载细胞海藻酸钠_壳聚糖微胶囊的化学破囊方法研究.docx

《载细胞海藻酸钠_壳聚糖微胶囊的化学破囊方法研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《载细胞海藻酸钠_壳聚糖微胶囊的化学破囊方法研究.docx（25页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、载细胞海藻酸钠_壳聚糖微胶囊的化学破囊方法研究载细胞海藻酸钠/壳聚糖微胶囊的化学破囊方法研究薛伟明12于炜婷1刘袖洞1贺欣3王为1马小军1(1.中国科学院大连化学物理研究所生物医学材料工程组大连116023;2.西北大学化工学院西安710069;3.大连医科大学检验学院大连116027)摘要以海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微胶囊(简称ACA微胶囊)为研究体系建立了一种生理条件下ACA微胶囊的化学破囊方法破囊经过充分考虑了对囊内生物物质活性的保持.以微生物细胞PzchzapastOtzsGS115和动物细胞L929为模型以NaCO3和Na3C65O722O为破囊液基本组分考察了破囊液对ACA微胶囊的

2、破囊效果及破囊经过对囊内细胞活性的影响.结果表明破囊操作可在30S内完成破囊率为100%微胶囊膜完全溶解破囊后细胞存活率在85%以上.关键词壳聚糖;海藻酸钠;微胶囊;破囊;细胞活性中图分类号O636;R318.08文献标识码A文章编号0251-0790(2004)07-1342-05收稿日期:2003-06-25.基金项目:国家自然科学基金重点项目(批准号:20236040)及中国科学院十分支持课题基金(批准号:STZ-00-08)赞助.联络人简介:马小军(1958年出生)男研究员博士生导师从事生物医学材料研究.E-mail:maxj生物技术与化工学科的浸透穿插使生产丙烯酰胺酚醛树脂等重要化工

3、原料和白介素疫苗等高值高效生化药物12的传统生产经过被越来越多的酶催化或细胞反响经过所替代.在优化生物反响及传递性能的新型生物反响器的研制开发经过中反响器的微型化是新的发展方向之一.利用天然阴离子聚合物海藻酸钠和阳离子聚合物壳聚糖之间的聚电解质反响制备ACA微胶囊其外部为高分子膜内部能够是液体或固体环境直径范围在1001000pm之间作为球形膜生物微反响器具有可在生理条件下制备成型能有效保持被包封生物物质的活性与正常功能表达;物质传递途径缩短fig.1PrincipleofACAbio-microreactorwithsphericalmembrane利于底物供给和产物分离;内部静态和外部动态

4、环境的结合使生物物质的生长与生产耦合等特点.图1为ACA球形膜生物微反响器原理示意图.目前相关研究集中在微胶囊膜构建3微胶囊环境与微囊化细胞互相作用微胶囊生物相容性与生物降解性及微胶囊膜传质特性4等方面.在仅有的微胶囊破囊报道中5使用的是机械破碎法其破囊率低细胞失活严重残留碎片较多且易在碎片上粘附使分离困难.本文建立在生理条件下载细胞ACA微胶囊的化学破囊方法破囊液中NaCO3与ACA囊膜高分子反响使囊膜破碎Na3C65O7与囊内高分子海藻酸钙反响使其溶解进而在保证囊内细胞存活前提下实现微胶囊完全破囊.该方法的建立实现了在ACA微胶囊中细胞生长状态的定量表征细胞形态与功能检测及其产物的回收与纯

5、化构成了生物微反响器技术的重要组成部分.1实验部分1.1材料与仪器海藻酸钠(化学纯大连海藻工业公司)壳聚糖(MW=4.5104自制)其它试剂均为分析纯.VOl.25高等学校化学学报NO.72004年7月CEMICALJOURNALOFCINESEUNIVERSITIES13421346酵母菌(GS115本实验室保存D;小鼠结缔组织成纤维细胞(L929本实验室保存D;微生物细胞培养基为YPD培养基(华美生物制品公司D;动物细胞培养基为164O培养基(Sigma公司D;动物细胞活性检测用噻唑蓝试剂(MTTSigma公司D和二甲基亚砜(DMSO沈阳化学试剂厂D.大功率微胶囊制备仪(中国科学院大连化学

6、物理研究所DOlympus-CK4O生物倒置显微镜(日本Olympus光学工业株式会社DMS-353酶联免疫检测仪(LabsystemsCO.Ltd.FinlandDJT-9OO净化工作台(沈阳利港净化设备有限公司DHeraeusBB16UVCO2恒温培养箱(香港HealFOrceDevelOpmentCO.Ltd.DTL-16R台式高速冷冻离心机(上海市离心机械研究所DJA5OO3分析天平(上海天平仪器厂D.1.2实验方法1.2.1载细胞ACA微胶囊的制备将细胞与质量分数为1.5%的海藻酸钠溶液混合均匀利用微胶囊制备仪将该混悬液滴入1.1%CaCl溶液中进行凝胶化反响构成载细胞海藻酸钙凝胶珠

7、.胶珠与2O.5%(质量分数D的壳聚糖溶液成膜反响1Omin构成载细胞ACA微胶囊.1.2.2破囊液配制及破囊方法破囊液基本组成为O.2mOl/LNaHCO3和O.O6mOl/LNa3C6H5O72H2OpH=7.88.2.将破囊液与ACA微胶囊以体积比1O=1混合手动振摇观察微胶囊形态.1.2.3破囊液对微生物细胞活性的影响汲取1O8个/mL的酵母GS115细胞悬液1.OmL平行3份分别与1OmLYPD培养液1OmLO.9%生理盐水1OmL破囊液混合1Omin用生理盐水依次稀释并涂覆在YPD固体平板上于28培养48h统计菌落数.计算破囊液样品中酵母细胞存活率.1.2.4破囊液对动物细胞活性的

8、影响(1D破囊液对L929细胞活性的影响:采用164O培养液将L929细胞悬液含量稀释为每毫升原液1.O1O5个按每孔2OOpL接种于96孔板的第27列第1孵箱中培养24h.倾去孔中培养液分别在第2列列为空白培养液于37饱和水蒸汽5%CO2参加2OOpL164O培养液;在A3D7中参加2OOpL破囊液(4个平行D;在E3H7中参加2OOpL生理盐水(4个平行D各列对应于细胞接触时间为51O2O3O和6Omin倾去孔中溶液再参加2OOpL164O培养液及2OpLMTT试剂培养反响4h此时活细胞与MTT试剂反响生成蓝紫色结晶.采用DMSO溶解结晶用酶联免疫检测仪在45Onm测定各孔吸光度值计算细胞

9、存活率.(2D缓冲破囊液对L929细胞活性的影响:按(1D方法将L929细胞接种于96孔板并培养24h倾去培养液参加1OOpL破囊液与细胞接触3Os再参加5OpLO.2mOl/LHAc/O.1mOl/LNaAc缓冲液与细胞分别接触51O2O3O和6Omin.采用MTT法测定各孔吸光度值计算细胞存活率.2结果与讨论2.1载细胞ACA微胶囊的形态海藻酸盐和壳聚糖分属阴阳离子聚电解质海藻酸盐分子链上的游离羧基与壳聚糖分子链上的游离伯氨基在静电力作用下通过聚电解质络合反响在生理条件下快速构成ACA微胶囊膜(图2D能有效保持被包封生物物质的活性与功能.同时通过控制反响条件能够调节膜的物质分离系数及传递系

10、数使之作为生物微反响器能适应不同反响与分离的需求.图3为载细胞ACA微胶囊的显微照片.微胶囊形态良好平均粒径2OO3OOpm囊膜厚度1020pm.细胞在囊内可良好生长与增殖培养30d后图3(B)囊内细胞生长饱满细胞密度显著增大.此时ACA微胶囊膜形态仍保持完好.fig.3Morphologyofcell-loadedACAmicrocapsules(A)Cultivated0d(20);(B)cultivated30d(50).2.2ACA微胶囊的化学法破囊2.2.1ACA微胶囊膜的解聚反响采用破囊液破囊时ACA微胶囊在破囊5和10S时的形态如图4所示.微胶囊在30S内全部溶解破囊后溶液中细胞

11、形态完好.fig.4MorphologyofACAmicrocapsules(A)Afterbroken5S;(B)afterbroken10S.NaCO3作用于ACA微胶囊膜时存在如下反响;Cam(C57O4COON3C69O4)n+CO-3Cam(C57O4COO-)n+(C69O4N2)n+CO2f+2O在该反响中随着CO2气体不断释放反响持续向右进行微胶囊的聚电解质复合膜逐步解聚并暴露出囊膜内的海藻酸钙凝胶珠.2.2.2海藻酸钙凝胶珠的解聚反响当海藻酸钙凝胶珠从ACA微胶囊膜中暴露出来后在破囊液组分柠檬酸钠作用下海藻酸钙凝胶珠迅速液化最终使ACA微胶囊完全解聚.海藻酸钠由古罗糖醛酸(G

12、单元)和甘露糖醛酸(M单元)随机排列组成分子量的理论值198.11平均真实值222.00聚合度80750.通过理论分析与实验研究我们以为Ca2+引起海藻酸钠凝胶机理如下;1个Ca2+与海藻酸钠分子链段中2个GG片段通过4个配位键构成配合物即蛋格构造(图5)其中由G单元的5-COO-和2-O介入配位键构成.Cam(C5704C00-)n-Na3C650-7Nan(C5704C00-)n-Ca3(C6507)22.3破囊液对细胞活性的影响2.3.1对微生物细胞的影响以GS115为微生物细胞模型考察破囊液化学成分对细胞活性的影响(表1)结果表明GS115细胞与破囊液接触1Omin后7O%9O%的细胞

13、仍能保持活性因而破囊液对微生物细胞活性影响较小.Table1TheeffectofculturemediaontheactivityofGS115yeastcellsCulturemediaYPDculturesolutionPhysiologicalsalineMembrane-brokensolution(MBS)Amountofactiveyeastcells/(number-mL-1)1.731O81.4O1O81.271O8CellsurvivalrateinMBS(%)1.271O81.731O8=73.41.271O81.4O1O8=9O.72.3.2对动物细胞活性的影响由于微生

14、物细胞具有细胞壁的保护破囊液对其活性影响较稍微.相对而言动物细胞对外界环境条件的变化更敏感而实践中微胶囊作为生物微反响器将更多地应用于动物细胞培养以生产更高价值的产品因而研究化学法破囊对动物细胞活性的影响更有价值.L929细胞生长指标和生物学特性非常稳定7因而本实验以L929为模型细胞株考察破囊液化学成分对动物细胞活性的影响.按1.2.4节(1)方法L929细胞相对存活率如图6(A)所示.结果表明随着细胞与破囊液接触时间延长细胞相对存活率显著降低破囊液的弱碱性(p=7.88.2)是引起细胞活性损失的主要原因.尽管如此与破囊液接触52Omin的样品中仍有6O%75%的细胞存活.6431高等学校化

15、学学报Vol.25报)J200223(7):141714204EYang(何洋)XIEYu-Bing(解玉冰)MAXiao-Jun(马小军)etal.Chem.J.ChineseUniversities(高等学校化学学报)J200021(2):2782825PraskashSChangT.M.S.BiotechnologygBioengineeringJ199546:6216266aug7AOe-Ping(郝和平)XITing-Fei(奚廷斐)BUChang-Sheng(卜长生).SupervisionandEvaluationofMedicalApparatusandInstrument(医

16、疗器械监督管理和评价)MBeijing:ChineseMedicinePressofScienceandTechnology(中国医药科技出版社)2000ChemicalmethodofbreakingtheCell-loadedSodiumAlginate/ChitosanmicrocapsulesXUEWei-Ming12YUWei-Ting1LIUXiu-Dong1EXin3WANGWei1MAXiao-Jun1%(1.LaZoTatoTyofBiomeciCalMateTialEngineeTingDalianlnstitteofChemiCalPhysiCsChineseACacem

17、yofSCienCesDalian116023China;2.CollegeofChemiCalEngineeTingNoTthwestUniUeTsityXi/an710069China;3.CollegeofLaZoTatoTyMeciCineDalianMeciCalUniUeTsityDalian116027China)AbstractAnovelchemicalmethodtobreakanddissolvecell-loadedmicrocapsulesunderphysiologicalconditionWasestablishedespeciallyaimingatalgina

18、te/chitosan/alginate(ACA)microcapsules.Themicrocapsule-brokenprocessWasdesignedtoproceedunderanapproXimatelyphysiologicalconditionfortheconsiderationofmaintainingthecytoactive.Themicrobialcell(PiChiapastoTisGS115)andanimalcell(L929)Werechosenasthemodelcellsandthemicrocapsule-brokensolution(MBS)Wasba

19、sicallycomposedofNaCO3andNa3C65O722O.TheeffectsofMBSonthebreakingofmicrocapsulesandonthecytoactiveWerethoroughlyinvestigated.MoreoverthemechanismofthebreakingofmicrocapsulesWasanalyZed.ItWasdemonstratedthatthemicrocapsulescouldbebrokenWithin30sthebreakingratioofthemicrocapsuleWas100%andthefragmentso

20、fthemicrocapsulesWasdissolvedcompletely.ItWasalsodeterminedthatthesurvivalrateofcellsWasabove85%.ThusthenovelmethodWillmakeitpossibletoguantitativelyanalyZethegroWthofcellsinmicrocapsulestoeXaminethemorphologyandfunctionofcellstorecoverthecellsandtopurifymetabolicproductsWhichisalWaysdifficulttoreal

21、iZeatpresent.Thereforethechemicalmethodofbreakinganddissolvingcell-loadedmicrocapsulesWouldbetheimportantcomponentofmicroencapsulationtechnologyappliedtothecellcultureandcelltransplantation.KeywordsChitosan;Sodiumalginate;Microcapsule;Breakingofmicrocapsule;Cellactivity(Ed.:YZ)载细胞海藻酸钠/壳聚糖微胶囊的化学破囊方法研

22、究薛伟明，于炜婷，刘袖洞，贺欣，王为，马小军作者单位：薛伟明(中国科学院大连化学物理研究所生物医学材料工程组,大连,116023;西北大学化工学院,西安,710069)，于炜婷,刘袖洞,王为,马小军(中国科学院大连化学物理研究所生物医学材料工程组,大连,116023)，贺欣(大连医科大学检验学院,大连,116027)刊名：高等学校化学学报英文刊名：CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES年，卷(期)：2004,25(7)被引用次数：17次参考文献(7条)1.何洋;解玉冰;马小军APA微胶囊扩散数学模型的改良期刊论文-高等学校化学学报2000(02)2.刘群;薛伟

23、明;马小军海藻酸钠-壳聚糖微胶囊膜强度的研究期刊论文-高等学校化学学报2002(07)3.BlanquetS;MarolBonninS;BeyssacEThebiodrugconcept:aninnovativeapproachtotherapy外文期刊2001(10)4.郝和平;奚廷斐;卜长生医疗器械监督管理和评价20005.HaugACompositionandPropertiesofAlginates19646.PraskashS;ChangTMSPREPARATIONANDINVITROANALYSISOFMICROENCAPSULATEDGENETICALLYENGINEEREDE-

24、COLIDH5CELLSFORUREAANDAMMONIAREMOVAL外文期刊1995(6)7.SchmidA;DordickJS;HauerBIndustrialbiocatalysistodayandtomorrowReview外文期刊2001(6817)本文读者也读过(7条)1.于炜婷.刘袖洞.李晓霞.綦文涛.任东文.马小军.YUWei-Ting.LIUXiu-Dong.LIXiao-Xia.QiWen-Tao.RENDong-Wen.MAXiao-Jun壳聚糖溶液pH对载细胞海藻酸钠-壳聚糖微胶囊性能的影响期刊论文-高等学校化学学报2006,27(1)2.于炜婷.雄鹰.刘袖洞.王为.

25、谢威扬.马小军海藻酸钠-壳聚糖微胶囊作为肠道内生化微反响器的研究期刊论文-高等学校化学学报2004,25(7)3.李强.吴彩娥.LiQiang.WuCaie壳聚糖/海藻酸钠制备八角茴香油微胶囊的研究期刊论文-农业机械学报2007,38(1)4.付颖丽.雄鹰.于炜婷.刘袖洞.薛伟明.包德才.王一力.马小军海藻酸钠/壳聚糖微胶囊生物相容性的研究期刊论文-自然科学进展2002,12(8)5.谢红国.李晓霞.王锋.谢威扬.马小军海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(ACA)微胶囊的外表粗糙度及其对蛋白吸附的影响会议论文-20206.刘群.薛伟明.于炜婷.刘袖洞.严若媛.李金云.马小军海藻酸钠-壳聚糖微胶囊膜强度

26、的研究期刊论文-高等学校化学学报2002,23(7)7.陈日耀.陈震.陈晓.郑曦.孙婷.CHENRi-Yao.CHENZhen.CHENXiao.ZHENGXi.SUNTing纳米-Fe2O3-TiO2改性海藻酸钠/壳聚糖双极膜制备与表征期刊论文-无机化学学报2020,26(10)引证文献(17条)1.何荣军.杨爽.孙培龙.欧阳润棠海藻酸钠/壳聚糖微胶囊的制备及其应用研究进展期刊论文-食品与机械2020(2)2.孙学战.刘源岗.王士斌.蓝琪高载药量海藻酸钙/几丁聚糖微胶囊的性能期刊论文-化工进展2020(9)3.刘博.张宏亮.薛伟明.齐智涛.田志敏.太琴花载脂肪酶壳聚糖/海藻酸钙微胶囊的制备期

27、刊论文-化工进展2020(8)4.王婷婷.綦文涛.易建明.张晓琳.李爱科.郝淑红微胶囊化屎肠球菌及其特性研究期刊论文-中国畜牧杂志2020(21)5.李瑞欣.马小军.王卫明.王为.赵德伟.郭林.于晓光复合万古霉素海藻酸钠/壳聚糖缓释载体的体内释放实验料期刊论文-中国组织工程研究与临床康复2020(38)6.温惠云.齐智涛.薛伟明.薛美辰.孙维娜.沈艳佐Fe3O4/海藻酸盐微胶囊固定化细胞生长特性期刊论文-食品与发酵工业2020(4)7.张宏亮.薛伟明.赵彬然.刘博.石梅壳聚糖/海藻酸盐微胶囊膜的物质扩散性能研究期刊论文-膜科学与技术2020(2)8.王霞.朱科学.钱海峰.周惠明.顾耀兴微胶囊化

28、葡萄糖氧化酶对面粉烘焙品质的改进研究期刊论文-食品与发酵工业2020(5)9.刘袖洞.于炜婷.王为.雄鹰.马小军.袁权海藻酸钠和壳聚糖聚电解质微胶囊及其生物医学应用期刊论文-化学进展2020(1)10.杨利芳.薛伟明.高茜.万世超.马小军载胰岛素壳聚糖微球口服降血糖作用的研究期刊论文-化学工程2020(1)11.张武杰.李保国.张超.谢鑫荟.汤亭亭载间充质干细胞海藻酸钠-壳聚糖微胶囊的制备及工艺优化期刊论文-细胞与分子免疫学杂志2007(9)12.徐绍霞.张永奎.向海.陈宁.梁颖.黄亚洁包埋氧化亚铁硫杆菌的海藻酸钙凝胶扩散特性研究期刊论文-中国生物工程杂志2007(5)13.刘天军.侯丽雅.章

29、维一.张晓乐基于微喷技术的微胶囊制造实验研究期刊论文-中国机械工程2006(23)14.黄可可.薛伟明.刘袖洞.马小军载胰岛素海藻酸盐微球的生理条件解聚期刊论文-西北大学学报自然科学版2006(6)15.于炜婷.刘袖洞.李晓霞.綦文涛.任东文.马小军壳聚糖溶液pH对载细胞海藻酸钠-壳聚糖微胶囊性能的影响期刊论文-高等学校化学学报2006(1)16.薛伟明.刘袖洞.于炜婷.马小军静电液滴工艺对蛋白质微球载体形态的影响期刊论文-西北大学学报(自然科学版)2005(6)17.于炜婷.雄鹰.刘袖洞.王为.谢威扬.马小军海藻酸钠-壳聚糖微胶囊作为肠道内生化微反响器的研究期刊论文-高等学校化学学报2004(7)本文链接：