缺氧复氧诱导大鼠肾小管上皮细胞内质网应激反应.doc

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1、Comment Editor1: P 为大写 斜体字 母，请全文修改内质网应激在大鼠肾小管上皮细胞缺氧复氧损伤炎症反应中的作用童玉娜，杨聚荣，景 宇，张建国，李开龙，何娅妮(400042 重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所肾内科)摘要 目的目的: 观察大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E 细胞）缺氧复氧损伤时内质网应激蛋白和炎症细胞因子表达的改变及其意义,以探讨缺氧复氧诱导大鼠肾小管上皮细胞内质网应激与炎症反应的关系。方法方法: NRK-52E 细胞用含 5%胎牛血清的 DMEM 液培养于37、5%CO2 恒温培养箱。将细胞分为正常对照组和缺氧/复氧损伤（hypoxia reoxygena

2、tion，H/R）组。采用全自动生化分析仪检测细胞培养液上清 LDH 活性，Western blot 方法检测 GRP78、CHOP 蛋白表达，ELISA 法检测细胞上清 IL- 水平。结果结果: 与对照组细胞培养液上清 LDH（22.071.23）U/L比较，H/R 组（45.936.42）U/L显著增加(P0.05)。与对照组肾小管上皮细胞GRP78 表达(0.800.04)比较, H/R 组(1.240.04)明显增加(P0.05)；与对照组肾小管上皮细胞 CHOP 表达(0.810.05)比较, H/R组 (1.190.05)明显增加(P0.05)。与对照组 IL-1 水平（6.552

3、.03）比较，H/R 组（14.932.26）显著增加(P 0.01)。结结论论: 缺氧复氧可以诱导大鼠肾小管上皮细胞内质网应激与炎症反应。内质网应激上调 CHOP 表达可能在肾小管上皮细胞缺氧复氧损伤炎症反应中具有重要作用。 关键词 缺氧复氧；内质网应激；肾小管上皮细胞；CHOP；炎症Role of endoplasmic reticulum stress in hypoxia/reoxygenation induced inflammation in rat renal tubular epithelial cellsTong Yuna, Yang Jurong , Jing Yu，Zha

4、ng Jianguo，Li Kailong，HE Yani (Department of Nephrology, Institute of Surgery Research, Daping Hospital,Third Military Medical University, Chongqing 400042, China)Abstract Objective To investigate the effect of hypoxia / reoxygenation on endoplasmic reticulum stress（ERS） and inflammatory response in

5、 rat renal tubular epithelial cells（NRK-52E cells）.Methods NRK-52E cells in 10% FBS DMEM culture medium were divided into 2 groups , control group and hypoxia / reoxygenation (H/R) group. Cells in H/R group were exposed to hypoxia for 4 hours and subsequently reoxygenation for 12 hours. LDH in cultu

6、re supernatant was detected by automatic biochemistry analyzer. Western blot was applied to detect the expression of GRP78 and CHOP. IL- 1 in culture medium was detected by ELISA. Results Cell viability was decreased obviously after hypoxia /reoxygenation (P0.05). Compared with untreated cells, the

7、expression of GRP78 and CHOP protein of the cells had increased significantly in the hypoxia / reoxygenation cells (P0.05). The expression of IL-1increased distinctly in the hypoxia / reoxygenation cells(P0.01).Conclusion Hypoxia / reperfusion can induce endoplasmic reticulum stress and inflammatory

8、 response in rat renal tubular epithelial cells. Endoplasmic reticulum stress may be essential in the inflammation of renal tubular epithelial cells induced by hypoxia / reoxygenation.Key words hypoxia reoxygenation; endoplasmic reticulum; stress ; renal tubular epithelial cells；CHOP；inflammationSup

9、ported by the NationalNatural Science Foundation of China (30771002). Corresponding author: He Yani, Tel: 86-23-68757871基金项目 国家自然科学基金(30771002)通信作者 何娅妮,电话: (023) 68757871急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是一种 常见临床综合征，也是危重症患者常见合并症，若AKI 发展至急性肾衰竭(acute renal failure，ARF)，死 亡率可高达50%，并且10-14的急性肾衰竭患者因 肾功能不能恢复而

10、需要终身肾脏替代治疗1。目前认 为，肾脏缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R） 损伤是引起急性肾损伤的重要原因之一，炎症反应是 肾脏缺血再灌注发生、发展进程中重要的病理生理基 础2，其机制尚不明确。以往研究认为，NF-B 信号 途径的激活是缺血再灌注肾损伤的重要机制，但阻断 NF-B 炎症信号途径不能完全阻止缺血导致的肾脏损 害3。近年来的研究发现, 内质网应激通过凋亡途径 促进了脑组织、心肌细胞的缺血再灌注损伤4-5，但其 是否参与肾脏缺血再灌注炎症反应，以及内质网应激在肾脏缺血再灌注炎症反应中的作用与机制，目前尚 未完全阐明。肾小管上皮细胞对缺血缺氧非常敏感， 肾小

11、管是缺血再灌注肾损伤最早和最主要的部位。因 此，本研究通过建立大鼠近端肾小管上皮细胞NRK-52E 的缺氧复氧（hypoxia reoxygenation，H/R）损伤模 型模拟体内肾脏I/R损伤,观察内质网应激蛋白糖调节 蛋白78 (glucose-regulated protein 78, GRP78)、C /EBP 同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein, CHOP)的表达及炎症细胞因子 IL-1水平的变化,初步探讨大鼠肾小管上皮细胞缺氧 复氧损伤炎症反应与内质网应激的关系。1 材料与方法1.1 材料及试剂大鼠肾小管上

12、皮细胞NRK-52E由本室留存，DMEM培养基、胎Comment Editor2: 标题改为”对. 的影响“Comment Editor3: 改文字叙述，数 据以均数加减标准差表示Comment Editor4: 改文字叙述，数 据以均数加减标准差表示Comment Editor5: 直方图删除，改 为文字叙述，以均数加减标准差表示Comment Editor6: 建议删除，文字 与图重复。Comment Editor7: 讨论中结合本研 究的内容太少，文献综述比较多，请 适当增加。牛血清、胰蛋白酶购自美国HyClone公司,兔抗大鼠GRP78多克隆抗体、小鼠抗大鼠CHOP单克隆抗体购自英国A

13、bcam公司,小鼠抗大鼠-actin多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司,辣根过氧化物酶标记山羊抗兔、抗小鼠IgG抗体 、PBS磷酸盐缓冲液购自北京中杉金桥公司,大鼠IL-1ELISA试剂盒购自上海西唐公司,缺氧箱购自美国Billups Rothenberg公司。1.2 细胞培养NRK-52E细胞株用含5%胎牛血清的DMEM培养液于37、5%CO2+95%空气饱和湿度培养箱内培养。1.3 实验方法1.3.1 缺氧复氧细胞模型的制备及细胞分组 根据文献6制备大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）缺氧/复氧（hypoxia reoxygenation，H/R）模型。缺氧前将培养液换成PBS溶液

14、, 将NRK-52E细胞置入含有1%（体积分数）O2+94% N2 +5%CO2 混合气的37 缺氧箱中,缺氧4 h。复氧时，将培养液换为正常培养基，于5% CO2+95%空气饱和湿度培养箱内培养12 h，收集细胞及培养液上清。缺氧前细胞作为正常对照组。实验分为正常对照组和H/R损伤组。1.3.2 细胞活力测定 全自动生化分析仪测定细胞培养液上清乳酸脱氢酶(lactic acid dehydrogenase,LDH)的活性, LDH的活性用U/L表示。 1.3.3 Western blot检测GRP78、CHOP蛋白的表达 收集细胞, 提取蛋白, 考马斯亮蓝法检测蛋白浓度。将含有50g 总蛋白

15、的提取液与4SDS 加样缓冲液混匀, 100 加热7min变性,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至PVDF膜（Pierce公司）上；5%脱脂牛奶室温封闭2 h ,加入一抗GRP78(1:1 000)、CHOP（1：200）,4过夜；TBST缓冲液漂洗10 min3次；加入辣根过氧化物酶标记二抗（1：1 0 000）,室温孵育1 h ；TBST缓冲液漂洗6 min5次后, 暗室中加ECL发光试剂（Pierce公司），X光胶片曝光，常规方法显影、定影。凝胶成像和化学发光分析系统进行灰度分析。以-actin作为内参照, GRP78、CHOP蛋白含量分别用GRP78/-actin、CHOP/-

16、actin表示。1.3.4 ELISA检测IL-1的表达 采用ELISA试剂盒检测细胞培养液上清IL-1水平，IL-1的浓度用pg/ml表示。1.4 统计学分析 数据用sx 表示，采用 SPSS 13.0 统计软件进行独立样本t 检验（双侧）。2 结果2.1 缺氧复氧导致肾小管上皮细胞损伤(图 1)与正常对照组相比，H/R 损伤组细胞培养液上清LDH水平明显升高，为对照组的2.1倍(P0.05)。图1 各组细胞培养液上清LDH水平2.2 缺氧复氧上调对GRP78蛋白表达的影响GRP78在正常对照组细胞有基础水平表达。与正常对照组比较，H/R损伤组肾小管上皮细胞GRP78表达显著增加，为对照组的

17、1.6倍(P0.05)。A图2 Western blot检测各组GRP78的表达2.3 缺氧复氧对CHOP蛋白表达的影响CHOP在正常细胞中表达很低。与正常对照组比较，H/R损伤组肾小管上皮细胞CHOP表达显著增加(P0.05)，为对照组的1.5倍。 见图3。A图3 Western blot检测各组CHOP蛋白的表达 2.4 缺氧复氧上调IL-1水平(图4)IL-1在正常细胞培养液上清的浓度是（6.552.03）pg/ml。与正常对照组比较，H/R损伤组IL-1表达显著增加,高达（14.932.26）pg/ml,为对照组的2.3倍(P0.01)。3 讨论 内质网(endoplasmic ret

18、iculum, ER)是细胞加工 蛋白质和储存Ca2+的主要场所，当细胞对内质网功能的 需求超过其自身能力时出现错误折叠或未折叠蛋白质在腔内聚集以及Ca2+平衡紊乱的状态称为内质网应激( endoplasmic reticulum stress, ERS)。缺血再灌注 损伤时，缺氧、酸中毒, ATP耗竭、钙超载及大量自由 基生成等刺激因素均可诱导ERS7。适度的ERS通过激 活未折叠蛋白反应, 暂时抑制蛋白合成,促进蛋白正确 折叠,增强未折叠或错误折叠蛋白降解,恢复内质网及 内环境的稳态,保持细胞活性8。过强或过长时间的 ERS则启动细胞凋亡或坏死9-10 。CHOP2910342103GRP

19、78-actin4210378103正常对照组 缺氧/复氧损伤组 正常对照组 缺氧/复氧损伤组 -actin近来研究认为，GRP78是内质网应激的经典标志物， 适度ERS和过度ERS都能上调GRP78的表达11。GRP78又 称免疫球蛋白结合蛋白（immunoglobulin binding protein, Bip），是内质网伴侣蛋白,它在维持内质网 蛋白质合成、正确折叠及细胞钙稳态方面起重要作用12。小鼠肾脏缺血再灌注和大鼠心肌、脑缺血再灌注均可激活内质网应激，上调GRP78表达13-15。本实验在 大鼠肾小管上皮细胞H/R组观察到GRP78蛋白表达上调, 表明缺氧复氧可以诱导肾小管上皮细

20、胞内质网的应激 反应。 CHOP又称生长停滞及DNA损伤诱导基因 153（growth arrest and DNA damage inducible gene 153，GADD153)，是内质网源性转录因子，属 C/EBP转录因子家族成员，正常情况下存在于细胞质内 表达量很低, 但在内质网应激情况下其表达上调并转 位至细胞核, 调控靶基因表达，介导细胞凋亡、调节 细胞分化以及促进ROS产生等16。因此，CHOP被认为是 ERS信号途径中非常重要的调控因子。研究发现，大鼠 心肌和脑缺血再灌注均可激活过度内质网应激,上调 CHOP表达,细胞凋亡明显增多,组织病理损伤加重,同时 出现器官功能障碍1

21、4-15；CHOP基因敲除小鼠由ERS诱导 的肾小管上皮细胞凋亡明显减轻13。最近研究发现， 内质网应激活化CHOP在炎症的发病机制中发挥重要作 用17-19 。在CHOP基因敲除小鼠LPS诱导的肺炎以及胰 腺炎动物模型中炎症细胞因子释放和组织损伤明显轻 于野生型小鼠。而细胞水平的研究同样观察到氧糖剥 夺诱导星形胶质细胞发生过度ERS,CHOP表达增加，通 过下游caspase-11分子引起细胞炎症反应和凋亡，最 终导致细胞死亡20 。本研究表明，缺氧复氧损伤能显 著增加肾小管上皮细胞CHOP蛋白的表达，提示缺氧复 氧可能通过ERS诱导肾小管上皮细胞CHOP的表达。 IL-1是炎症反应早期产生

22、的促炎细胞因子，具 有放大炎症反应瀑布的重要生物学作用，在急性缺血 性肾损伤的发生发展中扮演了重要角色。研究发现， 在内毒素肺损伤、急性胰腺炎以及结肠炎等疾病状态 下，过度内质网应激通过上调CHOP表达激活炎症 caspase途径，活化IL-1转化酶(caspase-1)，进而 促进IL-1前体活化为成熟IL-1。本研究在大鼠肾 小管上皮细胞H/R伤组观察到IL-1显著增加，表明缺 氧复氧可以诱导肾小管上皮细胞炎症反应。 综上所述, 我们认为：缺氧复氧激活内质网应激， 可能通过 CHOP 上调 IL-1 表达，导致大鼠肾小管上 皮细胞发生炎症反应，这可能是急性缺血性肾损伤发 生的重要机制。本研

23、究为进一步探讨 ERS 尤其是 CHOP 分子在缺氧复氧炎症反应中的作用打下基础。参考文献：1 Bagshaw S.M. Epidemiology of renal recovery after acute renal failure J. Curr Opin Crit Care, 2006, 12(6):544-550.2 Thurman J.M. Triggers of inflammation after renal ischemia/reperfusion J. Clin Immunol, 2007, 123(1): 7-13.3 Chang C C, Ding X Q, ZHOU L

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