蛋白质含量测定方法.doc

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1、第 27 卷第 2 期 明 胶 科 学 与 技 术 Vol. 27. No. 2 2007 年 6 月 The Science and Technology of Gelatin Jun. 2007. 蛋 白 质 含 量 测 定 方 法 杨玉芳 青海明杏生物工程有限公司 , 青海 西宁 810015 摘要 : 蛋白质与 生命的起源、存在和进化都密 切相关 , 蛋白质测定涉及到生产和科研的众多 领域。本实验用定氮法、紫外吸收法、双缩脲 法、考马斯亮蓝法分别对牛奶、酸奶、豆浆进行 蛋白质含量的测定。依此分析比较各种测定 蛋白质的方法 , 总结出各方法的特点及适用条 件。 关键词 : 定氮法 ; 紫

2、外吸收法 ; 双缩脲法 ; 考马 斯亮蓝法 ; 蛋白质 ; 测定 蛋白质含量测定法 , 是生物化学研究中最 常用、最基本的分析方法之一 。目前常用的 有这几种古老的经典方法 , 即定氮法、双缩脲 法 ( Biuret 法 ) 和紫外吸收法。另外 , 还有一种 近十年才普遍使用起来的新的测定法 , 即考马 斯亮蓝法 ( Bradford 法 ) 。其中 , Bradford 法灵 敏度最高 , 比紫 外吸收法 灵敏 10 20 倍 , 比 Biuret 法灵敏 100 倍以上。定氮法虽然比较复 杂 , 但较准确 , 往往以定氮法测定的蛋白质作 为其他方法的标准蛋白质。这后 3 种方法并 不能在任

3、何条件下适用于任何形式的蛋白质 , 因为一种蛋白质溶液用这 4 种方法测定 , 有可 能得出 4 种不同的结果。每种测定法都不是 完美无缺的 , 都有其优缺点 。在选择方法时 应考虑 : ( 1) 实验对测定所要求的灵敏度和精 确度 ; ( 2) 蛋白质的性质 ; ( 3) 溶液中存在的干 扰物质 ; ( 4) 测定所要花费的时间。本实验分 别用以上 4 种方法对牛奶、酸奶、豆浆进行蛋 白质浓度的测定 , 通过对实验的过程和结果的 分析来总结这几种方法的适用范围及实用性。 通过分析表明 , 针对不同的待测样品以及对测 定结果准确性的要求不同 , 我们可以采用不同 的方法来测定样品中蛋白质的含量

4、。 1 材料与方法 1. 1 仪器材料 ( 1) 仪器 : 凯氏定氮仪、紫外分光光度计、 可见光分光光度计 、工作离心机、布氏漏斗、抽 滤泵。 ( 2) 试剂及原材料 : 牛奶、酸奶、豆浆、 0. 12 mol L pH= 4. 7 醋酸 - 醋酸钠缓冲液、乙醇 - 乙醚等体积混合液、浓 H2 SO4 、 40% 氢氧化钠、 30% 过氧化氢、 2% 硼酸溶液、 0. 050mol L 标准 盐酸溶液、硫酸钾 - 硫酸铜接触剂、混合指示 剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝 G - 250 试剂。 1. 2 实验方法 ( 1) 凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品与浓硫酸共热 , 含氮有机

5、物即 分解产生氨 ( 消化 ) , 氨又 与硫酸作用 , 变成硫 酸铵。为了加速消化 , 可以加入 CuSO4 作催化 剂和加入 K2SO4 以提高溶 液的沸 点 , 而加入 30% 过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化 好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分 解放出氨 , 借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中 , 然后用标准盐酸溶液进行滴定 , 记录 , 计算出 样品含氮量。每个样品做三次重复测定 , 取平 科普讲座 1 4 3 第 27 卷第 2 期 杨玉芳 : 蛋白质含量测定 方法 99 均值。 ( 2) 紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中 , 酪氨酸、苯丙氨酸和色氨 酸残基的苯环含有共轭双键

6、 , 使蛋白质具有吸 收紫外光的性质 , 吸收峰在 280nm 处 , 其吸光 度 ( 即光密度值 ) 与蛋白质含量成正比。此外 , 蛋白质溶液在 238nm 的光吸收值与肽键含量 成正比。利用一定波长下 , 蛋白质溶液的光吸 收值与蛋白质浓度的正比关系 , 可以进行蛋白 质含量的测定。 紫外吸收法简便 、灵敏、快速 , 不消耗样 品 , 测定后仍能回收使用。低浓度的盐 , 例如 , 生化制备中 常用的 ( NH4 ) 2 SO4 等和大多数缓 冲液不干扰测定 , 特别适用于柱层析洗脱液的 快速连续检测 , 因为此时只需测定蛋白质浓度 的变化 , 而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含

7、量的准确度 较差 , 干扰物质较多 , 在用标准曲线法测定蛋 白质含量时 , 对那些与标准蛋白质中酪氨酸和 色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差 , 故 该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相 似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸 等吸收 紫外光的物质 , 会出现较大的干扰。核 酸的干扰可以通过查校正表 , 再进行计算的方 法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质 和核酸的紫外 吸收是不相同 的 , 虽 然经过校 正 , 测定的结果还是存在一定的误差。 此外 , 进行紫外吸收法测定时 , 由于蛋白 质吸收高峰常因 pH 的改变而有变化 , 因此要 注意溶液的 pH 值 , 测定样品时的 pH

8、 要与测 定标准曲线的 pH 相一致。 取待测样品制成蛋白浓度 大约在 0. 1 1. 0mg mL 的蛋白质溶液 , 用紫外分光光度计 进行比色 , 对照标准曲线得出样品 含氮量。每 个样品做 3 次重复测定 , 取平均值。 ( 3) 双缩脲法测定蛋白质含量 双缩脲 ( NH3 CONHCONH3 ) 是两个分子脲 经 180 左右加热 , 放出一个分子氨后得到的 产物。在强碱性溶液中 , 双缩脲与 CuSO4 形成 紫色络合物 , 称为双缩脲反应。凡具有两个酰 胺基或两个直接连接的肽键 , 或能够以一个中 间碳原子相连的肽键 , 这类化合物都有双缩脲 反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度

9、 成正比 , 而 与蛋白质分子 量及氨基 酸成分无 关 , 故可用来测定蛋白质含量。 此法的优点是测定较快速 , 不同的蛋白质 产生颜色的深浅相近 , 以及干扰物质少 ; 主要 的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需 要快速 , 但并不需要十分精确的蛋白质测定。 取待 测样 品 制 成 蛋 白 浓度 大 约 在 1 10mg mL 的蛋 白质溶 液 , 加 双缩 脲试剂 染色 30min, 用可见光分光光度计进行比色 , 对照标 准曲线得出样品蛋白质含 量。每个样品做 3 100 明 胶 科 学 与 技 术 2007 年 6 月 次重复测定 , 取平均值。 ( 4) 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量

10、 测定未知蛋白质的浓度。 取待测样品加入考马斯亮蓝 G- 250 试剂 由于双 缩脲法 ( Biuret 法 ) 存在 明显的缺 点和许多限制 , 因此 1976 年由 Bradford 建立的 考马斯亮蓝法 ( Bradford 法 ) , 这是根据蛋白质 与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测 定法具有超过其他几种方法的突出优点 , 因而 正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏 度最高的蛋白质测定法。 Bradford 法的突出优点是 : a. 灵敏度高。据估计 , 比 Lowry 法约高 4 倍 , 其最 低蛋白质检测量可达 1mg。这是因为 蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大 , 蛋

11、 白质 - 染料复合物有更高的消光系数 , 因而光 吸收值随蛋白质浓度的变 化比 Lowry 法要大 得多。 b. 测定快速、简便 , 只需加一种试剂。完 成一个样品的测定 , 只需要 5min 左右。由于 染料与蛋白质结合的过程 , 大约只要 2min 即 可完成 , 其颜色可以在 1h 内保持稳定 , 且在 5 20min 之间 , 颜色的稳定 性最好 , 因而完全 不用像 Lowry 法那样费时和严格地控制时间。 c. 干扰物质 少。如 干 扰 Lowry 法的 K 、 + 2+ 放置 5min 后 , 用可见光分光光度计比色 , 对照 标准曲线得出样品蛋白质含量。每个样品做 3 次重复

12、测定 , 取平均值。 2 结果与分析 2. 1 实验结果 表 1 样品蛋白质含量的测定结果 牛奶 酸奶 豆浆 凯氏定氮法 3. 09 2. 13 0. 81 紫外吸收法 - - 2. 88 双缩脲法 3. 16 2. 16 0. 91 考马 斯亮蓝法 3. 11 2. 18 0. 86 2. 2 实验结果分析 ( 1) 凯氏定氮法可测出全部 3 种样品的蛋 白含量 , 测试结果准确 , 只是蒸馏与吸收装置 复杂 , 不便于操作 , 实验过程所需时间较长 , 操 作复杂。 ( 2) 紫外吸收法无法测出牛奶、酸奶的蛋 白含量 , 测出的豆浆蛋白含量也与实际值相差 较大 , 不具实际使用价值。此方法

13、实验过程简 单 , 适用于测试无色样品 , 对于有色样品需进 Na 、 Mg 离子 、 Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、 行预处理 , 排除颜色干扰后才适用于此方法。 巯基乙醇、 EDTA 等均不干扰此测定法。 此法的缺点是 : a. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族 氨基酸的含量不同 , 因此 Bradford 法用于不同 蛋白质测定时有较大的偏差 , 在制作标准曲线 时通常选用 - 球蛋白为标准蛋白质 , 以减少 这方面的偏差。 b. 仍有一些物质干扰此法的测定 , 主要的 干扰物质有 : 去污剂、 Triton X - 100、十二烷基 硫酸钠 ( SDS) 和 0. 1N 的 N a

14、OH。 ( 如同 0. 1N 的酸干扰 Lowry 法一样 ) 。 c. 标准曲线也有轻微的非线性 , 因而不能 用 Beer 定律进行计算 , 而 只能用标准曲线来 ( 3) 双缩脲法适用于被测的 3 种样品 , 实 验操作简便迅速 , 但其缺点是灵敏度较低 , 蛋 白质量须在 1 20mg mL 时测定结果较准确。 因此实验前要估测被测样品的蛋白含量 , 把样 品稀释至蛋白浓度为 1 20mg mL。 ( 4) 考马斯亮蓝染色法可以测出被测的全 部 3 种 样品 , 此方法快速、灵敏 , 但只有作微量 蛋白测定时的结果才准确 , 因此在实验前应将 样品稀释至蛋白浓度为 0. 1 1mg m

15、L, 而且实 验必须在 1h 内完成 , 不然测试结果不准确。 3 结论 4 种蛋白质测定方法比较如附表所示。 + 第 27 卷第 2 期 杨玉芳 : 蛋白质含量测定 方法 附 表 蛋白质测定方法的比较 101 方 法 灵敏度 时 间 原 理 干扰物质 说 明 凯氏定氮法 ( Kjedahl 法 ) 双缩脲法 ( Biuret 法 ) 紫外吸收法 考马斯亮蓝法 灵敏度低 , 适 用于 费 时 , 8 0. 2 1. 0mg 氮 , 10 h。 误差为 ! 2% 。 灵 敏 度 低 , 1 中速 , 20 20mg 30min。 较 为 灵 敏 , 50 快 速 , 5 100 g 10min。

16、 灵敏 度 最 高 , 1 快 速 , 5 将蛋白氮转化为 氨 , 用酸吸收后滴定 。 多肽 键 + 碱性 Cu2+ 紫色络合物。 蛋白 质 中 的酪 氨 酸 和 色 氨 酸 残 基 在 280nm 处的光吸收。 考马 斯 亮 蓝染 料 与 非蛋白 氮 ( 可 用 三 用于标准蛋白质含 氯乙酸沉淀蛋白质 量的 准 确 测 定 ; 干 而分离 ) 。 扰少 ; 费时太长。 硫酸 铵 ; Tris 缓 冲 用于 快 速 测 定 , 但 液 ; 某些氨基 酸 不太 灵 敏 ; 不同 蛋 白质显色相似。 各种 嘌 呤和 嘧 啶 ; 用于层析柱流出液 各种核苷酸。 的检 测 ; 核 酸的 吸 收可以校正

17、。 强碱 性缓冲液 ; Tri 最好 的 方 法 ; 干 扰 ( Bradford 法 ) 5 g 参 考 文 献 15min。 蛋 白 质 结 合 时 , 其 tonX- 100; SDS。 max 由 465nm 变 为 595nm。 99 物质少 ; 颜色稳定 ; 颜色深浅随蛋白质 不同而变化。 1 2 李宁 . 几种蛋白质测定方法的比较 J . 陕 西农业大学学报 2006: 132 134 蔡武成、袁厚积主编 . 生物物质常用化学分 析法 M . 北京 : 化学工业出版社 , 1982: 93 3 4 张龙翔、张庭芳、李令媛等编著 . 生化实验 方法和技术 M . 北 京 : 高等教

18、 育出版社 , 1981 : 164 169 Bradford M. Anal . Biochem. 1976, 72: 248 The Various Methods for Determing Different Proteins Yang Yufang Qinghai Bright Apricot Bio- engineering Co. Ltd. , Xining, Qinghai, China, 810015 Abstract: The proteins are connected with the life origin, the existence and evolution c

19、losely, and the determination of pro tein could serve to the production and the scientific research. The concentrations of protein of milk, yogurt, and soybean milk are determined by the methods of Kjeldahl, UV spectrophotometry, Biuret reaction and Coomassie br illiant blue, and the various methods are compared and summarized from the results in this paper. Keywords: Kjeldahl; UV spectrophotometry; Biuret; Coomassie brilliant blue; Protein; Determination.