gbt 19163-2010 牛蛙.pdf

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1、I C S6 5 1 5 0 B5 2囝酋 中华人民共和国国家标准G B T1 9 1 6 3 2 0 1 0 代替G B1 9 1 6 3 2 0 0 32 0 1 卜0 卜1 0 发布牛B u f r o g蛙2 0 1 1 0 6 0 1 实施丰瞀鹞鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会促1 9刖罱G B T1 9 1 6 3 2 0 1 0本标准代替G B1 9 16 3 2 0 0 3 牛蛙。本标准与G B1 9 1 6 3 2 0 0 3 相比主要变化如下：标准性质改为推荐性；增加了牛蛙年龄鉴定方法；增加了引用标准G B T1 8 6 5 4 1 、G B T1 8 6 5 4

2、2 、G B T1 8 6 5 4 1 2 、G B T2 5 8 8 4删除了原标准的附录A 。本标准的附录A 为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国水产标准化技术委员会淡水养殖分技术委员会归口。本标准起草单位：湖南农业大学、湖南生物机电学院。本标准主要起草人：王晓清、王宇、肖克宇、何湘蓉、詹炜。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：G B1 9 1 6 32 0 0 3 标准分享网 w w w .b z f x w .c o m 免费下载w w w . b z f x w . c o m牛蛙G B T1 9 1 6 3 2 0 1 01 范围本标准确立了牛蛙( R 口

3、n nc n 协6 e i n n ns h a w ) 的名称与分类、主要形态构造特征、生长与繁殖、遗传学特性、检测方法及结果判断。本标准适用于牛蛙的种质检测与鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B T1 8 6 5 4 1 养殖鱼类种质检验第l 部分：检验规则G B T1 8 6 5 4 2 养殖鱼类种质检验第2 部分：抽样方法G B T1 8

4、 6 5 4 1 2 养殖鱼类种质检验第1 2 部分：染色体组型分析G B T2 5 8 8 4蛙类形态性状测定3 术语和定义G B T2 5 8 8 4 确立的术语和定义适用于本标准。4 名称与分类4 1 学名牛蛙( R n n 口c 4 e s 6 e 妇n 口S h a w ) 。4 2 分类地位无尾目( A n u r a ) 、蛙科( R a n i d a e ) 、蛙属( R 口) 。5 主要形态构造特征5 1 外部形态特征5 1 1 外形身体粗短，头部宽而扁，略呈三角形，1 对圆形鼓膜位于眼后方，鼓膜颜色与头部背面颜色基本一致，沿眼后到鼓膜上方有明显的皮肤褶。皮肤较光滑，背部略

5、显粗糙，有极微细的肤棱。前肢4 指，无蹼，指序为、I 、，雄蛙第一指内侧有发达的婚垫，生殖季节显著增大，雌蛙授有婚垫；后肢特别发达，5 趾，全蹼，蹼不完全达趾端，趾序为I 、V 、。体色随栖息环境、年龄、性别、营养状况而异。通常头部为绿色，背部为绿褐色、黄褐色或黑褐色，有深浅不一的不规则状斑块或斑纹，腹部为灰白色，有暗灰色斑纹。成熟雄蛙下颈部为金黄色，雌蛙则与腹部颜色一致。牛蛙外部形态见图1 。w w w . b z f x w . c o m背面m圈1 牛蛙外形( 0 )512 可量性状腹面m对于体长1 03 1 61 体重1 7 j2g 5 4 87g 的牛蛙，实测性状比例值见表1表1 实

6、测可量性状比例值# 女i * E052 内部构造特征521 声囊雄蛙咽部有1 对内声囊，开口于口咽腔；雌蛙无声囊。522 脊椎颈椎骨l 枚、躯椎骨7 枚、荐椎骨l 枚、尾杆骨l 枚。属前凹后凸的参差型椎体。523 生殖系统成熟雄体有一对浅黄色卵圆形的精巢，保留有退化状态的缪勒氏管。成熟雌体有一对囊状结构的卵巢，卵巢内含有淡黄色的早期卵和动物极为黑色、植物极为乳白色豹成熟卵或接近成熟卵。生殖腺的前方各有一十指状脂肪体，性成熟前为白色或淡黄色t 性成熟后为黄色，大小随季节及营养状况等因素变化。6 生长与整殖61 生长养殖条件下牛蛙体长、体重的宴测值见表z 。表2 养殖条件下牛蛙的体长、体重实测值体

7、K c m体i 旭标准分享网 w w w .b z f x w .c o m 免费下载w w w . b z f x w . c o m62 繁殖62 1 性成熟年龄性成热年龄为2 龄。6 22 产卵季节北方地区为5 月份8 月份，湖南、湖北等省为4 月份9 月份，广东、福建等省为3 月份1 1 月份适宜产卵水温2 0 3 0 。6 23 产卵次数与类型性成熟雌蛙每年可产卵1 攻2 次，并以春季产卵为主。卵球形，卵径12 l5 嘶动物极深黑色，植物极乳白色产出的卵外包胶质膜，相互粘连成单层或团状卵块。624 怀卵量性成熟雌蛙生殖季节卵箍系数为1 26 2 76 ，绝对怀卵量( 5o o7 7

8、) 1 04 粒，相对怀卵量( 1 0 67 86 9 ) 粒g 。7 遗传学特性71 细胞遗传学特性牛蛙体细胞染色体数：2 ”一2 6 ，臂教( N F ) ：5 2 核型公式孙一2 2m + 4s m 。牛蛙染色体组型见围2 。8XR ) | K 只只xx i ) I 入xxxxx xK1 IJ ? 1 坚囤2 牛蛙染色体组型图72 生化遗传学特性牛蛙心肌的乳酸脱氲酶( L D I j ) 同工酶电泳酶谱见图3 ，酶带扫描图见图4 。图3 牛蛙心肌L D H 同工酶电泳酶谱图4 牛蛙心肌L D H 同工酶酶带扫描图8 检测方法81 抽样按G B T1 8 6 5 42 的规定执行。w w

9、w . b z f x w . c o mG B T1 9 1 6 3 2 0 1 08 2 年龄鉴定8 2 1 取样剪取牛蛙第2 趾骨，清洗晾干。8 2 2 操作步骤将材料放入8 0 乙醇中硬化l oh 1 5h ，在3 硝酸溶液中脱钙2 4h 左右，使其软化，然后按常规石蜡切片方法制片。8 2 3 观察年龄在显微镜( 1 0 2 0 ) 下可观察到黑色狭窄带与淡红色宽带间隔的排列，黑色带即为年轮标志，1 个年轮记为1 龄，2 个年轮记为2 龄，依此类推。8 3 生物学性状测定按G B T2 5 8 8 4 的规定执行。8 4 繁殖力的测定在繁殖季节，解剖未产卵的雌亲蛙，取出卵巢，用电子秤称

10、重，再称取1 0g 卵，2 个样品，分别计数每克卵的平均卵粒数。卵巢中所含的全部卵粒数即为绝对怀卵量，单位体重( g ) 所含的卵粒数为相对怀卵量。8 5 染色体的测定8 5 1 标本制备术前8h 1 2h 腹腔注射质量分数为O 1 的植物血凝聚素( P H A ) o 5m L 1 om L ( 每1 0 0g 体重) ，术前4h 6h 腹腔注射秋水仙素溶液( 每克体重1 0p g 1 5p g ) ；解剖牛蛙，从股骨和胫骨中取骨髓放人质量分数为o 4 的氯化钾( K c l ) 溶液中，3 7 水浴1 5m i n 2 0m i n 。以10 0 0r m i n 离心1 0m i n ，

11、弃其上清液，加lm L 固定液( 甲醇：冰乙酸为3 ：1 ) ，4 条件下固定2 0m i n ，重复固定2 次。再加少量固定液，制取细胞悬液；取细胞悬液滴片，在酒精灯上文火烘干，浸没在吉姆萨( G i e m s a ) 工作液( 配制按G B T1 8 6 5 4 1 2 的规定执行) 中染色3 0m i n ，用蒸馏水冲去多余染液，空气干燥制片。8 5 2 染色体计数和组型分析按G B T1 8 6 5 4 1 2 的规定执行。8 6 生化遗传分析8 6 1 试样的制备与保存解剖牛蛙，取心肌，用生理盐水洗去血液后称重、切碎，按质量体积比1 ：5 加生理盐水低温匀浆，4 条件下以1 2o

12、o or m i n 离心l om i n 。取上清液加入等量4 0 的蔗糖溶液，摇匀后作好标记置于一2 5 冰箱中保存。8 6 2 电泳分离用水平平板电泳仪及质量分数为6 的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用溴酚蓝作指示剂。加样前，5 0m A 预电泳3 0m i “；加样后，稳压z 8 0V ，电泳8 0m i n 9 0m i n ，至溴酚蓝到达距胶前沿1c m 处停止。8 6 3 染色固定电泳结束后，取凝胶放人预先配好的染色液中，3 7 温浴1 0m i n 3 0m i n ，至条带清晰，倾出染色液，用固定液( 按甲醇：乙酸；水的体积比为4 5 ：1 2 ：4 3 配制) 终止反应。同工酶染

13、色液配制见附录A 。8 6 4 扫描测定用激光扫描仪对电泳图谱进行扫描分析。9 结果判断按G B T1 8 6 5 4 1 的规定执行。标准分享网 w w w .b z f x w .c o m 免费下载w w w . b z f x w . c o m附录A( 规范性附录)同工酶染色液的配制G B T1 9 1 6 3 2 0 1 0A 1磷酸盐缓冲液( 0 5m o l L ) 的配制取磷酸二氢钾( K H 。P o 。) 6 8g 溶于约8 0m L 蒸馏水中，以氢氧化钠( N a O H ) 溶液( 2m 0 1 L ) 调节p H 至7 4 ，再用蒸馏水定容至1 0 0m L 。A

14、2 氯化硝基四氮唑蓝( N B T ) 贮液( m g m L ) 的配制取5 0m g 氯化硝基四氮唑蓝( N B T ) 定容于5 0m L 蒸馏水中，4 保存。A 3辅酶I ( N A D ) 贮液( m g m L ) 的配制取l o om g 辅酶I ( N A D ) 定容于1 0m L 蒸馏水中。A 4 吩嗪甲酯硫酸盐( P M s ) 贮液( m g m L ) 的配制取5 0m g 吩嗪甲酯硫酸盐( P M s ) 定容于5 0m L 蒸馏水中，4 暗处保存。A 5 氯化钠( N a c l ) 溶液( 0 1m o l L ) 的配制取氯化钠5 8 4m g 定容于1 0

15、0m L 蒸馏水中。A 6氯化镁( M g c l 2 ) 溶液( 0 0 0 5m o l L ) 的配制取氯化镁( M g C l ：6 H ：O ) 1 0 0m g 定容于1 0 0m L 蒸馏水中。A 7 乳酸钠溶液( 1m o l L ) 的配制取D 卜乳酸钠9 3 5m L ( 浓度6 0 0m g m L ) 加蒸馏水至5 0m L 。A 8 染色液的配制取磷酸盐缓冲液( A 1 ) 7 5m L ，加氯化硝基四氮唑蓝溶液( A 2 ) 7 5m L 、辅酶I 溶液( A 3 )3 om L 、吩嗪甲酯硫酸盐溶液( A 4 ) o 7 5m L 、氯化钠溶液( A 5 ) 3 om L 、氯化镁溶液( A 6 ) 3 om L 、乳酸钠溶液( A 7 ) 3 Om L ，混匀即成。