固定化酶研究进展.doc

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1、 Chemistry & Bioengineering 2006, Vol. 23 No. 2 7 固定化酶研究进展 陈建龙 , 祁建城 , 曹仪植 , 郭 勇 , 段惠丽 摘 ( 1. 军事医学科学院卫生装备研究所国家生物防护装备工程技术研究中心 , 天津 300161; 2. 兰州大学生命科学学院 , 甘肃 兰州 730000) 要 : 固定化酶有许多优点 , 尤其是稳定性和可重复使用性使其在许多领域得到广泛应用 。 固定化 酶技术是一 门 交叉 学科技术 , 目前已得到长足的发展 。 介绍了固 定化酶制备的传 统方法以及一些新方法 , 同时对酶在一 些性能优良 的 载体上的固定进行了综述

2、 。 关键词 : 固定化酶 ; 制备 ; 载体 中图分类号 : Q 814 文 献标识码 : A 文章编号 : 1672- 5425( 2006) 02- 0007- 03 酶的化学本质是蛋白质 , 其催化作 用具有高选择 性、高催化活性、反 应条件温和、环保无污染 等特点。 但游离状态的酶对热、强酸、强碱、高离子强度、有机溶 剂等稳定性较差 , 易失活 , 并且反应后混入催化产物等 物质 , 纯化困难 , 不能重复使用。为了克服这些问题 , 酶固定化技术于 20 世纪 60 年代应运而 生并发展起 来。它是模拟体内酶的作用方式 ( 体内酶多与膜类物 质相结合并进行特有的催化反应 ) , 通过

3、化学或物理的 手段 , 用载体将酶束缚或限制在一定的区域内 , 使酶分 子在此区域进行特有和活跃的催化作用 , 并可回收及 长时间重复使用的一 种交叉学科技术。目前 , 对固定 化酶方面的研究已得到了长足的发展 , 在理论研究和 应用研究方面取得了许多重要成果。 1 传统的酶固定化方法 传统的酶固定化方法大致可分为 4 类 : 吸附法 、 交联法 、包埋法 、共价结合法 。 吸附法是最早出现的酶固定化方法 , 包括物理吸 附和离子交换吸附。该法条件温和 , 酶的构象变化较 小或基本不变 , 因此对酶的催化活性影响小 , 但酶和载 体之间结合力 弱 , 在不适 pH 、高盐浓 度、高温等条件 下

4、 , 酶易从载体脱落并污染催化反应产物等。 交联法是利用双功能 或多功能交联试剂 , 在酶分 子和交联试剂之间形成共价键 , 采用不同的交联条件 和在交联体系中添加不同的材料 , 可以产生物理性质 各异的固定化酶。交联法一般作为其它固定化方法的 辅助手段 。 包埋法的基本原理是载体与酶溶液混合后 , 借助 收稿日期 : 2005- 11- 20 引发剂进行聚合反应 , 通过物理作用将酶限定在载体 的网格中 , 从而实现酶固定化的方法。该法不涉及酶 的构象及酶分子的化学变化 , 反应条件温和 , 因而酶活 力回收率较高。包埋法固定化酶易漏失 , 常存在扩散 限制等问题 , 催化反应受传质阻力的影

5、响 , 不宜催化大 分子底物的反应。 载体偶联法是指酶分子的非必须基团与载体表面 的活性功能基团通过形成化学共价健实现不可逆结合 的酶固定方法 , 又称共价结合法。载体偶联法所得的固 定化酶与载体连接牢固 , 有良好的稳定性及重复使用性 , 成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。但该法较 其它固定方法反应剧烈 , 固定化酶活性损失更加严重。 2 新型酶固定化方法 开发新型酶固定化方法的原则是 : 实现在较为温 和的条件下进行酶的固定化 , 尽量减少或避免酶活力 的损 失。通过辐射、光、等离子体、电子等新方法均可 制备高活性固定化酶。 M ohy 等 以 Cs 为辐射源 , 通过 射线引发将甲

6、基丙 烯酸甲酯接枝共聚于尼龙 膜表面 , 经进一步活化 , 用于青霉素酰化酶的固定。光 偶联法是以光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏 性基团的载体共价固定化酶 , 由于条件温和 , 可获得酶 活力较高的固定化酶。 L i 等 利用含芳香叠氮基的 光活性酯 , 在远紫外光辐照下 , 叠氮基光解生成氮烯与 PES 膜表面的 C- H 键间发生插入反应形成仲胺 , 将 脲酶共价键合到 PES 膜的表面。等离子体是高度激 发的原子、分子、离子以及自由基的聚集体 , 大量的等 离子体常在室温下存在。载体材料表面可以由等离子 作者简介 : 陈建龙 ( 1977- ) , 男 , 甘肃 陇西 人 , 硕士

7、 研究 生 , 主要 从 事酶 固定 化方 面的 应用 研究 ; 通 讯联 系人 : 祁 建城 。 电话 : 022 84657488, E mail: chenj20008 163. com。 化 学 与 生 物 工 程 1, 2 1 2 1 1 1 2 3 4 5 8 陈建龙等 : 固定化酶研究进展 / 2006 年第 2 期 体进行有用修饰 8, 9 ,从而引入活性基团。 P uleo 等 用于葡糖生物 传感器 的高 活性和 高稳定 性的酶 膜。 18 将钛合金T i 6A l 4V 表面用丙烯酸胺等离子体处理引 入氨基 , 然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面 , 或者 Y akup 等

8、 丁烯 酸 酯 - 以聚乙烯亚胺 ( PEI) 接枝改性的羟乙基异 缩 水 甘 油 基 异 丁 烯 酸 酯 ( H EM A co 将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理 , 再用含 碳硝化甘油接枝 , 进而将溶菌酶和骨形态蛋白进行固 定 , 实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化。 3 酶的定向固定化及多酶共固技术 传统的酶固定化方法的缺点是酶在任意位点与载 体进行连接 , 使酶活性位点不能充分暴露 , 而且酶的固 定化量降低 , 因此定向固定化酶技术将成为今后固 定化酶研究的热点。为了消除因扩散而导致的胰凝乳 蛋白酶对蛋白 水解的动力学限制 , B lkov 等 将胰 凝乳蛋白酶通过适当的

9、多克隆抗体固定在无孔羟烷基 异丁酸酯的改良微球上。 Zuzana 等 用高碘酸钠活 化半乳糖氧化酶的糖链 , 并通过活化的糖链将半乳糖 氧化酶定向固定。由于大分子底物容易接近酶的活性 位点 , 因 而催化动力学参数得到了改善。 为了充分发挥不同酶的各自优势 , 把不同来源的 酶与整个细胞的生物催化性能相结合 , 实现多酶共固 或整个细胞的固定化 , 也日益受到研究者的重视。 P al 等 将 葡萄糖苷酶和葡萄糖氧化酶固定于乳胶膜 , 并将此膜用作生态友 好酶乳胶膜反应器。 A t ia 用 聚乙烯亚胺的氨基彻底覆盖多孔乙醛酸琼脂表面的醛 基 , 并以此为载体进行环己酮单加氧酶 ( CH M O

10、 ) 和葡 萄糖 6 磷酸脱氢酶 ( G 6 P DH ) 共价共固的研究。 4 改性载体及新型载体固定化酶 载 体对固定化酶有较大影响 , 要制得理想的固定化 酶 , 既要选用合理有效的固定化方法 , 同时又要有良好 的载体。理想的载体要具备良好的机械强度、高结合能 力、物理和化学稳定性及抗微生物降解性等特性。利用 性能优良的天然载体 , 或借助现代技术对传统载体进行 改性及合成新型载体材料等可以改进酶的固定化技术。 4. 1 改性载体固定化酶 载体改性的实质是通过表面涂层或表面吸附等物 理方法以及接枝、聚合等化学方法实现载体表面物理 性质或化学结构的改变。 Dso uza 等 将稻壳用聚乙

11、 烯涂层 , 然后将转化酶吸附于 载体并用 2% 戊二醛进 行交联 , 固定化酶被重新用蔗糖水解 , 未见活性损失。 改变膜材料的电性 , 使酶通过电荷相互作用固定于膜 材料表面是一种简 单的酶固定化方法。 T ro ng 等 将阳离子亲水性聚乙烯亚胺作为酶固定媒介吸附在带 负电荷的膜材料表面 , 使膜材料电性发生改变 , 得到了 GM A ) 聚合膜为载体吸附固定葡糖氧化酶 , 该载体有 许多优点 : 反应膜的制备不需要任何活化步骤 , 无需毒 性物质对其进行表面修 饰 ; 可实现温和条件下的酶固 定化 ; 酶载体可重复使用。 4. 2 新型载体固定化酶 新型载体既包括天然的有机或无机材料以

12、及经过 改性的传统材料 , 也包括高分子合成材料及高分子复合 物等。 K ong 等 以由海洋细菌 Zoogloea sp. 产生的细 胞结合多糖 ( CBP) 凝胶珠为载体固定葡糖淀粉酶。 A y ako 等 将溶菌酶通过二硫键或硫醚键固定在角蛋白 海绵上 , 角蛋白海绵可控制固定化生物分子释放。 Mar t a 等 对溶菌酶和 L 树胶醛呋喃糖苷酶在分级双峰 多孔硅石和有机硅石上 的固定化进行研究 , 结果表明双 峰 U V M 7 硅石对溶菌酶吸附快、载酶量高 , 其固定化 酶最适 pH 值降低而最适反应温度升高 , 且对葡萄糖和 乙醇浓度的抗性升高。甲基纤维素 醋酸 琥珀酰羟 丙酯聚合

13、物是一种 pH 依赖型载体 , 在 pH 4 5 以下不 溶 , 而在 pH5. 5 以上呈可溶状态。 Chen 等 将溶菌酶 共价固定于该聚合载体 , 所得固定化酶激活能量比游离 酶低 , 热稳定性及 催化反应稳定性 较游离酶高。 Xue 等 合成了一种具有长程有序结构、窄孔径范围、较大 表面积及表面具 有高浓度弱酸性硅烷 醇基的分子筛 MCM 48 以及分子筛 Co MCM 48( MCM 48 网格中钴 的存在使分子筛表面弱酸性位点数目增加 ) 。智能聚合 物 Eudragit L 100 是一种甲基丙烯酸与甲基异丁酸酯 的共聚物 , 具有强吸附能力 , 且对 pH 敏感 , 是酶固定的

14、 良好载体。两种或多种不同性质的高分子体系聚集而 成的一些特殊功能的高分子复合物 , 因其优良的传质 性能、电解质的灵敏介电特性以及良好的生物相容性 等特点 , 也成为固定化酶良好的新型载体 , 在酶固定化 领域显示了广阔的应用前景。 5 展望 目前 , 固定化酶技术已成为酶工程研究的重点和 热点之一。研究探索新的酶固定化技术 ( 如流体聚合 包埋技术、纳米粒子原位共聚包埋等 ) 、提高固定化酶 活性收率、延长半衰期、降低成本将成为固定化酶研究 领域的主要研究内容。充分利用具有适宜生物相容性 及亲水性的天然载体、运用当代高新技术对天然载体 修饰改性以及开发合成性能优良的新的酶固定化载体 材料、

15、研究高分子材料与特定无机材料的复合材料以 10 11 12 13 14 15 16 17 陈建龙等 : 固定化酶研究进展 / 2006 年第 2 期 9 及合成酶固定化智能载体材料等将是固定化酶载体材 料今后发展与应用的方向。 参考文献 : 1 Allal B, Jacques F, Jacques L, et al. Ads or ption of su ccinylated lysozyme on h ydroxyapatite J . J ou rnal of Colloid Interface Sci ence, 1997, 189: 37 42. 2 Qu inn Z, Zh ou

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31、 , CAO Yi zhi , GUO Yong , DUAN Hui li ( 1. I nst it ut e of M edi cal Equip ment , A cademy of M i li tary Med ical S ciences, N at ional E ngi neer ing R esear ch Center f or Bi ol ogi cal Pr ot ect i ve Equi p m ent , T i anj i n 300161, China; 2. S chool of L if e Sci ence, L anz hou Uni versi t

32、y , L anz hou 730000, Chi na) Abstract: free enzyme, T he im mobilized enzymes have been w idely applied in many fields f or t heir m ore advantag es t han especial ly f or t heir st abilit y and reusabilit y. A t present , im mobilization t echnolog ies of enzy me have obt ained w onderf ul develop

33、ment . T he research o f imm obilized enzym e w ill be a v ery im po rt ant develop m ent f ield in t he enzym e eng ineering in t he f ut ure. In t his art icle, various convent ional and new met hods fo r prepar at ion of immo bilized enzym e ar e int roduced. A t t he same t im e, t he imm obilizat ion of enzy me on so me carriers w ith ex cellent pro pert ies are review ed. Keywords: imm obilized enzyme; prepar at ion; carrier