蛋白电泳+WB.pdf

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1、SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳1 1、基本原理、基本原理1.11.1 电泳电泳溶液中的带电颗粒在电场作用下的移动大致受到三方面影响：a、颗粒性质：体积大小及形状、实际电荷数、解离强度等。b、环境：电解质或缓冲液的浓度、离子强度、pH 值、粘度和温度。c、应用电场性质：电场强度。不同带电颗粒在同一电场中泳动速度不同，常用“泳动度”或“迁移率”来表示。指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度： = v/E=d/t U/I = dI/Ut迁移率，v 颗粒迁移速度（cm/s 或 min），E 电场强度或电势梯度（V/cm），d 颗粒移动距离（cm），I 支持物的有效长度（cm），U

2、是支持物两端实际电压（V），t 是通电时间。颗粒的迁移率可通过测量 d、I、U、t 计算出。影响迁移率的因素：影响迁移率的因素：（1）带电颗粒的性质：净电荷多少、颗粒大小及形状。一般净电荷多，直径小而且近于球状，则泳动速度快，反之则慢。（2）电场强度（电位梯度）：指单位长度（cm）支持物体上的电位降，它对泳动度起着十分重要的作用。一般电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据电场强度可将电泳分为低压（常压）电泳100500V，电场强度为210V/cm，分离时间需要数小时、数天或更长。高压电泳 5001000V，电场强度 20200V/cm，电泳时间短。有时仅需几分钟，主要用于氨基酸、肽、核苷酸。

3、由于电压增高电流增大需要冷却装置。（3）溶液的 PH：溶液的 pH 值决定带电颗粒的解离程度。也决定物质所带净电荷的多少。对氨基酸、蛋白质等两性电解质而言，溶液PH 值离等电点越远， 颗粒所带净电荷越多， 电泳速度越快。反之越慢。血清中： 白蛋白 pI 4.0； 2 球蛋白 pI 5.06； 球蛋白 pI 5.1； 球蛋白 pI 7.1。在 pH 8.6的缓冲液中电泳时，都带负电荷，其泳动速度为：白蛋白 2 球蛋白 球蛋白 球蛋白。为了利于分离蛋白质混合液，应选择一种使各种蛋白质所带电荷差异明显的 pH 值。（4）溶液的离子强度：在保持足够缓冲能力的前提下，离子强度要求最小。溶液离子强度越高，

4、带电颗粒泳动速度越慢，反之越快。通常选择在 0.050.1molL-1 之间。缓冲溶液离子强度可通过下列公式计算：I=0.5 cZ2；I 溶液的离子强度； c 离子浓度；Z 离子价数。如:0.154 molL-1 的 NaCl 溶液的离子强度。I=0.5（0.15412+0.15412）=0.154（5）电渗作用：在有支持物的电泳时影响电泳的另一个重要因素是电渗作用。电渗作用：在电场中，溶液对固体支持物的相对移动。电渗作用根据支持介质的不同而产生不同程度和不同方向的电渗流动。因此电渗作用与电泳速度关系密切。1.21.2 蛋白电泳蛋白电泳（结合多种资料加以总结，原创，欢迎指错！）细菌酵母及细胞中

5、含有大量蛋白质，具有不同的电荷、分子量及不同的形状。通常做wester 时我们需要排除不同蛋白质之间的电荷、分子形状的差异，以使蛋白的迁移率仅和蛋白的分子量相关，结合蛋白MARKER 和特异性的抗体，检测蛋白的成分。常用的消除电荷因素的试剂是强阴离子去污剂 SDS。大量的 SDS 能够打断氢键和疏水键，按一定比例结合蛋白质，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身的负电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。而上样缓冲液中的还原剂巯基乙醇或 DTT 则能够破坏蛋白质二硫键，是蛋白的构想和形状发生改变，几乎全部成长椭圆状。因此，各蛋白再电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，仅与分子量有关。在

6、此情况下，利用蛋白分子量marker 及相应的特异性抗体即能检测目的蛋白。1.31.3 连续电泳和不连续电泳连续电泳和不连续电泳早先用聚丙烯酸胺作为电泳的支持介质进行蛋白质的分离是用连续电泳系统。连续电泳是指电泳系统使用相同孔径的凝胶和相同缓冲系统的样品缓冲液、凝胶缓冲液和电极缓冲液，且pH 值恒定，只是离子强度不同的区带电泳。使用这种电泳系统分离蛋白质，由于分子筛效应不明显，一般只用于分离组分比较简单的样品，且没有堆积胶的浓缩作用，分辨率较低，加样时必须加成一条极窄的带，以使样品能很好地分离。但如果高分辨不是实验目的，用这种方法制胶快而简单。它的另一个优点是在均一系统的电泳中，缓冲系统的精细

7、组成是已知的，且pH 是恒定的，这对分离pH 敏感的化合物是有帮助的。l 可以防止蛋白样品进入凝胶后，由于 pH 变化而发生凝聚和沉 B 淀。另外它不需要像不连续缓冲系统一样去计算不同离子之间的迁移率变化，所以任何一种不同的酸和碱都能使用。不连续电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳。由于浓缩胶的堆积作用，可使样品（即使是稀样品）在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度）的凝胶上进行分离。由于不同孔径凝胶的分子筛作用，使不连续电泳的分辨率大大高于连续电泳。虽然不连续电泳在缓冲系统的选择和制胶（特别是梯度胶）的操作方面比较繁杂，但它可以得到电泳分离最重要的指标高分

8、辨，因而是目前应用最广泛的技术。1.41.4 浓缩胶的作用原理浓缩胶的作用原理不连续缓冲系统的主要优点之一是可以使用稀样品。这是因为在样品进入分离胶以前，先经过大孔径浓缩胶的迁移作用而被 浓缩至一极窄的区带。其作用原理是在缓冲系统中的弱酸，如甘 氨酸，在接近其 pKa 的 pH 值时，任何时候都只有一部分分子带负电。如样品和浓缩胶均用 pH 6.7 的 TrisHCI 缓冲液， 电极液用 Tris 一甘氨酸缓冲液。此时，甘氨酸很少解离，其有效 泳动率很低，而氯离子却有很高的泳动率，蛋白质分子的泳动率介于氯离子和甘氨酸之间。一旦加上电压，作为先导离子的氯离子和作为尾随离子的甘氨酸离子分离开来，并

9、在其后面留下一个导电性较低的区带。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便 获得较高的电压梯度，并加速甘氨酸的泳动，使其赶上氯离子, 建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动率乘积的相等的稳定态，使这些带电颗粒以相同速度泳动，两种离子之间具有明显的边界。当甘氨酸、氯离子界面通过样品进入浓缩胶时，在移动界面前有一低电压梯度，在界面后有一高电压梯度。由于在移动界面前的蛋白质泳动速度比氯离子低，因此氯离子能迅速越过。移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中，其泳动速度比甘氨酸快。因此，移动的界面将蛋白质分子堆积到一起，浓缩为一狭窄的区带。蛋白质在移动界面中的浓缩作用仅取决于样品和浓缩胶中的 Tris H C

10、I 的浓度， 而与样品中蛋白质的最初浓度无关。 由于浓缩胶为大孔凝胶， 故对样品没有分子筛作用。 当移动的界面到达浓缩胶和分离胶的界面时，凝胶的pH 值明显增加，并导致甘氨酸的大量解离。此时甘氨酸的有效泳动率增加，使它越过蛋白质并直接在氯离子后移动。同时由于凝胶孔径变小，使蛋白质分子的迁移率减小。 于是蛋白质分子在均一的电压梯度和 pH 值中泳动，并根据其固有的带电性和分子大小进行分离。1.51.5 蛋白大小与凝胶浓度蛋白大小与凝胶浓度跑电泳，首先得根据蛋白的大小选准相应浓度的凝胶。浓度大了，蛋白分不开，小了可能跑丢。这方面园子里的战友经历经验都不少。但有关蛋白分子量与凝胶浓度的对应关系，各家

11、报道不尽相同。所以先给出一个大致的对应关系，个人认为不必教条，误差一点，也不是很重要。总的来说丙烯酰胺在凝胶中的浓度越高，其分辨的范围越窄，这里列举的是胶的总浓度和分子量的关系：5.0% 57-212kd5.0% 57-212kd7.5% 3694kd7.5% 3694kd10% 1668kd10% 1668kd12.5% 1560kd12.5% 1560kd15% 1545kd15% 1545kd20% 215kd20% 215kd注意注意：1、SDS 聚丙烯酰胺中；双丙烯酰胺：丙烯酰胺=1:29,常用。 2、对未知蛋白，常选孔径较大的 7.5%的均匀胶实验，然后据条带迁移距离来选择合适浓度

12、。2.试剂准备和实验操作：试剂准备和实验操作：2.12.1 电泳试剂，及配置方法：电泳试剂，及配置方法：1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，ddH2O，37OC 溶解,定容至 100ml, 棕色瓶存于 4 度。2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0)：Tris 18.17g 加 ddH2O 溶解, 浓盐酸调 pH 至 8.0,定容至 100ml。存于 4 度3、1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g 加 ddH2O 溶解, 浓盐酸调 pH 至 6.8,定容至 100ml。存于 4 度4、10% SDS：电泳级 S

13、DS 10.0 g 加 ddH2O 68助溶,浓盐酸调至 pH 7.2,定容至 100ml。存于室温5、TEMED：Sigma6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP 加 ddH2O 至 10ml。使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。4 度存则两周内用完，最多不能超过一个月。负 20 度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。所以如果多配了尽量小量多分装。以上为经验，请使用者考虑后，在没办法的情况下试行。7、2SDS 电泳上样缓冲液：100mmol/L Tris?CL(pH6.8)，200mmol/L DTT, 4%SDS(电泳级)，0.2%溴酚蓝，20%甘油。使用时在样品中加等量的 2X 上样

14、液即稀释成一倍的上样液.8、5Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris 碱和 94甘氨酸，5电泳级的 SDS，双蒸水定容至 1L，pH 值为 8.3。2.22.2 不连续胶的配置不连续胶的配置不同的蛋白大小，需要的聚丙烯酰胺浓度也不一样。关于这个方面的对应关系，BeetleHead 战友可能会贴出来。这里暂时不写，如有必要再添加。这里按照 12%的浓度配分离胶，4%的浓度配浓缩胶。按下述顺序依次加入。1、 分离胶(12%)的配制(15ml):ddH2O 4.9 ml30%储备胶 6ml1.5M (PH=8.8)Tris-HCl 3.8ml10% SDS 0.15 ml10% 0.15A

15、P mlTEMED 6 l2、 积层胶（4%）的配制(4ml)：ddH2O2.8 ml30%储备胶 0.66ml1M Tris-HCl (PH=6.8)0.5ml10%SDS 0.04 ml10%AP 0.04mlTEMED 4 l2.32.3 操作步骤：操作步骤： 配胶准备：将玻璃板、梳子有清洁剂或稀酸泡洗，电泳装置用水冲洗并晾干，亦可用酒精棉球擦洗灌胶面晾干，根据厂家说明书安装玻璃板。 确定所需凝胶溶液体积，按上表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。(3)灌 bio-rad 迷你垂直板两块

16、板共约需 7.5ml.故实际操作时，我们通常在加AP 和 TEMED 前将上述混合液均分为两份。一份放4 度保存，下次用；一份继续加 0.075ml 的 AP 和 3 l 的 TEMED，混匀后，立即灌胶。用双蒸水封胶，压平胶面。留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加 0.5-1cm)。(4)等待过程中，配制浓缩胶溶液，AP 和 TEMED 使用前加入。也可进行样品的准备工作，具体做法在转膜中将又专门讲解。(5)室温约 30 分钟-40 分钟后聚合。倒去双蒸水，再用滤纸吸净残留水。灌浓缩胶，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需 15-20 分钟。（6）浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子。把凝胶固定于

17、电泳装置上，上下槽各加入 Tris-甘氨酸电极缓冲液。 (7)按预定顺序加样，加样量通常为 1025 l（0.75mm 厚的胶），最多可加进 35ul（本人的经历！）。（8）将电泳装置与电源相接，浓缩胶上所加电压为80v。当染料前沿进入分离胶后,约 15-20 分钟，把电压提高到120，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部，然后关闭电源。(9)电泳结束前准备转膜缓冲液，同时根据胶大小准备膜，与虑纸一同放入转膜缓冲液中浸泡(10)停止电泳,从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。切去多余部分,切去一角以标注凝胶的方位，或依据预染的 MARKER 来标记。将胶置于转膜缓冲液中平衡离子浓度 5 分钟，

18、准备转膜。2.3.12.3.1 注意事项：注意事项：1、清洗厚薄两块玻片：初次使用需要用酒精棉球擦拭干净。经常使用用自来水冲洗干净后，再用单蒸水冲洗，晾干。也可用酒精擦拭。2、取合适大小，容器将各液体依次加入，在加 AP 和 TEMED 前将玻璃片放入 casting frame 做成 glass plate sandwich，放在水平桌面上锁定后，固定在 casting stand 上，注意垂直放置，压紧底面的胶条，以防漏液。2.3.22.3.2 常见问题及解答：常见问题及解答：1、两快玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平?1)你的玻璃洗干净没有？应该要洗得非常干净！2)过硫酸铵和 TEMED

19、的加量不合适，加量相对较多，凝胶凝固过快也会胶不平，最多按照分子克隆加倍3)加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平；4)稍微注意手法，均匀加入5)灌胶后应该用水或者正丁醇压胶面或用 20%的乙醇封顶(没有毒性可以除气泡，使用效果极好）。战友小新723 认为：“第一天灌胶后，用乙醇直接压，待乙醇挥发完毕后，上面加一层水，第二天电泳用，效果很好。不用正丁醇，乙醇比正丁醇效果要好多了”。6)边缘胶是不容易聚合完全的，灌完胶后要立即加无水正丁醇覆盖，浓度越低的胶越不要使用双蒸水压顶，另外还可以在压顶试剂如正丁醇中添加少许 AP 来增加边缘胶的凝聚强度7)温度也

20、是影响胶聚合的重要因素，我们有些同学为了让胶更快的凝固而把胶放到 50 度的温箱，由于受热不均匀，造成胶聚合不均匀。2、胶为什么总是漏？1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件，下次用之前，用 75酒精擦拭玻璃和胶条，能有效防漏，且利于剥胶。2）避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方3）关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了4）胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。5）下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用6）玻璃在使用过程中容易造成小的缺口， 从而导致封条无法完全密封， 装好架子后， 在玻

21、璃底边上抹上一层薄薄的凡士林就好了，两边多点（容易从两边漏）这样就不会漏了，就算是用了很久的很多小缺口的玻璃都没有问题，然后转移到电泳槽的时候，去掉封条，把底上的凡士林擦干就 OK 了（注意，一定要擦干净，尤其是少量进入了两隔玻璃之间空腔的，赢伟凡士林不导电，会影响第2 相的效果的7）你可以在海绵垫下再垫一些纸，使得它与玻璃贴的更紧密。或者在玻璃底部用琼脂糖封上。8）因为两块玻板没有放的完全对齐，底部不在同一个平面，所以封条封不严，重新对齐后就不漏了。以后每次只要在水平的桌面上仔细对齐两块玻板，再夹紧。用手感觉一下确定在同一平面上后，放到灌胶架并压在封条上，卡紧。注意两边均匀用力，一般不会再漏

22、。9）先把两块玻片放在夹子上，不要加紧，放到架子上，使两块玻片的底部对齐，夹紧两块玻片，然后取下再在其下面垫上垫片，这样一般就不会漏胶了。但是如果你放了垫片再对齐玻片底部，或者在桌子上对其玻片底部然后放到架子上的话，经常会漏胶3、条带跑得比正常的窄？1）可能因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀2）是不是有窄有宽？可能与你拔梳子的时候有关，拔梳应该迅速，冲洗加样孔的时候要小心，以免把上样带扭曲；胶配好了用枪吹几下再灌胶，还有就是要等指示剂跑到两层胶交界成一线时，再调高电压。3）可能是你样品的问题，如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一，由于同样的原因，样品在凝胶中的速

23、度会很慢，造成条带走的较慢，好像与你的预想不一致4）常见的原因是：每孔上样量不均匀，应确保每孔中上样量一致5）可能是系统的 ph 出了问题，有可能是你的电极缓冲液，也有可能是凝胶缓冲液，更新缓冲液看看，看是否能成功。4、为什么会有“微笑”和“倒微笑”这样的效果呢？1）微笑是因为你灌胶的时候冷却不均匀，中间部分冷却不好，导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。这种情况在较厚的凝胶以及垂直电泳时常常发生。“倒微笑“也称“皱眉“现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象2）书上说出现“微笑”是因为整个胶冷凝的不均

24、匀，中间部分和两端受热不一样而致成了“倒微笑”可能是因为两端的胶凝的不好，加 APS 和 TEMED 后应该混合均匀。3）样品中盐浓度过高？点样量太多或每孔点样量不均匀？电泳电压不稳定或过高？5、Western-blot 制胶时好多泡泡怎么办？1）首先，玻璃板一定要洗干净，用洗洁净洗，冲干净后再用双蒸水冲一，晾干。配胶的时候沿管壁缓缓加入各个成分，混匀的时候用手轻轻摇匀，如果用枪吹打时要缓慢且不要打到头。2）配胶时混匀要轻，尽量不产生气泡，上胶时要快，枪也不打到底。加完分离胶后用双蒸水封，待其凝固。即使在上胶时液面上有气泡，加水后也会浮上来。分离胶凝好后，倒掉里面的水，用吸水纸吸干，再加浓缩胶

25、，迅速插梳子。3）倒胶的时候，用 1ml 的枪沿一侧缓缓加入，不要打到头，以免带入气泡！4）将胶在小烧杯里配好后，将电泳槽略微倾斜，将烧杯的嘴靠在玻璃边缘，直接倒进去，速度快 ，而且不容易产生气泡，不妨试试5）用双蒸水封时建议用 200ul 的枪加水，这样压力小，以免把胶冲起来！6）国产的只能是缓慢加样，别把气泡加进去。如果加进去了，小心把整个板在桌上敲敲可以让气泡浮上来。7）分离胶中的气泡与插梳子有关，垂直插容易产生气泡，且不容意排除。将梳子倾斜 5-10 度插入，即使产生气泡也可以也可以通过轻轻晃动梳子使气泡从一侧逸出。8)pinghw 还有一个制胶起泡泡的原因，就是配胶的液体全部在四度存

26、放，室温制胶时由于温差及凝胶聚合反应放热的关系， 液体中微小的气泡在凝固的凝胶中也会放大成可见的较大的泡泡，这种情况在夏天室温较高时更容易出现。避免的方法是将制胶成分中除催化剂外的部分配置后放室温下静置一会儿，减小温差后再加入催化剂制胶。6、atgc 战友的个人经验，一些琐碎的细节，但却是实验中可能经常遇到的令人头痛的问题：1）安装好的制胶装置，最好先用配置电泳缓冲液的水加满检验一下是否漏水，检验确认不漏水的装置再用于制备凝胶。 确认不漏水后，倒出水，然后使其尽量流出，其实残留的一点水并不影响结果，而且还会使电泳好的凝胶容易剥落下来。漏水的装置制作的凝胶尽管可以使用，但它会造成电泳时候电流的分

27、流，不但影响电流的效率，而且还会使部分加样孔的条带歪曲。2） 制胶时最好最后加入 AP，这样可以避免偶然情况下不能马上灌胶而导致胶的聚合，确认所有的东西准备齐全了，再最后加入 AP，混合均匀后马上灌胶。一定要使配胶的几种溶液混合均匀，这是制得性质均一的凝胶的前提。3 ）进口的 AP 可以很快使胶凝聚。所以，AP 的用量最好比书上推荐的用量少点，这样可以使胶的溶液慢慢聚合，这更有利于形成均匀一致的凝胶。也不会使操作变得手忙脚乱。4） 有时候，梳子拉出以后，明明看不到加样孔中有凝胶，但是就是加不进去样品，这主要是由于梳子与较大的那块玻璃之间的缝隙中存留的制胶溶液凝聚后形成的很薄的一层凝胶造成的。由

28、于很薄，当梳子拉出后，它就会和玻璃分离，刚好将加样孔的口封住了，如果用 20ul 的加样器加样的话，这层凝胶很容易将样品堵在外面，只要将这层凝胶除去，就可以顺利加样了。如果用专门的微量进样器，不会存在这样的问题。5）薄膜原因可能是由于梳子和 slide 的厚度不是十分一致，而这可能是无法避免的。除此之外，也有由于拔出梳子时候造成的堵塞现象，个人认为，这样的堵塞现象可以通过插入梳子时先用水（配置电泳缓冲液的水）湿润梳子的方法避免，这样还有利于形成整齐的加样孔。不管怎么做，一定要等胶完全聚合好了再拉出梳子。 如果孔的形状变化了，扭曲了，肯定会导致条带不一致，结果不好。6）wangjun200227

29、4 主任的：加样的时候也是用专门的微量进样器，是宁波出的，50ul 容量，每次都是用 20ul 的上样量。以前等胶干后拔出梳子，马上用水冲洗进样孔，就是用的那种塑料瓶挤压冲洗，薄膜就没有了，注意不要用力过猛，如果胶还没有完全凝，很可能导致进样孔不整齐，那么跑出来的条带就有窄有宽了。蛋白质从蛋白质从 SDSSDS 聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜（湿式转膜）聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜（湿式转膜）1）SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，小心取出带有凝胶的玻板，用割胶刀沿下边缘小心撬开短板，按样品的多少切下合适大小的凝胶。浸泡在转膜缓冲液中 5 分钟左右，以平衡离子强度。视情况决定是否切角标记。

30、上槽电泳缓冲液可回收下次作下槽电泳缓冲液用（对穷人适用，呵呵）。2）电泳结束前，应泡好 3M 滤纸 2-6 张均可（普通滤纸也可）和 1 张硝酸纤维素滤膜，其大小能够覆盖你的所有样品即可，不必与凝胶大小完全吻合。大量实践证明，不会造成电流短路而使蛋白质不能从凝胶向滤膜转移。用铅笔在滤膜一角作好标记。拿取凝胶、滤纸和硝酸纤维素滤膜时必须戴手套或用镊子夹取，最好是专用平头镊。因为皮肤上的油脂和分泌物会阻止蛋白质从凝胶向滤膜转移。3）戴上手套按如下顺序安装转移装置：a.平放底部电极（阴极），放一张海绵垫片。b.在海绵垫片上放置 1-3 张用转移缓冲液浸泡过的滤纸，逐张叠放，对齐，然后用一玻璃棒作滚筒

31、以挤出所有气泡，必要时可滴加转膜液润湿。d.取出浸在转膜液中的凝胶平放于滤纸上。排除所有气泡。c.把硝酸纤维素滤膜放在聚丙烯酰胺凝胶上，在硝酸纤维素滤膜与聚丙烯酰胺凝胶之间不留有气泡。e. 把最后 1-3 张滤纸放在硝酸纤维素滤膜上方，同样须确保不留气泡。其实，用玻棒给点压力很容易排除气泡。f.放上另一张或几张海绵垫片，盖上阳极板，夹紧。保证对凝胶有一定的压力。4）连接电源。我做 90KD 的蛋白，电转移 100 分钟，电压 100v。（也可以过夜，（也可以过夜，40V40V 电压）电压）电转过程中，尽量给个低温环境，我放在冰水里转膜，也用内置的冰盒。5）断开电源，拆卸转移装置，逐一掀去各层。

32、将凝胶转移至盛有考马斯亮蓝染液的托盘中，进行染色，可检查蛋白质转移是否完全。要观察膜上蛋白的情况可在丽春红中染色 3-10 分钟，然后蒸馏水冲洗6）切去滤膜的左下角，以标记，如有预染 MARKER 也可不标，心里有数即可。看完丽春红染色效果，如果条带清晰可见，分得比较开，看上去也比较漂亮，也就是比较直，拖尾不明显，就可以开始下一步的工作了。如果看上去不是很爽，条带里有白点（气泡所致）或是像流水样漂移，或是其他不同于正常的现象建议赶紧停止，从头来过。否则下面的步骤浪费人力和抗体试剂，关键还会打击自信。侥幸心理只会带来更大的失望。杂交与显色：讲现在用的比较多的 ECL 发光。1）封闭：NC 膜置含

33、 5-15%（我都是试过差别不大，正常 10%左右即可不必教条，背景浓的时候，我还会加点 BSA 或提高 TWEEN20的浓度，有时候效果不错）脱脂奶粉的 TBST 中，室温平缓摇动温育 1h，4过夜，再于室温温育 1h 后，用 TBST 漂洗一下，再晃洗 3-5 分钟。2）一抗孵育：分别与相应的抗体（初次做建议按照试剂要求的最高浓度开始，别舍不得，否则没结果更难受），及内参照抗体（-actin 抗体 1:10 000，这蛋白抗体效价特别高，所以预实验做一下一般会有阳性结果，一旦没条带可以排除你的实验操作中的因素）于室温温育 90min，4过夜，再次室温温育 60min。抗体稀释液为 TBST

34、（内含 1%的 BSA）（其实直接室温 2h 就够了，背景老是太高放 4 度过夜有时候对降低背景效果不错）。3）漂洗：室温下以 TBST 液在平缓摇动条件下漂洗 3 次以上，每次各 5min。勤换液比延长漂洗时间更有效。4）与二抗孵育：与辣根过化物酶标记的二抗（内含 1% BSA 的 TBST 稀释）在室温下温育 90min。没啥说的，时间不要太长，太长背景会高。5）漂洗：室温下以 TBST 液在平缓摇动条件下漂洗 5 次以上，每次各 5min。勤换液比延长漂洗时间更有效。6）ECL 显像：根据膜得大小，将ECL 试剂盒中的 A 液、B 液以等体积混合，直接加到NC 膜上，只要能覆盖到整个膜就

35、可以多了是浪费。1min 后将 ECL 液用吸水纸吸干，放入暗盒，加盖一层透明薄膜（保鲜袋或一次性手套都可，透明的别搞错了！）（这之前都可以在可见光下操作）。暗室中曝光，首先曝光约 1min，然后根据 X 光片的曝光效果，立即不断调整曝光时间，直到合适为止。当然显影时间控制也很重要，主要都是和背景有关。看看如有必要后面专述，这里不罗嗦。7）显影定影完毕，要用自来水冲干净胶片，不划伤，晾干冲干净胶片，不划伤，晾干以后再收藏，很重要！否则粘糊糊的，很容易把你本来漂亮的条带给破坏了，这里出岔子就功亏一篑了！8）开始欣赏、研究、分析Western BlotWestern Blot 之之 Trouble

36、 ShootingTrouble Shooting！（指湿式转膜和（指湿式转膜和 NCNC 膜！绝对原创！）膜！绝对原创！）1、凝胶肿胀或卷曲：注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡 5-10 分钟，要含有 20%的甲醇。2、条带歪斜、或漂移因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，形成如图所示的形状。使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常的漂亮。另外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现

37、上述情况。3、单个或多个白点转膜时在膜与胶之间有气泡。做三明治时一定要逐层压紧，赶尽气泡。同时转膜液要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜，降低转膜效率。4、转膜缓冲液过热：缓冲液离子强度太低，或电压及电流过高。按照上述方式配液，同时转膜过程中注意降温。我在冰水混合物中转膜，效果很好。5 背景过高！1）封闭不全，我用 5%-10%的光明脱脂奶粉，效果还可以，现在做基本上没什么背景。如果你觉得不够可以加点 BSA,1%吧。2）一抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应。这种情况通常可以通过加入 TWEEN-20 或多次洗膜加以解决。如果问题不能解决，那么降低一抗浓

38、度，或更换封闭液种类可能解决3）一抗二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到这种情况。那么可以适当降低一抗二抗的浓度，或是用提高温度的方式来代替杂交时间的延长；另外，少量多次得洗膜效果要优于多量而长时间得洗膜效果。5)曝光时间的控制。通常我们线曝光一分钟试试，条带清晰背景也强，可以缩短曝光时间，或者过一段时间等荧光减弱以后再发光，一般也可以发出比较好的条带。如果背景强于条带，那么肯定是前面默默个原因的一种，这是可以将膜在TBST 中漂洗以下再发光，有时会有比较好的效果（仅限于国外较好的试剂盒，国产的不行，洗一下啥也没了！）这个时候可以洗膜，洗膜后重新发光。

39、6、没有信号1)用单抗时比较容易出现这种情况。因为单抗主要是针对天然蛋白，这个时候.TWEEN-20 的作用就显现出来了，它可以增加抗原抗体复合物与膜的结合。2)确信你的蛋白表达3)确信蛋白高效的转移到你的膜上4)一抗二抗的效价问题。无论哪个无效都不能发光，因此预实验一定要从最低的稀释度开始，以排除抗体的因素5)ECL 试剂盒质量的问题，不可小觑。偶亲身经历。碰到一批次品。两个月白搭！7、微量进样器堵了怎么办？首先从预防入手，每次用后的进样器及时用蒸馏水清洗！如果堵了，不要紧，有办法：可以用如下办法解决：1，首先反复推拉上样针，看是否可将堵塞物吹出来；2，方法 1 不灵，若是 25 或 50u

40、l 的针，把针从后侧拔出，然后重新插入，使其内部产生气压，可能压出堵塞物质；3，如上述方法不灵可以在拔出后注入些清水，然后重新插入，用水压排出，4，最后的方法，最灵的方法：开始步骤同第3 种方法中，在加入水后，将上样器的前端针部放在酒精灯上煅烧至红色（估计在什么位置堵的），注意 烧红部分不要距离玻璃过近，然后，趁热突然推 针，将水强行推出，通道打开后，再通过稀酸或稀碱冲洗即可！5，或者放在超声清洗仪里，超声试试注意，切记在推拉过程中小心不要把针弄弯8、关于 SDS 蛋白电泳的一点心得最近在做蛋白电泳时候遇到了些麻烦，在这里发了帖子，并且得到了很多同人的恢复。本人在看过回帖后，结合自己的试验，重

41、新设计了方案，得到了满意的结果，同时感觉有必要拿来和大家分享：1，蛋白电泳中出现的纵向条带：原因主要是由于电泳样品或是电极缓冲液中有没有溶解的样品颗粒所致，上样前充分将样品离心，或重新使用新配电极缓冲液即可解决。2，电泳条带前沿在染色脱色后呈尖形。原因是由于上样量大且工作电压过大引起，我实验中采用 90/120，后来改用了 80 并且不换电压；同时减少上样量到原来的一半，得到了满意的结果（我的样品分子量 18000 Da，15%的分离胶）；3，电泳结束后，染色脱色结果整个胶面呈现蓝色，背景很重 怎么也脱不去，改用新配的电极缓冲液。问题解决。是电极缓冲液污染的结果（平时本人有个坏毛病：喜欢在缓冲

42、液中涮上样针，导致缓冲液污染 ）。1、做蛋白杂交时转膜后，蛋白 marker 的位置用什么笔标记才能不退色？一般用预染 marker！正常蛋白电泳，转膜，可转到膜上，显示 marker 的位置！没有预染，用铅笔标记也可以2、很多实验室用的是 PVDF 膜，使用时用纯的甲醇浸泡 1030 分钟，我们实验室用的是 NC 膜，是否也需要浸泡？这两种膜有什么区别？ pvdf 膜用于蛋白质转移，可用用于测序的转于！ NC 膜不能用甲醇浸泡，因为 NC 膜碰到甲醇即会变形，做蛋白杂交时候背景比较高。PVDF 膜可用来做蛋白杂交用,也可以用来测序.是目前最好的做蛋白杂交膜.用前要用甲醇处理.也可以用来做核酸

43、杂交,效果我感觉很好,但是要用甲醇处理,你要记住,一旦膜干了,要做杂交或别地用途,要先用甲醇处理的,不然是不会湿.三种膜的主要区别:1)简 介尼龙膜较理想的核酸固相支持物，有多种类型硝酸纤维素膜目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜PVDF 膜介于二者之间2)结合能力尼龙膜结合 DNA 和 RNA 能力可达 480600ug/cm2,可结合短至 10bp 的核酸片段硝酸纤维素膜结合 DNA 和 RNA 能力可达 80100ug/cm2,对于 200bp 的核酸片段结合能力不强PVDF 膜结合 DNA 和 RNA 能力可达 125300ug/cm23)温度适应性尼龙膜 经烘烤或紫外线照射后，核

44、酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合 DNA，结合不牢固PVDF 膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹4)韧性尼龙膜较强硝酸纤维素膜 较脆，易破碎PVDF 膜较强5)重复性尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来硝酸纤维素膜 不能重复使用PVDF 膜 可以重复使用3、现在我们做 western 每次只加一种一抗，请教有人同时加两种或者多种一抗的吗？（土人：）最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。我看别人做 Western 在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL 显色

45、、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL 显色、压片、洗片。你是否可以参照一下这种做法呢？另外，我自己曾经做过 Western 在同一张膜上检测两种蛋白。因为这两种目的蛋白的分子量相差较远，我就转完膜后，一边给Marker 染色，一边封闭。在上一抗之前，根据 Marker 的条带把膜水平剪开，分子量小的目的蛋白在下面半张，大的在上面半张。然后分别上一抗、二抗，检测。我认为这种方法很好，不知对你是否有用？（Huolj8 ）我做过加两种抗体的，效果还可以，我做的分子量相差 15KD。应该影响不大。4、我做 western，在分子量很低的位置总是出现一条很强的带（通常比我要的带强），不

46、知道为什么？是我的蛋白降解了吗？你应该同时跑一个电泳，如果你的样品不多，可在同一块胶上跑，切下来即可。这样你就可以知道，是你这次电泳的问题还是只是你的 western 的问题了。我想问你在你的只染色的胶上也有那条非特异性的带吗？如果有那就是你的样品问题，如果没有那就是你 western 的问题，应该找相应的原因，比如转膜过程，抗体等等。而且你分析过你的样品降解会变成什么吗？是在你出现非特异性的带的位置能出现的吗？5、请问分子量为 41KD 和 57KD 作 WESTERN 时,可以分开切胶吗?分别用多大电流转膜?转多长时间?（winnerman ）理论上分的开！蛋白 Marker 分子量分别为

47、 97kd、66kd、45kd、30kd、21kd、14kd ！跑蛋白时，分离的效果都比较好！分子量为 41KD 和 57KD 的蛋白分子量相差 16KD！蛋白 Marker 的 45kd、30kd，蛋白分子量相差 15KD，分离效果很明显。应该可以分开切胶！分别用多大电流转膜?一、一般跟你的分离胶的浓度有关。二、与你的转印系统型号有关！三、与目的蛋白的分子量有关 1一般 50KD 左右的蛋白，50mA，1.5h；（zrzhong6519 ）41KD 和 57KD 作 WESTERN 时,可以分开，但可以转到一张膜上，不别切胶，需两次反应，具体方法园内 search。转膜与所用仪器、转移缓冲液

48、使用次数以及蛋白分子量有关，我用的是 bio-rad，一般 350mA ，1h。6、好几个蛋白，我做免疫荧光都做得很好，抗体说明也是可以用于 western 的，可是就做不出来！显影后只有很弱的非特异带。而另一个蛋白，perk 却做得很好，操作都是一样的，抗体稀释也是按厂家说明的。（Frederic）你用的是单克隆抗体吗？如果是的话，请注意western 是在蛋白质变性的条件下进行的，活性状态下可以反映的抗体在变形状态下却不一定特异性很强，可能其他的蛋白质变性之后产生了能与之反映的抗原决定簇！另外，要做好对照！抗体是什么公司的？有的公司会将康体稀释后再卖（奸商），所以抗体的滴度，根据公司的要求

49、也不一定准！（土豆） 如果是单抗， western blotting 电泳后蛋白变性， 构象表位可能消失， 仅存在线性表位， 单抗可能不识别。 所以 WESTERNBLOTTING 做不出来了。7、我的 WESTERN 为什么出现了多条带，每个加样槽中 都出现了多条带，而且好象都很有 规律，为什么？是封闭时间不够吗，请指教我做 WESTERN 是想知道处理后细胞分泌细胞因子数量的变化，这样必须要内参吗？（drake015） 可能性1、一抗、或二抗抗体浓度太高2、多克隆抗体本身的非特异性反应3、抗体的特异性不强4、蛋白异构体或降解！5、你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这

50、样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化。所以严格意义上说，内参事必须做的。8）转膜的时候，最下端的蛋白条带很清楚，可是上边啥都没有看见，社么原因？1、可能是时间不够，因为一般是分子量小的先转上去的，大的后转，看你的目的蛋白了，如小的话，最后不要太长时间2、转膜的时间要根据你的目标蛋白大小和胶浓度而定。蛋白越大、胶浓度越高，时间就要越长。经验是：1218的胶、418kD 的蛋白用 100v 衡压/350mA 衡流 7590min 的条件都可以成功转膜3、主要是转膜时间不够，若想证明这个问题，可把原来的 SDS-PAGE，做一下染色，看看大分