-4 质粒的图谱及其酶切检测结果（二）双酶或多酶切割DNA样品图4-5 双酶切割的DNA通过互补末端载体DNA的连接G G A T C CC C T A G GBamHBamHBamHG C C T A G53535335355G A A T T CC T T A A G A A T T C G目的基因片段混合、退火G C T T A A G A T C C G A A T T C GG C C T A G重组质粒DNA连接酶HindHind3 G A T C C G G C T T A A A A T T C G G C C

6、T A G G A T C C G G C T T A AHind AATYC G G CCTAG53载体（三）DNA样品的部分酶切图4-6 DNA样品的部分消化（A）基因组DNA电泳；（B）基因组DNA部分酶切结果三、影响限制性内切酶活性的因素1. DNA样品纯度2. DNA甲基化程度3. 缓冲液条件4. 酶切反应温度5. DNA分子结构四、D酶切的应用图4-7重组质粒构建实例第二节第二节 DNA分子的连接分子的连接一、连接酶 连接酶连接酶(Ligase）是一类能将两个核酸片段连接起来的酶。目前已研究发现多种不同来源或作用于不同底物的连接酶类，这里主要介绍：E.coli DNA连接酶、T4

7、DNA连接酶、热稳定DNA连接酶和T4 RNA 连接酶。二、粘性末端DNA片段的连接（一）相同粘性末端的连接（二）不同粘性末端的连接三、平末端DNA片段的连接（一）平末端DNA片段的直接连接（二）同聚物加尾法（三）接头连接四、影响连接反应的因素图4-8 同聚物加尾连接示意图图8-6 同聚物加尾连接示意图GGGGGGGGGGGG53CCCCCCCCCCCC3553355555CCCCCCCCCCCCGGGGGGGGGGGGA片段B片段图4-9 利用接头分子的连接示意图图8-7 连接物分子连接平末端的DNA片段示意图5335G G A T C CC C T A G G3553BamH接头多核苷酸激

8、酶连接酶53G G A T C CC C T A G G35G G A T C CC C T A G GBamH切割G C C T A G35 G A T C C G35BamH切割的质粒载体3535G C C T A G G A T C C GG C C T A G G A T C C G G A T C C GG C C T A G重组质粒目的基因第三节 DNA分子的修饰一、DNA修饰酶1、末端转移酶2、T4多聚核苷酸激酶3、碱性磷酸酶二、T4多聚核苷酸激酶对DNA的修饰作用1、5-OH末端磷酸化2、核酸分子5-端的标记三、碱性磷酸酶对DNA的修饰作用思考题 1、什么是DNA限制性内切酶；基因工程中常用的是哪种类型，如何命名？2、型限制性内切酶有哪三个主要的作用特性？3、请以表格比较并说明常用DNA聚合酶及其性质。4、利用逆转录酶和mRNA模板合成cDNA的主要步骤是什么？5、请总结出DNA单酶切分析的一般实验方法。6、为什么通过碱性磷酸酶处理可以防止质粒载体DNA自连的作用？