纤维素酶的研究进展与发展趋势.doc

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1、微生物学杂志 2008 年 1 月第 28 卷 1 期 JOURNAL OF M ICROBIOLOGY Jan. 2008 V o.l 28 N o. 1 83 纤维素酶的研究进展与发展趋 势 顾方媛 , 陈朝银 1* , 石家骥 2* , 钱世钧 2 ( 1. 昆明理工大学 清华大学生物资源工程开发研究所 , 云南 昆明 650224; 2. 中国科学院 微生物研究所 , 北京 100101) 摘 要 纤维素酶是一类能够水解纤维 素的 D 糖苷键 生成葡 萄糖的 多组分 酶的总称 。 传 统上 将其分 为 3 类 : 内切葡聚糖酶 、 外切葡聚糖酶和 葡萄糖苷酶 。 纤维素 酶属于糖 苷水

2、解酶类 , 近年 来 , 根 据氨基 酸序列的 同源性以 及纤维素酶结构的相 似性 , 将其分成不同的 家族 。 总结 了纤维 素酶近 年来的 主要进展 与研究 趋势 , 包括酶的作用机理 、 基因的表达与调控 、 酶的发酵生产以及在纺织 、 洗涤 、 能源等工业的应用进展 。 关键词 纤维素酶 ; 基因的表达调控 ; 纺 织用酶 ; 生物乙醇 中图分类号 Q 55 文献标识码 A 文章编号 1005- 7021( 2008) 01- 0083- 05 Advances in Cellu lase and Its Developm en t Tenden cy GU F ang yuan ,

3、CH EN Chao yin , SH I Jia ji, Q IAN Sh i jun ( 1. Inst of B iores. R & D, K unm ing Un iv. of Sc i & T echnol. - T singhua Un iv. , Kunm ing 650224; 2. In st. ofM icrobiol. , Ch in ese Acad. of S ci. , Be ijing 100101 ) A bstrac t Ce llulase is a general reference o f enzym es that hydro lyzes D g l

4、ucosid ic linkages in cellulose into g lu cose. T rad itionally it has been div ided into three categor ies: endo g lucanase, ex o glucanase or ce llobiohydro lase, and g lucos idase. Cellu lase be long s to g lycoside hydrolase. A ccord ing to hom o logy of the sequence of am ino ac ids and si ila

5、rity o f the struc ture of ce llu lase, it was recently c lassified into different fam ilies. R ecent m ain advances and study tendency o f ce llulase w ere summ ar ized in this pape, including its function m echan ism, gene expression and regulation, its fe rm entation produc tion, and the applica

6、tions prog resses in tex tile, detergen t and energy sources in dustr ies. K eywords ce llulase; gene express ion and regulation; enzyme for textile use; b io ethano l 纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的 因调控等诸多 方面都取 得显著进 展。到目 前为 生物质 , 也是最廉价的可再生资源。纤维素酶是 止 , 登记在 Sw iss Pro tein 数据库的 纤维素酶 的氨 一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的 基酸序列

7、有 649 条 , 基因序列有 433 条。我国对 总称 , 它们 协同作用 , 分解纤维素产生寡糖和纤维 纤维素酶的研究始于上世纪 50 年代 , 迄今已有 50 二糖 , 最终水解为葡萄糖。自 1906 年 Se illiere 在 多年的历史。在纤维素酶的菌种开发、发酵培养、 蜗牛的消化液中发现纤维素酶至今已有一百余年 基因的克隆与表达 , 以及纤维素酶在纺织、能源等 了 , 随着在工 业上的广 泛应用 , 特别是 在纺织工 方面的应用都取得较大进展 。 年酶工程研究的一个焦点。近年来有关纤维素酶 的基础研究 , 包括酶的氨基酸序列、基因的克隆与 纤维素酶属于糖苷水解酶 , 传统上被分为

8、 3 表达、酶蛋白的空间结构与功能 , 以及酶蛋白的基 类组分 : 内切葡聚糖酶 ( endo 1, 4 D g lucanase, 收稿日期 : 2007- 11 - 14 作者简介 : 顾方媛 女 , 硕士研究生。现从事蛋白质的纯化工作。研究方向为微生物工程与酶工程。 项目来源 : 国家高技术研究发展计划 ( 863 项目 , 2006AA020204 ); 中国科学院微生物研究所领域前沿探索项目 ( O654081001) * 通讯作者 1, 2 1, 2 1 2 2 1, 2 业、能源工业上的应用 , 纤维素酶已成为最近十几 1 纤维素酶的基础研究进展 84 微 生 物 学 杂 志 2

9、8 卷 EG, EC 3. 2. 1. 4) , CMC 酶 ; 外切葡聚糖酶 ( exo 1, 心、作用机制、空间结构以及与传统纤维素酶分类 4 D g lucanase, EC 3. 2. 1. 91) , 即纤维二糖水解 的关系。这种分类法整合了所有的糖苷水解酶类 酶 , CBH; 葡萄糖苷酶 ( 1, 4 D g lucosidase, EC 的蛋白结构、基因序列、酶的来源等信息 , 使用起 3. 2. 1. 21) , 简称 BG。 表 1 纤维素酶家族 Tab le 1 Fam ilies of cellu lases 家族 催化 机制 * * * 空间结构 * * * 备注 来非

10、常方便。 纤维素酶降解纤维素是酶的各组分之间协同 作用的结果 , 目前主要 有 2 种观点 : 一种观点认 为 , 首先由 EG 在纤维素分子内部的无定形区进 行酶切产生新的末端 , 然后由 CBH 以纤维二糖为 单位由末端进行水解 , 每次切下 1 个纤维二糖分 FN A B GH F 5 6 核心 G lu Asp R I ( / nd ) 8 EG II EGIII CBH II 子 , 最后由 BG 将纤维二糖以及短链的纤维寡糖 水解为葡 萄糖。另一种 观 点则 认为 , 首 先是 由 C D E H I J K L 7 8 9 12 26 44 45 48 51 G lu Asp A

11、sp G lu G lu nd Asp G lu G lu R I I R R I I I R ( ( ( ( ( jelly roll / ) 6 / ) 6 jelly roll / ) 8 nd nd / ) 6 / ) 8 EG I CBH ; 真 菌纤维素酶为主 细菌内切酶为主 真菌 EG ; 细菌内切酶 EG III EC3. 2. 1. 78 细菌内切酶为主 EGV 细菌内切酶、 外切酶为主 细菌内切酶为主 CBH 水解不溶性纤维素生成可 溶性的纤维糊精 和纤维二糖 , 然后由 EG 作用于纤维糊精生成纤 维二糖 , 再由 BG 将纤维二糖分解成 2 个葡萄糖。 这种协同作用方式

12、也决定了纤维素酶表达调控的 复杂性。 纤维素酶水解纤维素是通过 2 条立体化学途 径 , 即构型 保留机 制 ( R etent ion M echan ism, R 机 制 ) 和 构型 反 转机 制 ( Inversion M echan ism, I 机 制 ) , 这 2 种机制反映了纤维素链新产生 的还原 端异头碳原子的构型是保留原构型还是将原构型 61 74 1 3 nd Asp G lu Asp nd I R R ( in ferred ) nd 7 fold p ropeller ( / ) 8 nd EG IV 内切酶 ; 微晶纤维素酶 BG II BG I 反转。利用 R

13、机制的酶同时具有转糖苷酶活性 , 而利用 I 机制的酶没有这种活性 。 2 纤维素酶的来源及发酵生产 工业生产的纤维素酶主要由真菌产生 , 如木 注 : * FN: 曾经使用 的分 类名称 ; * * GHF: 糖苷 水解 酶家族 ; 霉 (T richoderma sp. ) 、青霉 ( Penicillium sp. )、曲霉 * * * 酶水解底物时的立体化学机制 : R 构型保留机制 , 转机制 I 构型反 (A sperg illus sp. ) 以及腐 质霉 ( H um icola sp. ) 等。 由于纤维素酶组分中同工酶众多 , 如里氏木 霉 ( T richod erm a

14、 reesei ) 分泌的纤维素酶至少包含 5 个内切 酶 EG I EG II EG III EG IV、 EGV, 2 个外 切酶 CBH I、 CBH II, 以及 2 种 葡萄糖苷酶 BG I BG II 等。传统的以底物特异性为基础对 酶进行 分类 , 不 能 够 反 映这 些 亚 组 分 的 不 同。 因 此 , H enrissat提出按照糖苷酶活性部位氨基酸序列的 相似性作为分类依据 , 用以反映酶的结构特点 , 揭 示酶的 进 化 关 系 , 并 且 可 以 推 断 酶 的 作 用 机 理 。根据纤维素酶基 因序列的 同源性及 疏水 区分析 , 上述纤维素酶分属于不同的糖苷水

15、解酶 家族 , 表 1 列出了部 分纤维素 酶分族 的催 化核 其中最著名的是 T. reesei, 它产生的纤维素酶具有 酶谱全、活力高的特点。自 20 世纪 60 年代以来 , 从野生菌株 T. reesei QM 6a 出发 进行了大量的筛 选育种工作 , 其中 QM 9414、 R utC30 和 M CG 77 能 够产生较高的内切型和外切型葡聚糖酶活力 , 是目前国内外生产酸性纤维素酶的主要菌种。腐 质霉是中性纤维素酶的重要生产菌种 ; 黑曲霉 产生的纤维素酶可以用于食品工业 ; 青霉除了产 生大量的纤维素酶外还 可产生较高的葡 萄糖苷 酶 , 可以弥补木霉产葡萄糖苷酶不足的缺点

16、。 细菌和放线菌等也能够产生纤维素酶 , 它们 产生的纤维素酶往往具有耐碱耐热的特点 , 如 洗涤剂工业用的碱性纤维素酶就是由嗜碱芽胞杆 4 3 1 期 顾方媛等 : 纤维素酶的研究进展与发展趋势 85 菌产生。细菌产生的纤维素酶除了传统的内切、 外切纤维素酶外 , 还会分泌一种纤维小体 ( cellu losom e)到胞外 , 纤维小体由多种纤维素酶和半纤 维素酶组成 , 具有较高的水解纤维素的能力 , 在纤 维废弃物的处理上具有很大的应用潜力 。 纤维素酶的生产主要有液体和固体发酵两种 形式。液体深层发酵 ( L iquid Subm erged F erm en tation, LSF

17、 ) 适于大规模工业生产 , 是目前国际上 的主要生 产方式 , 但 发酵 成 本较 高。固 体发 酵 ( So lid State F erm entation, SSF ) 以农作物秸秆等纤 维废弃物为主要原料 , 工艺简单 , 成本低廉 , 节约 水源 , 目前国内绝大部分纤维素酶生产厂家均采 用固体发酵生产纤维素酶。然而固体发酵法也存 在容易杂菌、产品质量不稳定等弊端。通过菌种 改造以及发酵工艺的改进 , T. reesei 生产纤维素酶 的能力得到了 很大的提高 , 表 2 显示自 1972 年 以来该菌种产纤维素酶的发酵水平 。 表 2 T. reesei 液体发酵产纤维素酶的进展

18、 Tab le 2 Imp rovem ent in cellulase p roduction ofT. ree sei in LSF 产酶水平 3 I L h 10 I L h 32 I L h 78 I L h 140 IU L h 1984 P37 加料分批培养 395 IU L- 1 h- 1 1989 筛选菌株连续培养 730 IU L- 1 h- 1 2002 MCG80 的工程菌 300 500 IU mL- 1* * 注 : * IU L- 1 h- 1指 纤维素 酶产 量 , I /mL 指发 酵产酶 活力 ; * * 以 CMC 为底物 最近几年在筛选发现新的纤维素酶产生

19、菌方 面有很大进展 , 其中嗜热菌 M elanocarpus sp. 可产 生较高活力的耐热、中性纤维素酶 , 有可能成为一 个产纤维素酶的优良菌株 。目前纤维素酶产 生菌的筛选趋势除了寻找高活力的产酶菌外 , 再 就是寻找具有特殊活性的产酶菌株 , 如中性、碱性 纤维素酶 , 低温、高温纤维素酶等 。 3 纤维素酶的分子生物学研究进展 纤维素酶 多为糖蛋白 , 酶分子的一级结构由 核心催化域 ( Cata ly tic D om ain, CD )、纤维 素结合 域 ( Cellulose B inding D om a in, CBD ) 和将这两部分 相连的链接区 ( L inker)

20、 三部分组成 , 也有仅含核 心催化区而无 CBD 区的纤维素酶 , 这类酶主要是 水解水溶性纤维素 。 由于纤维素酶是一个多组分的酶系 , 因此常 常根据实际需要 , 对其中的一个组分进行克隆与 表达。例如 , 用于棉织物水洗整理的纤维素酶要 求具有较高的内切酶活力 , 因此丁少军等将大型 真 菌 草菇 中 的内 切酶 基 因在 酵 母中 实 现高 表 达 , 这是一个很有意义的成果。表 3 列出了一 些已成功克隆表达的纤维素酶基因。目前大部分 纤维素酶基因的表达水平较低 , 纤维素酶基因工 程的主要难题是如何实现不同组分的有效表达和 如何提高表达量。因此 , 纤维素酶的表达除了在 常见的宿

21、主 , 如大肠杆菌、毕赤酵母、真菌 ( 如米 曲霉 ) 等表达之 外 , 最近又有大量文献是 关于以 转基因植物为宿主来表达纤维素酶基因 ; 与通常 的宿主相比 , 具有更高的表达量。如 2007 年将细 菌 Therm obif ida f usca 的耐热纤维素酶基因在烟草 的叶绿体基因组中成功表达 , 表达量达到可溶性 蛋白总量 0. 6% 3% , 这是转入细胞核基因组中 表达量的 6 15 倍 。 基因 eg1 1 Ba ega 8 基因来源 Volvariella volvacea Bac illu s sp. AC 1 表 3 Tab le 3 已成功克隆 表达的纤维素酶基因举例

22、 Exam p les of cellulase genes cloned and expressed 表达宿主 表达蛋白的性质 毕赤酵母 EG1: 表达量 8. 80 mg mL- 1, 活力 543. 36 IU E. coli 内切酶 B a EGA: 659 aa, 74. 87 ku mL - 1 cel6A 14 cel6B 14 cbh1 15 cel 12A 16 Th erm obifid a fu sca Th erm obifid a fu sca Chae tom ium th ermophilum CT2 Rhod otherm us ma rinus 叶绿体转基因烟

23、草 叶绿体转基因烟草 毕赤酵母 E. coli C el6A: 内切酶 , 42 ku, 表 达量占可溶性蛋白总量 0. 6% 3% C el6B: 外切酶 , 62 ku, 表达量占可溶性蛋白总量 0. 6% 3% CBH :I80 ku, 表达量 1. 42m g m L- 1, 脱脂棉酶活力 21 U mL- 1 内切酶 : 耐热 , CMC 比活力 3. 1 U mg- 1 9 5, 10 * - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 11 12 86 微 生 物 学 杂 志 28 卷 真菌中存在低水平的组成型纤维素酶 , 如果 纤维素存在于菌丝体

24、附近 , 则被组成型纤维素酶 水解 , 其水解产物进入细胞内再诱导纤维素酶的 大量表达 , 这种调控方式称为组成型表 达调控。 诱导物一旦进入细胞 , 则会激发由激活蛋白 ( acti vator proteins, AP ) 介导的纤维素酶基因的全面转 录 , 产生大量的纤维 素酶 , 称为诱导型表达调控。 纤维素降解后产生了大量的葡萄糖 , 导致了分解 代谢物阻遏的发生 , 由分解代谢物阻遏蛋白在转 录水平上直接作用于反向调控 , 阻遏了纤维素酶 的继续过量合成。 目前 , 有关纤维素酶的基因克隆与表达的研 究与文献较多 , 而关于纤维素酶诱导与调控的研 究较少 , 纤维素酶的诱导、表达与

25、调控的研究是当 前 有 关纤 维 素酶 分子 生 物学 研 究的 一 个重 要 方向。 4 纤维素酶的应用与发展趋势 纤维素酶可广泛用于食品、纺织、饲料、酿酒、 石油勘探、中药成分提取等众多领域 , 特别 是在纺 织、洗涤、造纸和生物能源等工业应用上具有重要 地位。 自 20 世纪 90 年代开始 , 酸性纤维素酶用于 牛仔布的水 洗整理 ( b ioston ing and biof inishing ), 从而开始了纤维素酶在工业上的大规模应用 , 这 也是目前纤维素酶应用最成功、用量最大的领域。 在牛仔布的水洗整理上酸 性纤维素酶具 有用量 少、效果快的特点 , 但服装返染严重 ; 中性

26、纤维素 酶反应条件温和而且不易返染 , 织物档次得到提 高 , 已普遍代替酸性酶。但在棉织物的整理上 , 如 去球 ( dep illing ) 脱 毛 ( reduced fuzz) 以 及 增 柔 ( softness) 等 , 酸性纤维素酶特别是木霉产生的纤 维素酶仍具有更多的优势。利用纤维素酶对棉织 物的整理并不需要纤维素酶的所有组分 , 如进行 棉织物的脱毛、去球等整理 , 仅有内切酶就可产生 明显的效果 , 但是棉织物的减量也较严重 , 影响了 织物的强度 , 通过基因工程改变内切酶和外切酶 的比例 , 可以在一定程度上解决这个问题 。 纤维素酶用于造纸工业 , 是利用外切纤维素

27、酶只从末端切断纤维素的作用原理 , 提高纸张的 光洁度。碱性 纤维素酶用于洗涤剂工业 , 可以提 高棉织 物 的 洗 净 度 , 起 主 要 作 用 的 是 内 切 酶 ( CMC 酶 ) , 是近些年来洗涤剂工业竞相开发的新 酶种之一。这两种工业应用涉及的纤维素酶只需 要纤维素酶系中的单一组分 , 基因工程技术可以 在其中得到广泛的应用。 纤维素酶将来最大的用途 , 或者可以使其产 量得到巨大增长的工业需求将是纤维素乙醇的开 发。自上世纪 70 年代石油危机以来 , 世界各国都 致力于开发新的可再生能源 , 而生物乙醇 ( bioeth ano l) 是被普遍看好的新 型燃料。进入 21 世

28、纪 , 利用纤维素酶转化纤维素物质产生葡萄糖进而发 酵获得生物乙醇 , 可以避免对粮食作物的大量损 耗 , 引起了各国政府和研究机构的重视 , 这其中的 关键是纤维素酶的成本问题。由于纤维素酶发酵 活力较低 , 因此其应用成本也较高。同时纤维素 酶相比其他糖苷水解酶类 , 比活力至少要低 1 2 个数量级 , 如滤纸酶的 比活力为 1 IU /mg 左 右 , CMC 的比活 力约 为 10 IU /m g , 从 而造成 酶的 作用效率较低。这是两个限制纤维素酶应用的瓶 颈问题 , 也是纤维素酶研究的热点与难点。目前 通过传统的菌种诱变和基因工程技术可以较大幅 度地提高目的蛋白的表达量 ,

29、从而提高酶的发酵 水平 , 如诺维信公司与美国能源部合作 , 将制造纤 维素乙醇中的酶制剂成 本由 2001 年的每加仑 5 美元降低到 2004 年的 30 美分 , 2005 年又降低到 每加仑 18 美分。还可以通过改善发酵条件和工 艺 , 如采用固体发酵来大幅度降低发酵成本。但 是提高酶降解天然纤维素的效率则需要 , 深入研 究纤维素酶的结构与功能以及作用方式 , 进而对 其进行有效改造 ; 或者通过筛选新 的产酶菌种 , 发 现具有开发潜力的新酶源 。 总之 , 纤维素酶是目前糖苷酶类中惟一尚有 大量亟待解决问题的酶 , 也是有着巨大工业和市 场潜力的 酶。进一步阐 明纤维素酶的结

30、构与功 能 , 研究纤维素酶的基因表达与调控的关系 ; 针对 不同工业需要研制不同组分比例的纤维素酶 ; 提 高纤维素酶水解天然纤维素的比活力 ; 开发适应 不同温度 ( 低温或高温纤维素酶 ) 的纤维素酶是 当前纤维素酶的主要研究趋势。 参考文献 : 1 丁少军 , 宋美 静 , 杨红军 , 等 . 中 性内切型 纤维素酶 在毕赤 酵母中高 水平 表达 的研究 J . 生物工 程学 报 , 2006, 22 ( 1): 71 76. 17 1 期 顾方媛等 : 纤维素酶的研究进展与发展趋势 87 2 Qu YB, Zhu MT, L iu K, et al. S tudies on cell

31、ulos ic ethano l 10 李新良 , 罗永清 , 沈建新 . 高活 性纤维素酶组 合物及其制备 p roduction for sustain able supp ly of liqu id fu el in Ch ina J . 方法 P. CN1335395A, 2002. B iotechnology Journa,l 2006, 1 ( 11): 1 235 1 240. 11 Kau r J, Chadha BS, Sa in iH S. Regulation of cellu lase p roduc 3 h ttp: / /www. cazy. org /fam /

32、acc_GH. h t l tion in two therm oph ilic fungiM elan ocarpu s sp. MTCC 3922 4 W ilson DB, Irw in DC. Genetics and p roperties of cellu lases and S cytalid ium thermophilum MTCC 4520 J. Enzym e and J . A dvan ces in B iochem ical Engin eering /B iotechno logy, M icrob ialT echnology, 2006, 38: 931 93

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34、, 24( 5 ): 452 481. 1999, 65: 41 67. 13 W ang HM, B ao K. Neu tral cellu lase catalytic core and m ethod 6 芦敬华 , 石家 骥 , 葛克山 , 等 . 产 中性纤维 素酶特异 腐质霉 H 31 3 复合诱变研究 J. 微生 物学通报 , 2006, 33 ( 6 ): 74 of produ cing sam e P . A1, 2006. Un ited S tates Patent 20060154843, 78. 14 Yu LX, Gray BN, Rutzk e CJ, et

35、al. E xpress ion of th erm os tab le 7 M artins LF, K olling D, C am assola M, e t al. C om parison of m icrob ia l cellulases in th e ch loroplasts of n icotine free tob acco P en icillium ech inu la tum and T richoderm a reesei cellu lases in re J. Journal of B iotechnology, 2007, 131 ( 3): 362 36

36、9. 8 9 lation to th eir activ ity again st various cellu los ic substrates J . B ioresource Technology, 2008, 99( 5 ): 1 417 1 424. Zhang S, Y in QY, L iYH, et al. M olecu lar and b iochem ical characterization of Ba EGA, a cellu lase secreted by B acillus sp. AC 1 from Ampullaria crosseans J. A pp

37、lied M icrob iology and B iotechnology, 2007, 75( 6 ): 1 327 1 334. Bayer EA, Lam ed R, H i m elME. Th e poten tial of cellu lases and cellu losom es for cellu los ic w aste m anagem ent J. Cu rrent Op in ion in B iotechno logy, 2007, 18( 3): 237 245. 15 刘守安 , 李多川 , 张燕 , 等 . 嗜热毛壳菌 CT2 纤维二糖水解酶 I 在毕赤酵

38、母 中的高 效表 达 J. 菌 物学报 , 2006, 25( 2 ): 256 262. 16 W icher KB, H olst OP, H achem MYA, et a l. Th erm ostable cel lu lase P. Un ited S tates Paten t 6812018, 2004. 17 M iettinen O inonen A, Palohei o M, Lan tto R, e t a l. En han ced p roduction of cellob iohydrolases in Trichod erma reesei and evalua

39、tion of the new preparations in b iofin ish ing of cotton J. Journal of B iotechnology, 2005, 116 ( 3): 305 317. 好消息 为了答谢广 大会员及读者对 微生物学杂志 !的支持与厚 爱 , 本刊决 定 中国微生物学会 会员 , 将以 50% 优惠价酬谢订阅本刊 。 2007 年起凡是 订阅办法 : 微生物学杂志 !全年六期 , 全 年订费 90. 00 元 , 优惠价 50 元 ( 含邮资 ), 请 直接与编辑部联 系订阅 。 编辑部地址 : 辽宁省朝阳市文化路二段 22 号 微生物学 杂志 !编 辑部 , 邮编 : 122000。 亦可银行汇款至 : 工行朝阳市 燕都支 行 , 户名 : 辽宁省 微生物 学会 , 帐 号 : 0713020209249067528 (务必注明 联系 人 姓名 )。 编辑 部办 理缺 刊补订 和零 售服务 (本 刊编辑部现存 有少 量 过期 期刊 , 如 有需 要 可与 编 辑部 联系 ), 订购 电 话 : 0421 - 6684618, E - m ai: L nw suxh m ai. cyp t. ln. cn。 0421 - 2914613,