血源乙型肝炎疫苗制造及检定规程.doc

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1、血源乙型肝炎疫苗制造及检定规程血源乙型肝炎疫苗制造及检定规程本品系由无症状 HBsAg 携带者血浆提取的 HBsAg，经纯化、灭活及加佐剂吸附后制成。用于预防乙型肝炎。1 1 血源血源1.1 对献血员的要求1.1.1 献血员应为 2050 岁无症状 HBsAg 携带者，其肝功能应无显着异常，并稳定。对献血员的其他要求按原料血浆采集（单采血浆术）规程执行。1.1.2 个月接种过活疫苗，1 年内接种过狂犬病疫苗者，均不采血。1.1.3 必要时以免疫扩散法（ID）测定 HBsAg 亚型。血源应以 ad 亚型为主，可有少量 ay 亚型。1.2 单份血浆检查1.2.1 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行

2、。1.2.2HbsAg 测定用对流电泳法测定，HBsAg 滴度应18，或用反向血凝法（RPHA）测定，滴度应11024。1.3 混合血浆检查1.3.1 支原体检查按生物制品无菌试验规程进行。1.3.2 取样接种孔雀绿培养基，3537培养 28 天，结果应为阴性。1.3.3 外源病毒检查用 Vero 细胞和人二倍体细胞各 3 瓶，每瓶容量为1015ml，各接种 0.2ml 样品，3537培养 10 天，应无病变出现。用 0.2%0.5%鸡与豚鼠红细胞等量混合后于 37吸附 1小时，测定血吸附反应，应均为阴性。2 2 抗原的浓缩和变化抗原的浓缩和变化2.1 血浆脱纤维于血浆中加入氯化钙溶液，使之脱

3、纤维。2.2 硫酸铵沉淀于血清中加入硫酸铵饱和溶液，或用固体硫酸铵，使最后达到适宜的饱和度，沉淀 HBsA.2.3 超离心纯化溴化钾等密度区带离心 23 次，每次离心后分部收样，根据紫外监测峰及密度测定，合并合格的样品，经超滤去盐浓缩。蔗糖速率区带离心 12 次，分离出 HBsAg。3 3 灭活灭活3.1 胃酶处理将 HBsAg 悬液加入适量胃酶，置 3537处理 45 小时，最后超滤去胃酶。3.2 尿素处理于 HBsAg 悬液中加尿素至 48mol/L 置 37处理 45 小时，超滤去尿素。亦可不用尿素处理。3.3 福尔马林灭活于 HBsAg 悬液中按 14000 加入福尔马林，置 3772

4、96小时。不用尿素处理者可用 12000 福尔马林灭活。4 4 稀释与吸附稀释与吸附已灭活的疫苗原液经除菌过滤后，根据 Lowry 法检测折算的特异性蛋白含量进行稀释，加入 A1（OH）3吸附，并于疫苗内加入防腐剂。5 5 半成品检定半成品检定5.1 总蛋白含量测定用 Lowry 法测定，使用检定所提供的标准品。5.2HBsAg 含量测定按总蛋白含量将样品稀释至不同稀释度，用 RIA 或火箭电泳法测定，使用检定所提供的标准品，HBsAg 含量应在 90%以上。5.3 电镜检查取每台离心机每次蔗糖离心后的样品，制作 5 个铜网，在60000 倍电镜下，每个铜网观察 6 个视野，结果应主要为 22

5、nm球形颗粒，未见 Dane 颗粒为合格。有可疑 Dane 颗粒者应以加倍视野数检查。5.4 残留杂蛋白检查5.4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳法浓缩胶浓度为 4%，分离胶为 7.5%，加 10gHBsAg 样品和适量的人血清白蛋白进行电泳，银染，试验样品应不出现明显杂蛋白带。5.4.2SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法HBsAg 样品经 SDS 处理后在 7.0%浓缩胶和 15%分离胶中加入 5g 进行电泳，结果在分离胶中应主要存在 22000 及 28000分子量带，应不出现明显的杂蛋白带。5.5HBV DNA 检查用 HBv DNA 片段制备探针，取 200g 除菌后的样品与探针进行杂交，结果应为阴

6、性。控针的灵敏度应1pg。5.6 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。6 6 分装分装每支安瓿分装 1.0ml，HBsAg 含量分别为 10g 和 30g 两种规程。7 7 成品检定成品检定7.1 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。7.2 安全试验每亚批疫苗皮下注射体重 1416g 小白鼠，每只 0.5ml，注射后第 3 天和第 7 天各观察一次，允许皮下有硬结，但应健存。7.3 化学检定按生物制品化学规定规程进行。7.3.1pH 值测定应为 5.56.8。7.3.2 游离甲醛测定应含游离甲醛，但含量应0.01%。7.3.3 氢氧化铝含量测定每 ml 应不超过 1.25mg。7.3.4 氯化

7、钠含量测定应为 0.80.95%。7.3.5 硫柳汞含量测定不应超过 0.01%。7.4 效力和鉴别试验将疫苗 4 倍递增稀释，每个稀释度接种 BALB/cH2d 或 NIHq型雌性小白鼠 20 只，每只腹腔注射 1.0ml，46 周后采血，以RIA 法测定抗-HBs，计算小白鼠 ED50 值与参比苗 ED50 值，结果以检品 ED50 值/参比 ED50 值，其比值1 为合格。7.5 抗-HBc 检测每批用 6 只体重为 300350g 同性豚鼠，每只腹部皮下注射疫苗 0.5ml，间隔一个月免疫第 2 次，之后一个月心脏采血，用 RIA 法检测免疫前后血清，结果抗-HBc 应阴性，否则应重试。7.6 人体免疫观察及标准每年度生产的头 3 批疫苗或前、中、后各一批疫苗进行人体免疫观察，观察对象为小学生或学龄前儿童，按 0、1、2 个月程序每批至少接种 20 人，每人于上臂三角肌肌内注射1.0ml，于 3 针接种后一个月采血，用 RIA 法测定三项指标，抗-HBs 阳性率（S/N10）大于 90%，6 个月内未出现 HBsAg 者判为合格，否则需要重试。对免疫后单独出现高滴度抗-HBc 者应分析原因。8 8 保存与效期保存与效期保存于 28暗处，不得冻结。自检定合格之日起效期为2 年。