壳聚糖溶液pH对载细胞海藻酸钠_壳聚糖微胶囊性能的影响.docx

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1、壳聚糖溶液pH对载细胞海藻酸钠_壳聚糖微胶囊性能的影响Vol.27高等学校化学学报No.12006年1月CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES182186壳聚糖溶液pH对载细胞海藻酸钠2壳聚糖微胶囊性能的影响于炜婷1,刘袖洞1,李晓霞2,綦文涛1,任东文1,马小军1(1.中国科学院大连化学物理研究所生物医学材料工程组,大连116023;2.四川大学材料科学工程学院,成都610064)摘要以激光共聚焦扫描显微镜为研究手段,原位直观地考察了在不同pH条件下聚电解质膜的络合程度和蛋白扩散情况.通过分析pH值对微胶囊膜性能的影响规律,并结合不同种类细胞对环境pH的敏感

2、特性,确定了制备细胞培养用海藻酸钠2壳聚糖微胶囊的最佳pH值.结果表明,当壳聚糖溶液的pH值由3150增加到6150,微胶囊膜的络合深度呈现高2低2高的趋势,而微胶囊膜的膨胀性能呈现低2高2低的趋势,模型蛋白通过微囊膜的扩散呈现低2高2低的趋势,拐点均出如今pH=4100和5150处.结合动物细胞及微生物细胞对环境pH耐受能力的考察,确定制备微囊化动物细胞时,微胶囊成膜反响溶液的最佳pH值为5150;制备微囊化大肠杆菌时,反响溶液的最佳pH值为5100;制备微囊化酵母菌时,反响溶液的最佳pH值为4150.关键词海藻酸钠;壳聚糖;pH;微胶囊;细胞培养中图分类号O636;R318108文献标识码

3、A文章编号025120790(2006)0120222205微胶囊通常是指外层为高分子膜,内部为三维网状构造的球囊.作为细胞的固定化载体,外层高分子膜的选择透过性能保证了微胶囊内外的物质交换,而内部空间构造提供了细胞贴壁的外表,在反响器中进行微囊化细胞培养时,外部搅拌可使其处于悬浮状态而剪切力不伤及细胞活性,进而将贴壁和悬浮培养的优点集于一身,因而,微胶囊在细胞大规模培养的基础研究和工业应用方面都得到广泛重视1.我们曾利用天然多糖海藻酸钠和壳聚糖之间的聚电解质络合反响制备了海藻酸钠2壳聚糖(Alginate2chitosan,AC)微胶囊2,其囊膜是由壳聚糖单体分子上质子化的氨基和海藻酸钠单体

4、分子上的羧基间通过静电力或氢键构成的聚电解质复合膜3,因而,壳聚糖溶液pH直接决定两种聚离子暴露的电荷基团及分子构造,进而对复合膜的构成、膨胀性能及通透性都有明显的影响.本文重点考察了反响溶液的pH值对复合膜的膜厚、膜的膨胀性能及蛋白扩散性能的影响规律.对于囊内细胞而言,由于细胞对制备微胶囊经过中环境的pH比拟敏感,因而,在考察反响溶液pH值对细胞活性影响规律的前提下,选择适宜的反响溶液pH值,对制备用于动物细胞或微生物细胞培养的AC微胶囊具有明确的指导意义.1实验部分1.1试剂与仪器海藻酸钠(Sodiumalginate,简写为alg,化学纯,青岛海藻工业公司);壳聚糖(Chitosan,简

5、写为chi,Mw=411104,参照王勇等4方法改性);荧光素异硫氰酸酯(Fluoresceinisothiocyanate,简写FITC,Sigma产品);罗丹明异硫氰酸酯(RhodamineBIsothiocyanate,简写RBITC,Sigma产品);胰蛋白酶(Trypsin,Sigma产品);中国仓鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvary,简写CHO,本实验室保存);大肠杆菌(EscherichiacoliDH5,简写E.coliDH5,本实验室保存),啤酒酵母菌(Saccharomycescere2visiae,简写S.cerevisiae,大连理工大学白凤武教授馈赠).

6、收稿日期:2004212224.基金项目:国家自然科学基金(批准号:20236040)及国家“九七三计划项目(批准号:2002CB713804)赞助.联络人简介:马小军(1958年出生),男,研究员,博士生导师,从事生物医用材料工程学研究.E2mail:maxj高压静电场发生器(中国科学院大连化学物理研究所自制5);激光共聚焦扫描显微镜(ConfocalLaserScanningMicroscope,简称CLSM,德国Leica公司,TCS2SP2);激光粒度仪(美国Beckman2Coulter公司,LS2100Q).1.2实验经过1.2.1AC微胶囊的制备及其膜厚的测量参照文献6方法制备出

7、海藻酸钙凝胶珠,将其与质量体积分数015%FITC标记后的壳聚糖溶液(pH值分别为3150,4100,4150,5100,5150,6100,6150)成膜反响15min,构成AC微胶囊.CLSM透射光和荧光(激发/发射:488/530nm)通道同时扫描,在不同显微镜视野下获取图像15幅,在1010放大倍数下共获得微胶囊100200个,选取透射光与反射光完全重叠且粒径均一的微胶囊,用CLSM软件2Quantify/Prof.分别读取40个微胶囊的膜厚,计算均值和标准差.1.2.2微胶囊膜膨胀度的测定将AC微胶囊用55mmol/L柠檬酸钠溶液液化后,用激光粒度仪测定各组微胶囊的平均粒径,参照文献

8、7方法根据下列方程计算膨胀度:Sw=D3t-D30D30100%式中,Sw为膨胀度,Dt为AC微胶囊液化后的直径,D0为海藻酸钙胶珠的直径.1.2.3微胶囊膜通透性能的测定以RBITC标记的Trypsin为模型蛋白,将AC微胶囊按体积比为120参加到标记好的蛋白溶液中,用CLSM以xyt形式扫描,每30s扫描一幅图像,共21幅.扫描结果用软件Quantify/Quant记录单个微胶囊内荧光量增加的动态曲线,记录3组数据,并取平均值.1.2.4壳聚糖溶液pH对动物细胞活性的影响在96孔板中均匀接种CHO细胞,生长过夜后,分别与pH值为3150,4100,4150,5100,5150,6100和6

9、150的壳聚糖溶液及生理盐水接触反响,15min后弃去溶液,用生理盐水洗涤3次后参加RPMI21640培养液,培养过夜.以生理盐水作对照,用MTT法计算各组细胞存活率,以8组重复数据取平均值.1.2.5壳聚糖溶液pH对微生物细胞活性的影响同等条件下获得8组处于对数生长期的大肠杆菌E.coliDH5,经离心获得菌体细胞,分别参加pH值为3150,4100,4150,5100,5150,6100和6150的壳聚糖溶液和生理盐水,15min后,用稀释平板法获得各组残余活细胞数,以生理盐水反响组为对照,计算各组细胞的存活率,3组重复数据取平均值.用同样方法测定不同pH壳聚糖溶液对酵母细胞S.cerev

10、isiae存活率的影响.Fig.1MembranethicknessandswellingdegreeofACmicrocapsulesasafunctionofpHofchitosansolution2结果与讨论海藻酸盐分子链由甘露糖醛酸(Mannuronicacid,M)和古罗糖醛酸(Guluronicacid,G)构成,其pKa值分别为3138和31658,而壳聚糖的pKa值为6139.因而,当溶液pH值发生变化时,海藻酸盐和壳聚糖的解离度、海藻酸盐分子链上的羧基和壳聚糖分子链上的伯氨基的电荷密度都会发生显著变化,进而对聚电解质成膜反响进行的程度和经过产生影响,最终对微胶囊膜性能产生影响

11、.2.1壳聚糖溶液pH对壳聚糖分子成膜深度的影响当反响溶液的pH值由3150增至4100时,pH值接近海藻酸钠的pKa值,海藻酸盐链节中COO-基团随pH值的升高而增加,壳聚糖由于其pK=613,在低pH值范围内NH+3较多,因此成膜反响程度随着COO-基团的增加而加深,表现为微胶囊膜厚增加.当pH值从4100增加到5150,pKalg在此区间,海藻酸盐链节中COO-基团随pH值381No.1于炜婷等:壳聚糖溶液pH对载细胞海藻酸钠2壳聚糖微胶囊性能的影响的升高而继续增加,但壳聚糖分子中的NH+3随pH值的升高而减少,与海藻酸钠的络合程度随之降低,表现为膜厚随pH的升高而减小.随着pH继续升高

12、(从5150到6150),尤其在接近pKchi时,壳聚糖分子发生了空间构象的改变,分子在空间的伸展最小而具有更高的分子扩散系数,能更深的进入海藻酸钙的凝胶网络,因而,表现为膜厚又有所增加(见图1).Skjk2Br?k等10对海藻酸钙胶珠与壳聚糖分子反响的研究结果表明,当pH值从4到6尤其是从5到6时,壳聚糖成膜程度随pH值增加而加深.他们分析以为,pH增加,壳聚糖分子的电荷密度降低导致空间伸展变小而有更高的扩散系数,因此决定壳聚糖分子键合程度的主要因素是壳聚糖分子的空间构造与海藻酸钙凝胶网络孔径的匹配程度.但Skjk2Br?k等的研究对象是通过引入反凝胶离子构成的构造均一的海藻酸钙凝胶网络.本

13、文的研究对象是普通外部凝胶化获得的内部疏松外表致密11的非均匀凝胶网络.因而,结合实验结果我们以为,与非均匀海藻酸钠凝胶网络反响时,当壳聚糖溶液的pH5150时,尤其是接近其等电点时,影响壳聚糖键合程度的主要因素是壳聚糖分子的空间构造.2.2壳聚糖溶液pH对微胶囊膜膨胀性能的影响规律微胶囊膜的膨胀性能直接影响微胶囊在应用经过中的稳定性.由于AC微胶囊的核心是海藻酸钙水凝胶,当其碰到氯化钠或柠檬酸钠等电解质溶液时会发生Na+与Ca2+之间的离子移变,导致凝胶由固态转为液态,并发生体积膨胀,通常称之为“液化12.AC微胶囊膜的膨胀性能与壳聚糖分子的键合程度和膜的致密程度有直接关系.当反响溶液pH值

14、由4150增至5150时,pKalg呈反比.当pH5150时,由于接近壳聚糖的pKa,壳聚糖链节中以NH2为主,只要极少量的NH+3基团与海藻酸钠发生络合反响.这种由分子扩散进入凝胶网络所构成的膜,固然表现出的膨胀度随膜厚的增加而略降低,但由于在此pH值范围内构成的络合膜缺乏分子间静电力的吸引作用,膜强度的整体水平较低(图1).2.3壳聚糖溶液pH对微胶囊膜通透性的影响规律Fig.2Thecurvesoftrypsin2RBITCdiffusionintoACmicrocapsulesFig.3EffectofpHofchitosansolutiononthediffusionoftrypsi

15、n2RBITCintoACmicrocapsulesAC微胶囊膜的通透性能主要与膜厚和膜的致密程度有关.当反响溶液pH值由4100增至6150时,其蛋白的扩散速率与微胶囊膜厚成反比,到达扩散平衡时,蛋白进入微胶囊内的含量随膜厚的增加而减少.当反响溶液pH时扩散进微胶囊内的荧光量为纵坐标重新作图(图3),能够明晰地体现出蛋白扩散量随反响溶液pH值改变的变化趋势.2.4壳聚糖溶液pH对动物细胞活性的影响中国仓鼠卵巢(Chinesehamsterovary,CHO)细胞是目前常用的用于基因工程的宿主细胞,考察微Fig.4SurvivalrateofCHOcellsaftertreatmentofch

16、itosansolutionwithdifferentpHvalues,with019%sodiumchlorideasthecontrol胶囊膜反响溶液pH值对CHO细胞活性的影响规律对进一步指导微胶囊化CHO细胞的制备及其规模化培养生产基因工程药物具有重要意义.结果表明(图4),壳聚糖溶液在5150pH6150时,细胞存活率没有明显变化,这是由于尽管动物细胞对环境的pH值比拟敏感,但是由于细胞代谢经过通常会产生如乳酸等酸性物质,会降低周围环境的pH值,因而,动物细胞在一定范围内能够耐受弱酸环境.但当pH5100时,细胞存活率明显降低.2.5壳聚糖溶液pH对微生物细胞活性的影响微生物细胞由于

17、细胞壁的存在比动物细胞更适应环境pH值的改变.大肠杆菌DH5和酵母菌S.cerevisiae是目前应用得最广泛的基因工程宿主菌,因而,考察其对壳聚糖溶液p值H的耐受情况,对指导ACA微囊化微生物细胞的制备具有重要意义.由图5看出,pH=415时大肠杆菌DH5的细胞存活率降低一个数量级,当pH410时,细胞存活率降低2个数量级以上;而酵母菌在pH=3150时已基本死亡,pH值在41006150时都能保持50%以上的成活率.Fig.5SurvivalrateofE.coliDH5(A)andS.cerevisiae(B)aftertreatmentwithdifferentchitosansolu

18、tions,with019%sodiumchlorideasthecontrol3结论通过研究AC微胶囊制备经过中壳聚糖溶液pH对微胶囊膜膨胀性能和蛋白扩散性能的影响规律,结合动物细胞及微生物细胞对环境pH改变耐受能力的实验结果,确定了制备载细胞AC微胶囊时,壳聚糖溶液的最佳pH值.动物细胞由于没有细胞壁几乎不能耐受环境的剪切力,很难通过提高搅拌速度来提高传质,所以,应该优先考虑微胶囊膜的通透性能.因而,在动物细胞能够耐受的pH值(51506150)区间,选择pH=5150,通过提高培养液中营养物质向微胶囊膜内的扩散能力,保证细胞及时充分的营养供给.微生物细胞由于细胞壁的存在,在很大程度上能耐

19、受环境的剪切力,培养经过中能够通过反响器的高速搅拌来提高反响体系的传质,所以微胶囊膜的通透性能对其并没有突出的影响,而高速搅拌对微胶囊膜强度却有很高的要求,另外,微生物细胞生长迅速、繁衍快、代谢能力强,迅速生长的菌体极易将微胶囊胀破导致菌体泄漏,因而,应重点考虑微胶囊膜的强度.在大肠杆菌能够耐受的pH区间(51006150),选择微胶囊膜强度最好点(pH=5100);在酵母菌能够耐受的pH区间(41006150),选择pH=4150.581No.1于炜婷等:壳聚糖溶液pH对载细胞海藻酸钠2壳聚糖微胶囊性能的影响681高等学校化学学报Vol.27参考文献1VandenbergG.W.,Drole

20、tC.,ScottS.L.etal.JournalofControlledReleaseJ,2001,77:2973072XUEWei2Ming(薛伟明),YUWei2Ting(于炜婷),LIUXiu2Dong(刘袖洞)etal.Chem.J.ChineseUniversities(高等学校化学学报)J,2004,25(7):134213463Simek2EgeF.A.,BondG.M.,StringerJ.JournalofAppliedPolymerScienceJ,2003,88:3463514WANGYong,HEYang,LIUQunetal.ChemicalJournalonInt

21、ernetJ,2000,2(11):02b051ne5RENJi2Lun(任吉伦),MAXiao2Jun(马小军),HEYang(何洋).ZL00253538.6P,20006WANGYong(王勇),XIEYu2Bing(解玉冰),MAXiao2Jun(马小军).ProgressinBiotechnology(生物工程进展)J,1999,19(2):13157MAXiao2Jun(马小军),XIEYu2Bing(解玉冰),ZHOULi(周丽)etal.TheChineseJournalofOrganTransplantation(中华器官移植杂志)J,1995,16(4):156157,18

22、98HuguetM.L.,GroboillotA.,NeufeldR.J.etal.JournalofAppliedPolymerScienceJ,1994,51:142714329YalpaniM.,HallL.D.MacromoleculesJ,1984,17(3):27228110GserdO.,SmidsrdO.,Skjk2Br?kG.BiomaterialsJ,1998,19:1815182511LiuX.D.,YuW.Y.,ZhangY.etal.J.MicroencapsulationJ,2002,19(6):77578212LiuX.D.,XueW.M.,LiuQ.etal.C

23、arbohydratePolymersJ,2004,56(4):459464EffectofpHofChitosanSolutiononPropertiesofSodiumAlginate2ChitosanMicrocapsuleswithCellsYUWei2Ting1,LIUXiu2Dong1,LIXiao2Xia2,QiWen2Tao1,RENDong2Wen1,MAXiao2Jun13(1.LaboratoryofBiomedicalMaterialEngineering,DalianInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences

24、,Dalian116023,China;2.CollegeofMaterialsScienceEngineering,SichuanUniversity,Chengdu610064,China)AbstractSodiumalginate2chitosan(AC)microcapsulesareoftenusedastheimmobilizationcarriersforcellculture.Theyarecomposedofporousgelasthecorefacilitatingcelladhesion,andcoatedwithpolyelectrolytecomplexmembra

25、neprotectingcellsandallowingselectivemasstransfer.Therefore,theregulationandcontrolofmembranepropertiescandirectlyaffectthegrowthandmetabolismofcellsinmicrocapsules.Amongmanyparameters,pHofchitosansolutionistheimportantone.Inthispaper,theformationofpolyelectrolytemem2brane,thedegreeofcomplexformatio

26、nandproteindiffusionatdifferentpHvaluesweredirectlyobservedinsitubyusingaconfocallaserscanningmicroscope(CLSM).TheeffectofpHonthepropertiesofACmicro2capsulemembranewasdiscussed.TheoptimalpHwasdeterminedinthepreparationofACmicrocapsuleswithdifferentcells(animalandmicrobialcells).Itwasdemonstratedthatthemembranethicknessshowed“high2low2highshape,theswellingbehaviorofmicrocapsules“low2high2lowshapeandtheproteindiffusionacrossthemembrane“low2high2lowshapeasafunctionofpH,theinflectionpointsallappearedatpH=4.00and4.50,respectively.KeywordsChitosan;Alginate;pH;Microcapsule;Cellculture(Ed.:Y,Z)