三阴性乳腺癌中Ki-67和P53表达分析及其意义.pdf

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1、中国医科大学硕士学位论文三阴性乳腺癌中Ki-67和P53表达分析及其意义姓名：贾实申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：张文海20100301中文论著摘要三阴性乳腺癌中和表达分析及其意义目三阴型乳腺癌（的，）是指雌激素受体（）孕激素受体（）和受体表达均呈阴性的乳腺癌，约占全部乳腺癌的。它是一种有着较强临床侵袭性表现的乳腺癌，现在还缺少有效的靶向治疗药物。因此研究三阴性乳腺癌的分子生物学特征对于判断肿瘤预后，制定临床化疗方案，以及寻找靶向治疗的方法有着重大的意义。本研究通过分析三阴性乳腺癌的临床一般情况及免疫组化的方法对乳腺癌中的及进行检测分析其临床病理特征及可能对预后造成的影响。方法同期选取

2、自年至年我院手术切除并经病理证实的乳腺癌例，其中三阴性乳腺癌例（均经外院病理会诊再次证实），术均未进行新辅助治疗。收集其发病年龄，月经状况，淋巴结状况，肿瘤大小，病理类型等临床病理资料。肿瘤标本经石蜡包埋，岬厚切片，采用法对蛋白表达进行检测。鼠抗人核抗原单克隆抗体，鼠抗人抗体，免疫组织化学试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。结果判定：）、癌细胞核棕黄色着色为阴性表达，细胞膜棕黄色着色为阴性表达。（）一阳性表达，以细胞核内棕色颗粒为阳性；每例观察个高倍视野，每个视野记数个细胞，阳性细胞数占细胞总数的比例为：为一，为，为，为。（）蛋白：细胞核内棕色颗粒，阳性细胞为阴性，阳性细胞为阳性。统计学

3、方法运用四格表法（）进行统计学分析，有统计学意义。多士耋日里禾鼬与表达结果：（）三阴组的瞄表达率为，的阳性表达率为，均比非三阴性组高，且，有统计学意义。（）晚期乳腺癌组的及表达均高于早期乳腺癌组，有统计学意义。结论本实验采用飚及作为实验指标是因为这两个基因为判断乳腺癌预后的重要指标，而本实验证明了在三阴性乳腺癌中这两个指标表达程度较高，这从一定程度上解释了三阴性乳腺癌易复发转移预后较差的分子生物学原因，并为检测这两个基因情况来判断三阴性乳腺癌的预后提供依据。并希望能够通过其表达通路找到更多的潜在治疗靶点。关键词；三阴性乳腺癌；免疫组织化学英文论著摘要一， ， ，一 ，一 （），一，一 ；英文缩

4、略词中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：篮日期：堕！翌：中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，

5、发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），以采用影印、缩印或其他手段保存论文。一勿？论文三阴性乳腺癌中（和表达分析及其意义刖三阴型乳腺癌（昌，）是指雌激素受体（）孕激素受体（）和受体表达均呈阴性的乳腺癌，约占全部乳腺癌的【。它是一种有着较强临床侵袭性表现的乳腺癌，现在还缺少有效的靶向治疗药物。因此研究三阴性乳腺癌的分子生物学特征对于判断肿瘤预后，制定临床化疗方案，以及寻找靶向治疗的方法有着重大的意义。

6、本研究通过分析三阴性乳腺癌的临床一般情况及免疫组化的方法对乳腺癌中的一及进行检测分析其临床病理特征及可能对预后造成的影响。材料与方法一、材料选取自年至年我院手术切除并经病理证实的乳腺浸润性导管癌例，其中三阴型乳腺癌组例（均经外院病理会诊再次证实），非三阴性乳腺癌组为例，术前均未进行新辅助治疗。收集其发病年龄，月经状况，淋巴结状况，肿瘤大小，病理类型等临床病理资料。（见表）在例乳腺癌中三阴性乳腺癌的比率为。在例乳腺癌中期乳腺癌有例，期乳腺癌例，期乳腺癌例，期乳腺癌例。其中三阴性乳腺癌中期例，期例，期例，期例。表二、方法肿瘤标本经石蜡包埋，厚切片，采用法对蛋白表达进行检测。鼠抗人飚核抗原单克隆抗体

7、，鼠抗人抗体，免疫组织化学试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。三、结果判定（）、癌细胞核棕黄色着色为阴性表达，细胞膜棕黄色着色为阴性表达。（）阳性表达，以细胞核内棕色颗粒为阳性：每例观察个高倍视野，每个视野记数个细胞，瞄阳性细胞数占细胞总数的比例为：为，为，为，为一。（）蛋白：细胞核内棕色颗粒，阳性细胞为阴性，阳性细胞芝为阳性。四、统计学处理采用软件进行统计学处理，比较用检验，为差异有显著性。结果、飚一与表达结果：三阴乳腺癌组的飚表达率为，的阳性表达率为，均乍阴性组高，且，有统计学意义。、硒表达情况（）在临床分期中表达情况，见表表比较早期乳腺癌（期，期）与相对较晚期乳腺癌（期，期）中的尉

8、表达，。（）在三阴性乳腺癌与非三阴性乳腺癌中硒的表达见表表三阴性乳腺癌组与非三阴性乳腺癌组中的表达，、表达情况（）临床分期中表达情况见表比较早期乳腺癌（期，期）与晚期乳腺癌（期，期）中的表达，。（）在三阴性乳腺癌与非三阴性乳腺癌中的表达见表表三阴性乳腺癌组与非三阴性乳腺癌组中的表达，讨论通过基因微阵列分析，目前可以把乳腺癌分成五种亚型包括：激素受体阳性类型和型；过度表达型；正常乳腺基因表达型；以及基底细胞型，基底细胞型乳腺癌与正常乳腺基底上皮细胞表达相似，肿瘤细胞像基底细胞一样表达细胞角蛋白分子和，并且缺乏、和受体的表达，通常认为三阴性乳腺是基底细胞型乳腺癌的一个亚型。飚蛋白是一种具有蛋白酶性

9、质的碱性蛋白，是维持细胞周期的绝对必需物质，可作为反映细胞增殖程度的标记物，它在增生细胞的、（、期表达，细胞有丝分裂后该蛋白含量迅速减少，在期不表达。其功能被认为与细胞的有丝分裂密切相关。在本组资料显示：一性表达率随肿瘤分期提升而升高，并在早期乳腺癌（期，期）与晚期乳腺癌（期，期）的分组对比中表现出与临床分期的明显相关性，证明了飚可能与乳腺癌肿瘤淋巴结转移程度及肿瘤的生长活跃程度密切相关。而在三阴性乳腺癌与非三阴性乳腺癌组的对比中，三阴性乳腺癌组的明显有着过表达，这与国外学者的研究结果一致【】，证明了三阴性乳腺癌较易发生复发和转移，预后相对较差。野生型是肿瘤抑制基因，基因突变或蛋白与其他基因产

10、生结合，均可导致蛋白的功能丧失，失去抑制细胞周期运行和触发细胞凋亡的功能，突变的基因已不再是抑癌基因，它发挥着癌基因的作用【】。本组资料通过统计学分析显示不仅在早期及晚期乳腺癌组存在差异（），的表达在三阴组与非三阴组中的差异也非常明显（），这说明不仅仅是判断肿瘤侵袭性及预后的标志，更可能是三阴型乳腺癌的一个特征性基因位点。由于三阴性乳腺癌还缺乏有效地靶向治疗药物，是近年来的乳腺癌研究的热点，已经有抑制剂吉非替尼，原癌基因抑制剂伊马替尼投入到临床研究中【：最新的文献提出针对雄激素受体的治疗有可能成为新的治疗靶点【】；而雌激素受体亚型有可能成为其内分泌治疗新方向。因此通过研究飚一及在三阴性乳腺癌中

11、的表达有助于三阴性乳腺癌的基因谱研究，并希望能够通过其表达通路找到更多的潜在治疗靶点。结论本实验采用硒及作为实验指标是因为这两个基因为判断乳腺癌预后的重要指标，而本实验证明了在三阴性乳腺癌中这两个指标表达程度较高，这从一定程度上解释了三阴性乳腺癌易复发转移预后较差的分子生物学原因，并为检测这两个基因情况来判断三阴性乳腺癌的预后提供依据。但国外也有研究表明，飚及与表皮生长因子受体（）的表达成正相关，与及的表达成负相关引，因此这两个基因是否能作为三阴性乳腺癌的特异性检验指标还没有可靠证据。参考文献，：；，旧，；：，：， ， ， ： ，（）：，五， 。豫， ，（）：，彤：，（）：，：， ；（）： ，

12、（）：本研究创新性的自我评价由于三阴性乳腺癌还缺乏有效地靶向治疗药物，是近年来的乳腺癌研究的热点，因此通过研究尉及在三阴性乳腺癌中的表达有助于三阴性乳腺癌的基因谱研究，并希望能够通过其表达通路找到更多的潜在治疗靶点。综述三阴性乳腺癌的相关分子标记物分析摘要三阴性乳腺癌是一类有着极强临床侵袭性的肿瘤。大多数的三阴性乳腺癌都呈基底样乳腺癌的分子表现型，有着细胞角蛋白和上皮细胞标识蛋白的表达。而在通常的乳腺癌分类中，三阴型乳腺是指雌激素受体，孕激素受体以及受体均为阴性表达的乳腺癌，这类乳腺癌相对于其他类型乳腺癌来说其总体生存率及无病生存率都较低，缺乏有效靶向治疗手段并易对标准的化疗方案产生耐药。本文

13、通过总结三阴性乳腺癌中相对过表达或低表达的基因和蛋白，希望能够准确描述三阴性乳腺癌的分子生物学特征，从而能够找到针对其的靶向治疗及预防手段。关键词乳腺癌，基因，三阴性三阴性乳腺癌，）是指雌激素受体（）孕激素受体（）和受体表达均呈阴性的乳腺癌，。指出三阴性乳腺癌占全部乳腺癌的，它是一种有着较强临床侵袭性表现的乳腺癌，现在还缺少有效的靶向治疗药物【。发现三阴性乳腺癌易对标准的化疗方案（含蒽环类药物）产生耐药。与等研究表明多发于美籍非洲裔妇女，绝经前妇女，及具有家族乳腺癌遗传因素的患者【】【】。三阴性乳腺癌的分子生物学研究对于判断肿瘤预后，制定临床化疗方案，以及寻找靶向治疗的方法有着重大的意义。、细

14、胞角上皮及肌上皮相关基因：（）细胞角蛋白基因及细胞角蛋白（）基因表达的是一组细胞骨架蛋白，包括多种亚群，其表达有明显的组织特异性和分化特异性。传统观点认为正常乳腺组织存在种上皮，即内层的腺上皮和外层的肌上皮，后者可表达基底型。基因微阵列分析将乳腺癌分为个亚型：，类似正常组织的乳腺癌，基因过度表达性乳腺癌，以及细胞基底样乳腺癌（）。通过对研究细胞角上皮及肌上皮相关基因和等发现这些基因与乳腺癌的复发与转移关系密切【。报道在多种上皮来源的恶性肿瘤中都有不同程度的表达，而在骨髓、血液等组织中无表达，因而被用于多种上皮来源肿瘤的检测【】。等对例乳腺癌患者运用组织微阵列分析（）和免疫组化方法发现，细胞基底

15、样乳腺癌不表达雌激素受体及受体基因。而绝大多数三阴性乳腺癌都会表达与角蛋白相关基因，例塑和（或）基斟。（）基因基因（）或称为间充质叉头框（，），是属于人类叉头状结构（或）家族的一个转录因子，它可以调节脂肪细胞的代谢，减轻转基因小鼠饮食诱导的胰岛素抵抗，是可能对肥胖和胰岛素抵抗有拮抗作用的候选基因。发现基因的过表达能够提高鼠乳腺癌细胞的转移能力，在对三阴性乳腺癌的研究发现，的表达与三阴性乳腺癌强相关，并认为这与能够通过肿瘤坏死因子（）以及某些上皮转化因子来促进上皮间充质的转化有关，并推钡在三阴性乳腺癌的转移性与侵袭性中起着重要作用【。（）胶原受体基因：是甘露糖受体（）家族中的一员，主要参与细胞内

16、胶原的降解过程。发现胶原受体的编码基因在三阴性乳腺癌中表达，并可促进肿瘤生长，并在上皮肿瘤的细胞系中过度表达并具有很强的侵袭性，这与能够通过转换生长因子从而上行调节上皮肿瘤蛋白质的转录有关，并提出检测可能对判断乳腺癌的预后有着很大的帮助例。、原癌基因及相关基因：（）原癌基因（定位于人染色体，编码分子量为的跨膜糖蛋白，是型酪氨酸激酶受体，它同血小板衍生的生长因子（）和集落刺激因子。（。）属于同一受体家族。一旦发生突变可使多种肿瘤抑制基因失活，促使细胞进入分裂周期，抵抗细胞凋亡，诱导细胞恶性转化，在肿瘤发生、发展、迁移、复发中可能发挥重要作用。对例乳腺癌标本研究发现绝大多数三阴性乳腺癌都会表达与角

17、蛋白相关基因，例如细胞角上皮及肌上皮相关基因、基因等【】。采用提取及微阵列等方法分析例三阴性乳腺癌标本发现的标本表达，表达，所以他们认为三阴性乳腺癌在很大程度上等同于基底样型乳腺癌【。（）表皮生长因子受体（）相关基因基因所表达的表皮生长因子受体（）与多种恶性肿瘤的发生发展及预后等密切相关。等运用单克隆抗体对名三阴型乳腺癌患者的进行分析表明超过的患者存在着的过表达【】。等人对例乳腺癌标本进行研究，发现相对于和（或）性的乳腺癌，三阴性乳腺癌的细胞系对于的抑制药物更加敏感，他们研究认为，这可能是由于这些药物通过干扰（磷脂酰肌醇一一激酶蛋白激酶）通路从而抑制的产生【。而等认为这些药物是通过（丝裂原蛋白

18、活化激酶细胞外信号调节蛋白激酶）通路起作用的【。他们都提出检测人体内的水平对判断乳腺癌患者的预后有着较强提示作用。、抑癌基因及相关基因（）基因基因是年由等个研究小组分别发现并命名的第一个具有磷酸酯酶活性的抑癌基因。该基因定位于染色体，共有个外显子个内含子，长，长度为，其编码的蛋白具有蛋白性磷酸酯酶活性和脂性磷酸酯酶活性。基因作为一种肿瘤抑制基因，在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。体外实验显示，蛋白的磷酸酯酶活性可使磷酸化的丝苏氨酸和酪氨酸残基去磷酸化，与细胞内信息的传递有关，参与细胞的生长、凋亡等调控过程。目前普遍认为，的抑癌机制由几条途径共同完成：通过使磷脂酰肌醇三磷酸（）去磷酸化负调控（蛋

19、白激酶）途径调节细胞的增殖与凋亡平衡；通过对粘着斑激酶（）的去磷酸化抑制细胞转移及浸润；通过抑制促分裂原活化蛋白激酶（）细胞信号传导途径抑制细胞的生长和分化。，在研究表达产物时发现，雌激素受体阴性的乳腺癌中表达缺失率明显增高【”】。等人通过对例乳腺癌标本研究表明，能够活化磷脂酰肌醇一一激酶（）通路，从而使，受体得以表达，其缺失会导致，拘缺失并进一步导致三阴性乳腺癌的发生【】。（）家族性乳腺癌易患基因被证实位于染色体，作为一种抑癌基因，在正常乳腺上皮细胞核内起重要的转录调控作用，参与细胞周期的调节，抑制细胞增殖，促进细胞终末分化，诱导细胞凋亡和参与细胞损伤修复，维持基因组的完整，是一个重要的细胞

20、周期负调控子。等通过研究与突变相关的散发性乳腺癌如髓样癌，粘液癌等行免疫组化分析发现这些乳腺癌通常为三阴性乳腺癌【。通过对例乳腺癌患者的基因进行分析并发现乳腺癌通常伴有的变异，所以他们认为的变异可能会破坏的稳定性使其突变 】。而是较早发现的乳腺癌抑癌基因，其突变会增加乳腺癌的遗传性及散发性乳腺癌杂合性基因缺失和等位基因失衡。等通过诱导鼠体细胞及突变，发现其产生的乳腺肿瘤类型为三阴性（基底型）乳腺癌，并进一步研究提出三阴性乳腺癌的形成可能与的突变关系较大【。、其他相关基因（）基因：基因是指转录因子家族中编码锌脂蛋白的基因，一般在背部神经管内表达，参与神经胚的形成，最近发现可以通过影响的上行调节细

21、胞凋亡机制（，），从而阻止凋亡的。研究发现在三阴性乳腺癌中， 有着过表达，他们进一步研究发现，将和（或）性的乳腺癌细胞系置于缺氧环境中，也会出现与三阴性乳腺癌相似的表现型，从而推澳，基因的调节作用可能与缺氧环境相关。（）凋亡抑制基因是凋亡抑制蛋刍（，）家族的新成员，是目前发现最强的凋亡抑制因子，功能复杂，具有抑制细胞凋亡，促进细胞转化、参与细胞的有丝分裂、血管的生成和肿瘤细胞耐药性的产生等作用。可对抗期凋亡的诱导，从而克服细胞凋亡的检查点，允许变异细胞通过有丝分裂异常增殖。还可直接抑；、的活性，抑制细胞凋亡，从而有利于细胞的异常增殖和恶性转化。等设计了两种靶向 的核酶（和），和屹能在的核苷酸位

22、点和切断，将核酶的序列克隆到复制缺陷的腺病毒载体，并用它转染乳腺癌细胞，结果转染的细胞中和蛋白质水平均明显下降，细胞凋亡增加，从而证明了乳腺癌细胞中存在着基因的表达研究发现，受体可以通过干扰与启动子的结合来抑带的表达，从而减少肿瘤的发生。因而在阳性的乳腺癌中基因较少地表达【。、三阴性乳腺癌相关蛋白（）热休克蛋白晶体蛋白晶体蛋白是小分子热休克蛋白家族代表性成员，在保护细胞骨架、抗应激损伤、抗凋亡及其他方面的功能，也发现了其与肌肉、神经系统等多种疾病的重要关系。等在研究例浸润性乳腺癌患者发现阴性乳腺癌型中含有这种蛋白，而只有的非基底样乳腺癌患者发现这种蛋白【。发现，乳腺上皮细胞过度表达晶体蛋白，会

23、造成“乳腺肿瘤样结构”的生成。他们认为幽晶体蛋白是通过通路激活并产生作用的【】。对名新辅助化疗的乳腺癌患者研究表明晶体蛋白在三阴性乳腺癌患者中有着过表达（）并提出出晶体蛋白可以作为对新辅助化疗的效果的预测指标【。（）钙粘附蛋兰（）钙粘附蛋白是一类主要介导细胞间同质粘附的钙依赖性跨膜糖蛋白。主要分为分布于上皮组织中的（，也称），分布于胎盘组织中的等。研究发现在乳腺癌中，的表达减少或缺失与雌激素受体的缺失呈正相关，而与矛，（细胞周期相关核抗原的抗体）等的表达呈负相关，在三阴性乳腺癌中呈低表达【。而通过对例乳腺癌标本的进行测定发现，在三阴性乳腺癌中过表达（），而且与的基因呈明显的正相关性，他认为可以

24、作为检测三阴性乳腺癌的一项指标，但他同时指出并不能作为判断乳腺癌预后的指标【】。（）细胞周期蛋白魁蛋白是一种具有蛋白酶性质的碱性蛋白，是维持细胞周期的绝对必需物质，可作为反映细胞增殖程度的标记物，抗原是细胞增殖相关蛋白，仅在增殖细胞核中表达，被认为是较理想的检测细胞增殖活性的指标。飚单克隆抗体标记后期、期和期、期细胞核抗原，而期、早期的细胞核不被标记，被认为是较理想的检测细胞增殖活性的抗体而雌激素发挥作用不仅仅通过经典的雌激素受体，也通过另一与结构相似的，而在三阴性乳腺癌中有着相对较高的表达【引。通过及免疫组化的方法对，和研究发现，尉一与（）及（）的转录和蛋白质表达呈负相关，而在阴性的乳腺癌中

25、与蛋白质的表达呈正相关，的表达与淋巴结转移阳性密切相关，并由此提出检钡及飚可能对判断肿瘤的预后有较大意义【。姑苇巨当日厢尽管三阴性乳腺是否等同于基底型乳腺癌仍有争论，但三阴性乳腺癌当前仍缺乏有效的靶向治疗方法却是毋庸置疑的，通过基因序列分析与临床观察资料相结合，已经发现，许多三阴性乳腺癌相关分子标记物，与上皮细胞增殖相关的基因，以及抑制肿瘤凋亡细胞因子的过表达都能够从不同方面提示三阴性乳腺癌的预后不良的原因。随着对三阴性乳腺癌研究的深入，越来越多的相关基因，分子标记物会被发现。有理由相信，在不久的将来，就会出现针对三阴性乳腺癌的靶向治疗药物。参考文献，：；心， ：， （），（）一，： ； ，

26、：，； ：剐， ；： ，；：，；（）：， ， （） ；一 （）：， ， （）；（）：，：。；（）：。，：，；（）： ，：；：， ；： ，： ；（）： ， ，： 【】，（）：， ， 州 ；（）：，； 。； ， ；： ， ；一，；（）：，；一（）：， ，仃一： ；（）：，一 ？；（）：， ， ，；（）：， ；（）： ，。 ：；（）： 只凡心口厶；（）：， ；（）：， ：；（）：致谢衷心感谢张文海教授的关心照顾。恩师渊博的知识、精湛的医术、严谨求实的治学态度，一丝不苟的科研作风，执著的敬业精神永远是我学习的楷模。感谢中国医科大学盛京医院乳腺外科何贵金教授、邱芳讲师、李建一讲师、顾玺讲师等在临床实践和科研工作中的悉心教导。在课题进行中，他们出谋划策、积极协助，给予我极大的帮助，使我顺利研究完成。在此，对他们表示深深的谢意。个人简历姓性民名：贾实别：男族：汉出生日期：年月日籍专贯：辽宁省丹东市业：普外科学习工作简历：，辽宁省丹东市第二中学，中国医科大学临床医学专业（英文班），一至今中国医科大学附属盛京医院三阴性乳腺癌中Ki-67和P53表达分析及其意义作者：学位授予单位：贾实中国医科大学本文链接：http:/