gbt 27529-2011 马接触传染性子宫炎诊断技术.pdf

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1、I C S1 1 2 2 0 B4 1中华人民共和一、7 - 。H园目 国国家标准G B T2 7 5 2 9 - - 2 01 1马接触传染性子宫炎诊断技术D i a g n o s t i ct e c h n i q u e sf o rc o n t a g i o u se q u i n em e t r i t i s2 0 1 1 - 1 1 - 2 1 发布2 0 1 2 - 0 3 - 0 1 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局学者中国国家标准化管理委员会及1 1 1刖置G B T2 7 5 2 9 - - 2 01 1本标准的附录A 、附录B 、附录C 为规范性附

2、录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会( s A C T C1 8 1 ) 归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局。本标准主要起草人：朱来华、梁成珠、郑小龙、肖西志、邓明俊、辛学谦、谭乐义、方绍庆、王宫璞、岳志芹、季新成、王群、孙涛、赵玉然。1 范围马接触传染性子宫炎诊断技术G B T2 7 5 2 9 - - 2 0 ”本标准规定了马接触传染性子宫炎( c o n t a g i o u se q u i n em e t r i t i s ，C E M ) 的诊断技术。本标准适用于马接触传染性子宫炎

3、的诊断和检疫。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B T4 7 8 9 2 82 0 0 3 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂G B T6 6 8 Z 分析实验室用水规格和试验方法3 临床检查3 1I 临床特征公马感染马生殖道泰勒氏杆菌后不表现任何临床症状，当母马感染后表现阴道炎、子宫颈炎，初期外阴部出现大量渗出物或灰色炎症分泌物，后期渗出物或分泌

4、物逐渐变成黏稠的脓液，其中含有大量的多核细胞、黏膜脱落细胞和崩解的细胞碎片。3 2 判定根据3 1 临床检查可作出初步判定。为了确诊需进行实验室检查，细菌学检查是确诊本病最可靠的方法。4 病原分离与初步鉴定4 1 材料准备4 1 1 器材4 1 1 1 微量移液器。4 1 1 2 二氧化碳培养箱。4 1 1 3 普通冰箱及低温冰箱( 4 、一2 0 ) 。4 1 1 4 离心管。4 1 1 5 普通生物显微镜。4 1 1 6 暗视野或相差显微镜。4 1 1 7 载玻片。4 1 1 8 接种环。4 1 1 9 擦镜纸。4 1 2 实验室用水实验室用水是指实验室用于溶解、稀释或配制溶液的水，可用多

5、次蒸馏或离子交换等制备，符合G B T6 6 8 2 二级水要求。4 1 3 培养基4 1 3 1 运输培养基：见附录A 。4 1 3 2 选择性琼脂培养基：见附录A 。】G B T2 7 5 2 9 2 0114 1 3 3 含硫酸链霉素( 2 0 0 z g m L ) 选择性琼脂培养基：见附录A 。4 1 3 4 卵黄氯化钠琼脂培养基：见附录A 。4 1 4 试剂4 1 4 1 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯。4 1 4 2 革兰氏染色液：按G B T4 7 8 9 2 8 2 0 0 3 中2 2 规定配制。4 1 4 3 过氧化物酶试验试剂：按G B T4 7 8 9 2

6、82 0 0 3 中3 1 8 规定，临用时配制。4 1 4 4 氧化酶试验试剂：按G B T4 7 8 9 2 8 2 0 0 3 中3 2 0 规定，临用时配制，于冰箱内避光保存。4 2 样品采集和运送在采集泌尿生殖道拭子前应至少停用抗生素药物7d ，也不得使用消毒药物冲洗泌尿生殖道。母马或公马保定后，用高压消毒的棉拭子刮擦泌尿生殖道黏膜( 尿道隐窝、尿道窦、尿道或阴茎鞘)以刮取含有细胞、分泌物的样品。从阴蒂窝和阴蒂窦刮取拭子进行分离培养即可证明马生殖道泰勒氏杆菌的存在，但要获得纯净的培养物，应从子宫颈或子宫内膜中采集样品来分离。公马：每匹公马分别从阴茎基部包皮处( 包皮垢) 、尿道隐窝尿

7、道窦、尿道日采集3 份拭子。未怀孕母马：每匹母马分别从子宫颈、阴蒂隐窝、阴蒂窦采集3 份拭子。怀孕母马：每匹母马分别从阴蒂隐窝、阴蒂窦采集2 份拭子。棉拭子采集后，迅速插入装有1m L 2m L 含活性炭的运输培养基离心管内，以吸附掉细菌代澍产生的抑制因子。在低温条件( 2 8 ) 下，样品尽快( 2 4h 4 8h 内) 送往实验室。4 3 病原分离培养样品到达实验室后，立即用棉拭子蘸取样品液直接涂布于选择性琼脂培养基和含硫酸链霉素( 2 0 0F z g m L ) 选择性琼脂培养基平板上，每个拭子均接种2 个平板。平板在5 1 0 的二氧化碳培养箱内3 5 3 7 培养，最初2 4h 应

8、检查是否有杂菌污染。4 8h 后应每天观察，培养7d 1 4d 。4 4 病原初步鉴定4 4 1 菌落鉴定4 8h 后应每天观察琼脂培养基。观察培养基上有无疑似特征性菌落。马生殖道泰勒氏杆菌的菌落很小，直径2m m 3m m ，边缘完整光滑，有光泽，呈浅灰黄色。如无特征性菌落，可弃之。4 4 2 革兰氏染色鉴定按G B T4 7 8 9 2 8 2 0 0 3 中2 2 规定操作。4 4 3 湿片动力试验取干净载玻片一块，用微量移液器加一滴生理盐水，无菌挑取少量菌落，涂抹分散均匀。使用暗视野或相差显微镜检查，先用低倍物镜，再用高倍物镜，观察细菌形态特征与动力特征。4 4 4 生化鉴定4 4 4

9、 1 氧化酶试验取典型菌落，按G B T4 7 8 9 2 82 0 0 3 中3 1 8 规定操作。4 4 4 2 过氧化氢酶试验取典型菌落，按G B T4 7 8 9 2 8 2 0 0 3 中3 2 0 规定操作。4 4 4 3 磷脂酶试验用接种环挑取固体培养基上典型菌落，点种于卵黄氯化钠琼脂平板( 每张平板至少可接种1 0 点) ，在5 1 0 的二氧化碳培养箱内3 7 厌氧培养2 4h ，观察接种点的变化。磷脂酶试验阳性者产生卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部及周围形成乳白色的混浊带。2G B T2 7 5 2 9 2 01 14 5 结果判定4 5 1根据细菌的菌落特征、革

10、兰氏染色特征、湿片动力试验、过氧化氢酶试验、磷脂酶试验和氧化酶试验的结果可进行初步鉴定。4 5 2 马生殖道泰勒氏杆菌生长缓慢，菌落很小，直经2m m 3m m ，边缘完整光滑，有光泽，呈浅灰黄色。4 ，5 3 马生殖道泰勒氏杆菌革兰氏染色阴性，杆状或球杆状，有时呈多形态( 长达6u m ) ，并可表现两极着色。4 5 4 马生殖道泰勒氏杆菌无运动性。4 5 5 马生殖道泰勒氏杆菌能产生过氧化氢酶和磷酸脂酶，氧化酶强阳性，无其他生化反应。4 5 6 凡符合马生殖道泰勒氏杆菌一般特征和生化特性的细菌，可初步判定为马生殖道泰勒氏杆菌，如初步判定为马生殖道泰勒氏杆菌，则需要进一步应用马生殖道泰勒氏杆

11、菌特异抗血清进行血清学鉴定。5 病原血清学鉴定技术5 、玻片乳瞳凝集试验5 1 1 试验材料5 1 1 1马生殖道泰勒氏杆菌的标准抗原。5 1 I 2 马生殖道泰勒氏杆菌阳性血清致敏乳胶。5 1 1 3 马生殖道泰勒氏杆菌阴性血清致敏乳胶。5 1 1 4 载玻片。5 1 1 5 玻璃铅笔。5 1 1 6 接种环。5 1 1 7 牙签或火柴杆。5 1 2 操作程序使用前，马生殖道泰勒氏杆菌的标准抗原应充分振荡，所有试剂在室温平衡使其温度达到2 0 左右。取洁净载玻片一块，用玻璃铅笔划成小格。滴加1 滴马生殖道泰勒氏杆菌阳性血清致敏乳胶( 约2 5p L ) ，再用接种环在琼脂培养基上钩取待鉴定细

12、菌培养物适量，或滴加1 滴液体培养物( 约2 5p L ) 。同时于载玻片另一端滴加1 滴马生殖道泰勒氏杆菌阴性血清致敏乳胶，同样钩取该细菌培养物混匀于其中。以牙签或火柴杆混匀，在3m i n 5m i n 内判定结果。5 1 3 结果判定“+ + + + ”：1 0 0 凝集，全部乳胶凝集，成絮状团块，出现大的凝集片或粒状物，液体清亮。“+ + + ”：7 5 凝集，大部分乳胶凝集成较小的颗粒，有可见凝集块，液体清亮，几乎完全透明。“+ + ”：5 0 凝集，半量乳胶凝集成细小颗粒，出现比较明显的颗粒状凝集颗粒或小凝块，液体不甚透明。“+ ”：2 5 凝集，仅可勉强看到粒状物，或较少量的乳胶

13、凝集成可见的细颗粒，液体混浊。“一”：无凝集现象，全部乳胶液体仍为均匀混浊，无颗粒。以“+ + ”或以上的反应强度作为该反应滴度的终点，判为凝集试验阳性。5 1 4 结果说明玻片乳胶凝集试验因可能出现非特异性凝集反应，仅用做马生殖道泰勒氏杆菌的初步血清学鉴定。3G B T2 7 5 2 9 - - 2 01 15 2 间接荧光抗体法5 2 1 试验材料5 2 1 1 马生殖道泰勒氏杆菌的标准抗原。5 2 1 2 马生殖道泰勒氏杆菌荧光标记的标准阳性血清。5 2 1 3 马生殖道泰勒氏杆菌标准阴性血清。5 2 1 4 异硫氰酸荧光素( F I T C ) 标记的抗抗体诊断液。5 2 1 50 1

14、m o l Lp H 8 0 磷酸盐缓冲液( P B S ) ( 见附录B ) 。5 2 1 6 甘油缓冲液( 见附录B ) 。5 2 1 7 丙酮：乙醇( 体积比1 ：1 ，一2 0 预冷) 。5 2 1 8 恒温培养箱。5 2 1 9 荧光显微镜。5 2 1 1 0 载玻片。5 2 1 1 1 盖玻片。5 2 1 1 2 玻璃铅笔。5 2 1 1 3 接种环。5 2 1 1 4 镊子。5 2 1 1 5 染色缸。5 2 2 操作程序取一干净载玻片，用玻璃铅笔画定样品区域( 直径0 5c m ) ，用接种环在琼脂培养基上钩取待鉴定细菌培养物适量，涂布均匀，风干。同时以马生殖道泰勒氏杆菌的标准

15、抗原作为阳性对照。待涂片似干未干时，滴加预冷丙酮：乙醇液，固定细胞5m i n 1 0r a i n 。用镊子将载玻片放人P B S 液染色缸中充分漂洗，经过3 次，每次3m i n Sr a i n 。将载玻片上多余的水擦干，分别取l Op L 马生殖道泰勒杆菌的标准阳性血清、标准阴性血清( 事先用P B S 稀释1 0 倍2 0 倍) 滴于标本上，放于湿盒内，3 7 温育3 0r a i n 。将载玻片上多余的水份擦干，滴加1 0p L 异硫氰酸荧光素( F I T C ) 标记的抗抗体诊断液( 以P B S 稀释至工作效价) ，并使它布满整个标本。置湿盒中，放3 7 温箱，作用3 0r

16、a i n ，取出玻片，用P B S 充分漂洗，经过3 次，每次3m i n 5r a i n 。将载玻片上多余的水份擦干，在标本处滴一小滴甘油缓冲液，轻轻加上盖玻片。5 2 3 结果判定将载玻片放在荧光显微镜载物台上，调好光源即可观察。阳性反应者F I T C 荧光色素呈明亮的黄绿色荧光。5 2 4 结果说明间接荧光抗体法因特异性强、灵敏度高，可用做马生殖道泰勒氏杆菌的最后确诊。6 病原套式P C R 分子鉴定6 1 材料与试剂6 1 1 仪器与器材6 1 1 1P C R 扩增仪。6 1 1 2 高速台式冷冻离心机( 离一E L , 速度1 20 0 0r m i n 以上) 。6 1 1

17、 3 台式离心机( 离心速度20 0 0r m i n ) 。6 1 1 4 混匀器。6 1 1 5 冰箱( 2 8 和一2 0 两种) 。6 1 1 6 微量可调移液器及配套带滤芯吸头。dG B T2 7 5 2 9 - - 2 01 11 7E p p e n d o r f 管( 1 5m L 带盖塑料离心管) 。1 8 稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。1 9电泳凝胶成像系统( 或紫外分析仪) 。 2 试剂2 1 蛋白酶K ：见附录c 。2 21 0 S D S 液：见附录C 。2 3 异丙醇：一2 0 预冷。2 4N a A c ( 3m o l L ) ：见附录C 。2 57 5 乙醇：

18、见附录c 。2 6T a q 酶：5U z L 。2 71 0 P C R 缓冲液。2 8d N T P s ：含有d A T P 、d T T P 、d C T P 、d G T P 各2 5m m o l L 。2 9 电泳缓冲液：用5 T B E 电泳缓冲液稀释成工作浓度，即0 5 T B E 缓冲液( 见附录c ) 。2 1 0E B ：见附录C 。2 1 1 加样缓冲液( 6 ) ：见附录C 。2 1 20 1m o l LP B S ( P H 8 0 ) ：见附录B 。2 1 3 引物：加灭菌蒸馏水配制成2 0t * m o l L 工作液( 见表1 ) 。表1 套式P C R

19、引物序列名称序列在1 6 Sr R N A 位置上游外侧引物P P l5 - C C A T T A G A G G C T G T T A A T C A A T C G G G A A A C C 一3 3 8 6 7上游内侧引物P P 25 L C C A T A C C G A A C C C A A T A C C A A G C A C A C A A G _ 3 2 4 5 2 7 4下游引物P R l5 L G T G T C A T T A A G G T G T G T A T T T G ( 汀C T G G T G _ 3 4 8 24 5 36 2D N A 模板的制

20、备取n 个灭菌的1 5m LE p p e n d o r f 管，其中r L 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和( 阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出) ，编号。用微量可调移液器于每管加p H 7 0P B S1m L ，将生殖道拭子浸泡、挤压后，于4 1 50 0 0r m 离心1m i n ，去上清液。用微量可调移液器于每管加入蛋白酶K 至终浓度1 0 0 t g m L 和S D S 至终浓度1 0g L ，5 5 水浴2h 。用微量可调移液器于每管分别加入苯酚、苯酚一氯仿一异丙醇混合液( 体积比为2 5 ：2 4 ：1 ) 、氯仿，在混匀器上剧烈混匀，各抽提1 次，吸取水相转移至新E

21、 p p e n d o r f 管。用微量可调移液器及配套带滤芯吸头于每管加入1 1 0 体积3r a o l L 的N a A c 和2 5 倍体积的无水乙醇，轻轻混匀后置一2 0 沉淀1h ，4 条件下1 20 0 0r m i n 离心1 5r a i n ，弃掉上清液。用微量可调移液器于每管加入7 5 乙醇洗涤，4 条件下1 20 0 0r r a i n 离心5r a i n ，沉淀烘干后悬浮于水中，取适量用作P C R 模板。若需长期保存应放置一7 0 冰箱。 6 3 半套式P C R 程序6 3 1 第一次P C R 反应第一次P C R 反应液组成如下 1 0 P C R 缓

22、冲液M g C l 2 ( 2 5r e t o o l L )d N T P ( 2 5r a m o l L )引物P P l ( 2 0t m o l L )“LLu L“L66666666666666666G B T2 7 5 2 9 - - 2 01 1引物P R l ( 2 0t t m o l L )1p LT a q 酶( ( 5UpL)05p L D N A 模板( 1 0n g t 1 L )2p L水3 2 5 “L在P C R 管内加入上述成分，总体积为5 0p L ，30 0 0r m i n 离心1 0S 。 将P C R 反应管置于P C R 扩增仪。先9 5 5

23、r a i n ，再进行9 5 3 0s 、5 8 3 0s 、7 2 3 0s ，3 5 次循环，然后7 2 1 0m i n ，最后4 保温。6 3 2 第二次P C R 反应第二次P C R 反应液组成如下：1 0 P C R 缓冲液5p LM g C l 2 ( 2 5mmolL)4p Ld N T P s ( 2 5mmolL)4“L引物P P 2 ( 2 0t L m o l L )1p L引物P R l ( 2 0t L m o l L )1p LT a q 酶( ( 5U v t L ) )O 5p L D N A 模板( 1 0n g t 1 L )2p L水3 2 5t L

24、 L第一次P C R 产物在带稳压稳流电泳仪的水平电泳槽内进行琼脂糖凝胶电泳后，在电泳凝胶成像系统( 或紫外分析仪) 上进行观察。如果不出现4 4 5b p 的D N A 扩增条带，取2t z L 产物做模板；如果电泳后出现4 4 5b p 的D N A 扩增条带，则需将产物按1 ：10 0 0 稀释后，取2p L 作为第二次P C R 的模板。在P C R 管内加入上述成分，总体积为5 0p L ，30 0 0r m i n 离心1 0S 。 将P C R 反应管置于P C R 扩增仪。先9 5 5m i n ，再进行9 5 3 0s 、6 2 3 0s 、7 2 3 0S ，3 5 次循环

25、，然后7 2 1 0m i n ，最后4 保温。6 3 3 对照设立从6 2D N A 模板的制备开始，设立阳性对照、阴性对照。以含有已知马生殖道泰勒氏杆菌N C T C1 1 1 8 4 株的细菌悬液作为阳性对照，蒸馏水作为阴性对照。6 3 4P C R 产物琼脂糖电泳用T B E 电泳缓冲液配制2 的琼脂糖( 含0 5t t g m LE B ) 平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳 缓冲液刚好淹没胶面。将1 0p L 样品和2p L 加样冲液( 6 X ) 混匀后加入样品孔。在电泳时设立D N A标准分子量作对照。5V c m 电泳约3 0m i n ，当溴酚蓝到达底部时停止。在紫外灯下观

26、察结果。6 4 结果判定第一次P C R 后阳性对照会出现一条4 4 5b p 的D N A 片段。阴性对照则无。第二次( 半套式) P C R 后，阳性对照会出现一条2 3 8b p 的D N A 片段。阴性对照则无。待测样品P C R 扩增后，如能在相应4 4 5b p 、2 3 8b p 位置上出现D N A 条带，即可判定为阳性反应。必要时对扩增产物进行序列测定与比对。6 5 结果说明套式P C R 技术因特异性强、灵敏度高，结合P C R 序列测定、比对，亦可用做马生殖道泰勒氏杆菌的最后确诊。附录A( 规范性附录)培养基配制方法G B T2 7 5 2 9 - - 2 01 1A 1

27、 运输培养基氯化钠( N a c l )3 0g 氯化钾(Kcl)02g氯化钙( C a C l z )o 1g 氯化镁( M g C l z ) 0 1g 磷酸二氢钾( K HzPOt)02g磷酸氢二钠( N a 2H P O 。)1 1 5g巯基乙酸钠( C z H 。N a O ：S )1 0g活性炭1 0 0g琼脂40g称取上述成分，加入蒸馏水定容到10 0 0m L ，稍加热溶解后1 0 7 9k P a 、1 2 1 高压灭菌1 5m i n 。A 2 选择性琼脂培养基：5 ( 体积分数) 热灭活血液巧克力琼脂培养基蛋白胨1 0 0g牛肉浸膏3 0g氯化钠5 0g琼脂1 5 0g加

28、入9 0 0m L 蒸馏水，加热溶解后1 0 7 9k P a 、1 2 1 高压灭菌1 5m i n 。冷却至7 0 - - 8 0 时，加 入5 0m L 马血液，7 0 8 0 水浴1 2 m i n ，期间不断旋摇；继续冷却到4 5 5 0 ，加人1m L 的1 0 0m g m L 半胱氨酸( 终浓度0 8 3t o o l L ) 、1m L 的2 7 7m g m L 亚硫酸钠( 终浓度1 5 9t o o l L ) 、三甲氧苄二氨嘧啶( 1v g m L ) 、洁霉素( 5b t g m L ) 和两性霉素B ( 5p g m L ) ，以灭菌蒸馏水定容到10 0 0m L

29、；充分振摇，倾注平皿，厚度约为4m m ，即可获得高质量的巧克力琼脂培养基。A 3 舍硫酸链霉素( 2 0 0I l g m L ) 选择性琼脂培养基在5 ( 体积分数) 热灭活血液琼脂培养基的基础上添加硫酸链霉素( 2 0 0p g m L ) 。A 4 卵黄氯化钠琼脂培养基( 磷脂酶试验用)A 4 11 0 氯化钠卵黄液的制备取新鲜鸡蛋1 个，以无菌操作取出卵黄，加入1 0 灭菌氯化钠溶液1 0 0m L 中，充分振摇，即得。 A 4 2 卵黄氯化钠琼脂培养基蛋自胨6g牛肉浸出粉1 8g琼脂2 3g氯化钠( N a c l )3 0g蒸馏水6 5 0m Ll O 氯化钠卵黄液1 0 0m

30、L取上述成分( 除1 0 氯化钠卵黄液外) 混合，加热溶化琼脂，调节p H 值为7 6 ，1 0 7 9k P a 、1 2 1 高压灭菌1 5r a i n ，待冷至约6 0 ，以无菌操作加入1 0 氯化钠卵黄液1 0 0m L ，充分振摇，倾注平皿。G B T2 7 5 2 9 - - 2 011附录B( 规范性附录)间接荧光抗体试剂配制方法B 10 1m o l L 磷酸盐缓冲液( P B S ，p H 8 0 )磷酸氢二钾5 5 9g 磷酸二氢钾0 4 1g取磷酸氢二钾5 5 9g 与磷酸二氢钾0 4 1g ，加蒸馏水定容至i0 0 0m L ，充分溶解即可。B 2 甘油缓冲液甘油9

31、0m L0 1m o l LP B S ( p H 8 0 )1 0m L取9 0m L 甘油加1 0m Lp H 8 0P B S 充分混匀，即成甘油缓冲液。8附录c( 规范性附录)P C R 试剂配制方法G B T2 7 5 2 9 - - 2 011C 1 蛋白酶K ( 1 0m g m L )蛋白酶K5 0m g蒸馏水5m L5 0m g 蛋白酶K 溶于5m L 蒸馏水中，分装成每管lm L ，一2 0 保存。c 21 0 S D SS D S ( 十二烷基磺酸钠)1 0 0g蒸馏水10 0 0m L1 0 0gS D S 在9 0 0m L 水中溶解，加热至6 8 助溶，加水定容至1

32、0 0 0m L ，室温保存。c 33m o l L 醋酸钠4 0 8g 醋酸钠( N a A c 3 H ：O ) ，在9 0 0m L 水中溶解，加水定容至10 0 0m L ，室温保存。1 2 1 高压灭菌1 5m i n 。C 47 5 乙醇蒸馏水7 5m L无水乙醇2 5m L用无水乙醇和蒸馏水充分混匀，- - 2 0 预冷。c 55 T B E 电泳缓冲液( 5 浓缩液)T r i s5 4 0g硼酸2 7 5g E D T A2 9g加三蒸水到10 0 0m L用5m o l L 的盐酸( H C l ) 调到p H 8 0 ，或直接购买商品化的产品。c 6E B ( 染色剂)溴化乙锭( E B )1 0 0m g蒸馏水1 0m L用三蒸水配制成1 0m g m L 的浓缩液，使用时每1 0m L 琼脂溶液中加1p L 。c 7 加样缓冲液( 6 x ) 溴酚蓝025g蔗糖40g蒸馏水1 0 0m L称取溴酚蓝0 2 5g 和蔗糖4 0g ，充分溶解于8 0m L 蒸馏水，最后定容至1 0 0m L 。1 2 I 高压灭菌1 5m i n 。