前言和文献综述.doc

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1、1疫苗免疫毒性评价方法研究疫苗免疫毒性评价方法研究刘丽1，林志1，屈哲1，刘晓萌1，孙立1，王超1，姜华1，苗玉发1，杨艳伟1，齐香荣2，魏东3，卢锦标3，王秀文1，汪巨峰1，李波3 *(1.中国食品药品检定研究院 国家药物安全评价监测中心，药物非临床安全评价研究北京市重点实验室，北京 100176；2中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京，102206；3.中国食品药品 检定研究院，北京 100050) 通讯地址：北京亦庄开发区宏达中路甲 8 号 邮编：100176 Tel：010-67872233-8312* 责任作者，Email：摘要：目的摘要：目的:免疫毒性是疫苗临床前安全性研究关

2、注的重点，但目前对疫苗的免疫毒性 评价仍处于探索阶段，国内外相关指导性文件中多为原则性的建议和概括性的理论指 导，缺乏具体的评价方法和评价体系。另外，新型疫苗产品由于作用机制、组成成分 及制备工艺的新颖性和复杂性，可能带来额外的安全性担忧，对现有疫苗安全性评价 方法形成了很大挑战。本研究拟通过对三种不同类型新型疫苗/佐剂进行以免疫毒性为 重点的非临床安全性评价，初步建立疫苗免疫毒性研究的评价方法和评价策略，并通 过对不同类型疫苗评价结果的比较，为同类疫苗或佐剂的安全性研究提供参考。方法方法: （1）针对疫苗可能引起的免疫刺激、免疫抑制、超敏反应和自身免疫等免疫毒性作用， 从组织器官水平（脾脏、

3、胸腺、骨髓、注射局部引流和非引流淋巴结、局部淋巴组织 的病理学检查） 、细胞水平（不同亚型免疫细胞比例变化、血液白细胞计数）和分子水 平（细胞因子检测和血清白蛋白、球蛋白、免疫球蛋白、补体检测）进行了评价方法 研究，并对一种新型细菌疫苗（鼠疫亚单位疫苗） 、一种基因重组病毒疫苗（复制缺陷 型天坛株痘苗病毒天花疫苗，简称 NTV 疫苗）和一种新型佐剂（含 CpG 基序的单链 寡聚脱氧核苷酸，CpG 684）进行了系统的免疫毒性研究。 （2）对疫苗免疫毒性评价的 重点指标建立新的检测方法并进行多种方法的比较，包括：1）应用固相酶联免疫斑点 技术（ELISPOT 法） 、流式细胞术细胞内染色法和流式

4、微球技术（cytometric bead array, CBA）三种方法检测细胞因子，并进行方法学和适用性的比较。2）建立抗原特异性 IgE 的检测方法，将过敏相关临床症状观察、血清总 IgE 检测和抗原特异性 IgE 检测、 豚鼠致敏实验结合起来进行疫苗整体或疫苗所含特异性抗原致敏性的评价，并摸索疫 苗免疫后血清 IgE 的适宜检测时间点。3）同时应用免疫荧光法和 ELISA 法进行血清抗 核抗体（ANA）检测，并进行方法学比较。结果结果:免疫毒性评价方法研究结果：（1） 分别从组织器官水平、细胞水平和分子水平进行免疫刺激性/免疫抑制的评价，并进行 超敏反应和自身免疫的评价，可较为全面、系统

5、地进行疫苗的免疫毒性研究。 （2）三 种细胞因子检测方法的比较研究：ELISPOT 法与细胞内染色流式法测定结果一致性较 好，前者灵敏度更高，而细胞内染色流式法可以选择特定细胞进行细胞因子分泌检测， 具有更好的分析细胞特异性，两种方法对检测时间点的要求不是很严格，易于在疫苗 的重复给药毒性研究中结合进行。流式细胞术 CBA 法检测血清中细胞因子的效果欠佳， 且不适于进行 IFN- 检测，应用受到一定限制。 （3）将临床症状观察、总 IgE 检测、 抗原特异性 IgE 检测和豚鼠致敏实验结合起来是进行疫苗整体或特异性抗原致敏性评 价的较好方法，血清 IgE 检测应在可能引起过敏反应的再次免疫前进

6、行。 鼠疫疫苗、2NTV 疫苗和 CpG 684 佐剂免疫毒性研究的主要发现：（1）具有较强细胞免疫作用的 NTV 疫苗和 CpG 684 均引起动物可逆性的脾脏重量增加，CpG 684 引起轻度的脾脏白 髓内细胞密集和扩张的组织病理学改变；而以体液免疫为主的鼠疫疫苗未对脾脏重量 和病理形态学产生明显影响。三种疫苗/佐剂均未引起胸腺重量的变化、未对骨髓产生 影响。NTV 疫苗和 CpG 684 均引起给药动物腹股沟淋巴组织出现明显的炎症性反应。 （2）NTV 疫苗和鼠疫疫苗未对动物外周血 CD4+、CD8+ T 细胞的比例和二者比值产生 明显影响；三种疫苗/佐剂引起外周血各类白细胞数量可逆性变

7、化，无一致性规律，与 各自免疫特点有关。 （3）鼠疫疫苗仅引起较低水平的 IFN- 和 IL-2 分泌；NTV 疫苗可 诱导 IFN- 分泌显著增加；流式细胞术 CBA 法仅检测到 CpG 684-乙肝疫苗免疫大鼠和 食蟹猴血清中低水平的 Th1/Th2 型细胞因子。三种疫苗/佐剂对血清白蛋白、球蛋白和 总蛋白水平的影响不同。 （4）鼠疫疫苗和 CpG 684 未引起过敏反应，NTV 疫苗和溶媒 引起小鼠和豚鼠明显的过敏反应，抗原特异性 IgE 检测结果不提示 NTV 病毒本身具有 致敏性。 （5）血清抗核抗体检测结果不提示三种疫苗/佐剂在相应的实验动物诱导自身 免疫反应。结论结论:（1）疫苗

8、免疫毒性评价的共性考虑：一般应从可能引起的免疫刺激 性、超敏反应、自身免疫和免疫抑制等方面进行疫苗免疫毒性评价，并以前三方面为 研究重点。在研究时应从免疫组织器官水平、免疫细胞水平和分子水平等不同层次进 行系统研究。另外需根据不同种类疫苗的自身特点，进行安全性评价的特殊考虑。对 含人血白蛋白的疫苗在评价时应对过敏反应进行重点关注，并评价疫苗抗原本身是否 有致敏作用。对具有较强细胞免疫作用的疫苗应重点关注其对脾脏重量和组织病理学 的影响，并对细胞因子分泌水平进行重点监测。 （2）临床前毒性研究中，脾重增加可 作为细胞免疫增强的一个提示指标，脾脏白髓细胞密度的变化对细胞免疫增强的提示 作用不明显。

9、 （3）三种细胞因子检测方法有各自优缺点和适用性，应根据具体情况选 择应用。 （4）将临床症状观察、总 IgE 检测、抗原特异性 IgE 检测和豚鼠致敏实验结 合起来进行疫苗整体或特异性抗原致敏性的评价是较好的评价方法。血清 IgE 检测应 在可能引起过敏反应的再次免疫前进行。 （5）可应用免疫荧光法和 ELISA 法进行血清 抗核抗体（ANA）检测，评价疫苗致自身免疫的风险。 （6）本研究初步建立了疫苗免 疫毒性研究的评价方法和评价系统。关键词关键词：疫苗；非临床安全性评价；免疫毒性；NTV疫苗；鼠疫疫苗；新型佐剂； CpG 6843疫苗是通过抗原诱导免疫系统产生特异性体液免疫反应和/或细胞

10、免疫反应发挥作用，因此其最主要的潜在毒性来自与免疫系统相关的毒性，免疫毒性评价是疫苗临床前安全性研究关注的重点，而现有的指导原则仅对疫苗的免疫毒性研究提供了一些原则性的建议，如WHO、EMEA和我国的疫苗非临床研究指导原则中涉及到免疫毒性研究的内容均很少，只是提出对免疫组织和器官进行病理学检查、在某些情况下应考虑对疫苗致自身免疫和超敏反应的作用进行检测，但均未提出具体的评价指标和评价方法。国内外对疫苗进行系统免疫毒性研究的相关文献也很少，疫苗的免疫毒性研究仍处于探索阶段。此外，随着生物技术和免疫学的发展，许多新型疫苗，如亚单位疫苗、基因重组疫苗、DNA疫苗和病毒载体疫苗等不断涌现。这些疫苗由于

11、作用机制、组成成分及制备工艺的新颖性和复杂性，与传统疫苗相比，可能带来额外的安全性方面的担忧。在实际应用中，也确实有一些毒副作用发生，如基因重组Lyme疫苗被发现可导致自身免疫性关节炎，还有些疫苗可引起或加重系统性红斑狼疮、多发硬化、脱髓鞘病等。鉴于疫苗研究开发的飞速发展，现有的疫苗评价指导原则已不能满足要求，对现有的评价技术和方法也形成了挑战。因此如何确定疫苗免疫毒性研究的重要评价指标和方法、如何选用新技术和新方法对不同类型的新型疫苗和佐剂进行系统的免疫毒性研究、建立适用的评价体系，以最大限度地保证疫苗的安全性是国内外疫苗非临床毒性研究中亟待解决的课题。鼠疫亚单位疫苗是一种由鼠疫耶尔森菌F1

12、抗原和重组V抗原构成的新型鼠疫疫苗，它能够克服传统疫苗的许多缺陷，不含感染性组分。NTV疫苗是一种通过基因重组技术获得的复制缺陷型天坛株痘苗病毒天花疫苗，NTV病毒在人体不能有效繁殖，但与原天坛株痘苗病毒有相近的免疫效果。这两种疫苗均属于国际上的研究热点，具有较好的开发优势，目前国外研究的两种鼠疫亚单位疫苗均处于临床前或临床研究阶段，NTV疫苗则尚未进行系统的毒性研究，因此缺乏足够的安全性数据。近年来CpG ODN因其强大的免疫刺激作用成为被广泛研究的一种新型佐剂，但对其安全性也存在较大的担忧。CpG 684是一种我国自主研发的B型CpG ODN，对其尚未进行系统的毒理学研究。以上三者属于不同

13、类别的创新型疫苗或佐剂，有各自的免疫学特点和潜在毒性特点。本研究以上述三种疫苗/佐剂为研究对象，进行了系统的疫苗免疫毒性评价方法研究，包括免疫刺激性、超敏反应、自身免疫和免疫抑制等方面，并以前三方面为研究重点。在研究时从免疫组织器官、免疫细胞和分子水平进行不同层次的相关评价，对重点评价指标建立新的研究方法并进行方法学比较和适用性研究。通过以上研究初步建立疫苗免疫毒性研究的评价方法和评价体系，并对新型鼠疫疫苗、NTV疫苗和CpG 684佐剂进行了系统的免疫毒性研究，通过对其评价结果的比较，为同类疫苗或佐剂的安全性研究提供参考。4材料和方法材料和方法1 受试物、对照品和主要试剂受试物、对照品和主要

14、试剂鼠疫亚单位疫苗：采用鼠疫菌 EV 株培养、提取、纯化 F1 抗原制成 F1 抗原原液；采用大肠杆菌 pET-V/BL21(DE3)株培养、提取、纯化 V 抗原制成重组 V 抗原原液；两种原液按照一定比例混合并经氢氧化铝吸附，加入硫柳汞防腐剂后制成疫苗。每支（1ml）疫苗含鼠疫菌 F1 抗原和 V 抗原各 15ug，临床拟免疫途径为肌肉注射，每次用1ml，全程免疫共 2 针，间隔 2 周。实验所用鼠疫亚单位疫苗批号为 20100401，为乳白色混悬液体，可因沉淀而分层，易摇散，西林瓶包装，1mL/支，在 28条件下避光保存，由兰州生物制品研究所生产和提供。对照品为生理盐水，批号：100316

15、41，生产厂家为天津药业焦作有限公司，室温保存。 NTV 疫苗：复制缺陷型天坛株痘苗病毒天花疫苗（Non-replicated Tiantan Strain Vaccinia Virus Smal lpox Vaccine） ，简称 NTV 疫苗。NTV 病毒是在我国用于预防天花的天坛株痘苗病毒基础上，参考 Copenhagen 株痘苗病毒序列，通过基因重组技术，从天坛株痘苗病毒基因组 HindIII 内切酶标记的 C 到 K 片段中去除了与宿主范围及毒力相关的 26 个基因，共约 21Kb 序列，构建成功的复制缺陷型天坛株重组痘苗病毒，已获得专利授权号。该病毒在鸡胚细胞中保持了良好的繁殖能力

16、，可产生高滴度病毒，在人体或人源细胞中不能有效繁殖，不产生或仅产生极低滴度的子代病毒，但却保留了与原天坛株痘苗病毒相近的 DNA 复制、RNA 转录与蛋白翻译功能。NTV 疫苗由北京天坛生物制品股份有限公司生产和提供，批号 20081201，为乳白色疏松体（由 0.5 mL 病毒液冻干而成） ，在-80-60条件下保存，主要成分为痘苗病毒 2.4108pfu/剂（瓶） 、麦芽糖 5%、明胶 0.4%、人白蛋白 0.4%和 PBS。使用前用注射用水溶解冻干粉，稀释使用时用生理盐水（0.9% NaCl 注射液）进行稀释。NTV 疫苗溶媒为除 NTV 病毒外的疫苗成分，为乳白色疏松体，批号 2010

17、0301，使用前用注射用水溶解。生理盐水和注射用水为天津药业焦作有限公司生产。CpG 684：是由二十三个碱基构成的单链寡核苷酸，合成时全部硫化处理，为 B型 CpG ODN。CpG 684 由国内自主研发，其核苷酸序列为 5tcg acg ttc gtc gtt cgt cgt tc3，是与其它在研 CpG ODN 不同的特定序列，已申请美国和中国的专利。CpG 684 可以有效地刺激 DC 和 B 细胞，目前被用作乙肝疫苗和狂犬疫苗的佐剂进行研究。受试物 CpG 684 三个浓度：25g/mL；100g/mL；750g/mL；均为无色透明溶液，灭菌玻璃管包装，批号：070831。28条件存

18、放，云南沃森生物技术有限公司提供。对照品为 0.9%氯化钠注射液，批号 07090701，生产厂家为云南宏泰制药有限公司。5主要试剂：猴 IFN- ELISPOT 试剂盒、猴 IL-2 ELISPOT 试剂盒，购自 U-Cytech biosciences。ELISpotPLUS for Mouse Interferon- 购自 MABTECH 公司。Monkey IgE ELISA Kit、HRP 酶标山羊抗猴 IgG 购自 Alpha Diagnostic Intl.Inc.。Mouse IgE ELISA Kit 购自美国 ICL 公司。抗核抗体 IgG 检测试剂盒（间接免疫荧光法） ，

19、批号为F110412YB 和 F110407YD，购自欧蒙（杭州）医学实验诊断有限公司。F1 抗原(批号20091002)和 V 抗原(批号 20091101) 由兰州生物制品研究所提供。CD28/CD49d Costimulatory Reagent 购自 Biolegend 公司。大鼠的 IL-6 、TNF- 和 IFN- 的 CBA Flex Set、Non-human Primate Th1/Th2 Cytokine Kit、Percp Mouse anti-human CD3 (批号50392、73100)、PE Mouse anti-human CD4 (批号 59586、7369

20、3) 、FITC Mouse anti-human CD8 (批号：41332), 生产厂家均为 BD Pharmingen。FITC 标记二抗：Anti-MONKEY IgG (gamma chain) (GOAT) Antibody Fluorescein Conjugated，Rockland 公司生产，批号为 21253。F1 抗原(批号 20091002)和 V 抗原(批号 20091101)，由兰州生物制品研究所提供。HRP 酶标山羊抗猴 IgG, 批号 XB1402-L，生产厂家 Alpha Diagnostic Intl.Znc。BD PharmLyse (10)、Anti m

21、onkey CD3-FITC、Anti monkey CD4-PerCP/Cy5.5、Anti monkey IFN-Alexa Fluor 647、Anti monkey IL-2-PE、FITC 同型对照、PerCP/Cy5.5 同型对照、Alexa Fluor 647 同型对照、PE 同型对照均为 BD 公司产品。小鼠 CD4+、CD8+ T 细胞测定所用抗体：PE Hamster Anti-Mouse CD3e（批号：52089） ，PerCP Rat Anti-Mouse CD4（批号：28744） ，FITC Rat Anti-Mouse CD8a（批号：38609） ，购自 BD

22、 Pharmingen, U.S.A.。TMB 底物液和终止液均购于英科新创科技有限公司。MOUSE IgE KAPPA 和 Rat Anti-Mouse IgE-BIOT（单克隆抗体）购自Southernbiotech, U.S.A.。FITC 标记兔抗小鼠 IgG 购自 Rockland 公司。小鼠阳性血清（MRL-faslpr/J 小鼠血清）购自南京大学模式动物研究所2 主要仪器主要仪器Champ Spot III 型 ELISPOT 分析仪，FACSCalibur 流式细胞仪，SPECTRAmax-PLUS 型酶标仪，日立 7060 型全自动生化分析仪，ADVIA12 血细胞分析仪，普

23、通光学显微镜，Nikon ECLIPSE-80i D-FL 荧光显微镜，洗板机，37温箱3 实验动物和研究设计实验动物和研究设计鼠疫疫苗研究：共使用 20 只食蟹猴，年龄 2-3 岁，购入时体重：雌性 1.98-2.60kg，雄性 2.28-2.68 kg，由广东省高要市康达实验动物科技有限公司提供，许可证号：SCXK(粤)2009-0009。实验过程中饲养室温度为 19.33-27.78；相对湿度为 37.82-88.01%，换气次数 8-10 次/小时，每 12 小时明暗交替。饲养笼具为 3042B 不锈钢金属丝网笼（LWH：9070116 cm） ，每日清洗，饲养密度为 1 只/笼。动物

24、自由饮水，每日两次定量给予膨化猴料和水果各约 150g，自由摄取 (在动物解剖前禁食过夜)。检疫 3 周后，根据动物体重按分层随机化分组法进行分组，雌、雄动物分别分组，同时6采用项圈挂牌标号和动物编号标识动物。动物分为 3 组：生理盐水对照组、疫苗低剂量组（F1 抗原和 V 抗原各 15g）和疫苗高剂量组（F1 抗原和 V 抗原各 30g） 。疫苗低、高剂量组每组 8 只动物，生理盐水对照组 4 只动物，均雌雄各半。大腿部肌肉注射给药，在第 0、2、4、6 周各给药 1 次，共给药 4 次，疫苗低剂量组给药体积为1mL/只，均在左侧大腿部注射；生理盐水对照和疫苗高剂量组每次给药体积为 2mL/

25、只，双侧大腿分别注射，每侧注射 1mL。实验期间进行各项观察和测定，末次给药后 3 天和末次给药后 3 周分别对每组半数动物进行解剖和病理学检查。NTV 疫苗研究：实验使用 BALB/c 小鼠 336 只，雌、雄各半，SPF 级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2006-0009。使用时 7-8 周龄，体重范围：雌性 18.219.8g；雄性 20.722.3g。动物在屏障系统饲养，实际温度为19.15-23.58，相对湿度为 39.72-66.72%，12 小时明暗交替照明。饲料为钴60放射灭菌鼠全价颗粒饲料，不限量自由摄取（在动物解剖前禁食过夜） 。饮水瓶

26、不间断供给高压蒸汽灭菌水，自由摄取。饲料和饮水检测结果均符合国家标准。动物检疫与适应环境 5 天，然后根据动物体重按分层随机化分组法进行分组，雌、雄分别分组。肌肉注射给药，双侧后肢两点注射，总给药体积为 0.25mL/只，在第 0、2、4、6 周各给药 1次，共给药 4 次。研究设计如下表：检测时间和动物数检测时间和动物数项目组别项目组别 （检测（检测项目）项目）剂量组别剂量组别首次给药后 2 天（无解剖和病理）末次给药后 2天（A 组首次解剖）末次给药后 3 周（A 组二次解剖）生理盐水对照组5/55/55/5溶媒对照组5/55/55/5NTV 疫苗组: 5106pfu/只5/55/55/5

27、NTV 疫苗组: 5107pfu/只5/55/55/5A 组组(症状、刺激性、体重、摄食量、血清生化和病理)合计40 只40 只40 只生理盐水对照组5/55/55/5溶媒对照组5/55/55/5NTV 疫苗组: 5106pfu/只5/55/55/5NTV 疫苗组: 5107pfu/只5/55/55/5B 组组(血液学、CD4/8 和组织分布测定)合计40 只40 只40 只检测时间和动物数项目组别 （检测项目）剂量组别第 3 次给药当天末次给药当天末次给药后 3 周末次给药后 6 周生理盐水对照组3/33/33/33/3溶媒对照组3/33/33/33/3NTV 疫苗组: 5106pfu/只3

28、/33/33/33/3NTV 疫苗组: 5107pfu/只3/33/33/33/3C 组组(免疫学测定：抗体、中和抗体、抗核抗体、抗原特异性 IgE 和 IFN-测定)合计24 只24 只24 只24 只CpG 684 研究：实验共使用 120 只 SD 大鼠，购入时 7-8 周龄，体重范围：雄性209.1242.2g， 雌性 171.5201.5g，购自中国药品生物制品检定所实验动物中心，生产许可证号 SCXK(京)2005-0004。实验设置 4 个组别：溶媒对照组、低剂量（5 g/只）7组、中剂量（20 g/只）组及高剂量（150 g/只）组。每组 30 只动物，雌雄各半。动物在屏障系统

29、饲养，实验过程中实际温度 19.9522.55，实际湿度 44.2579.7%，换气次数：1020 次/小时，12 小时明暗交替照明，PC 聚碳酸酯鼠盒（L W H: 460 315 210 mm）饲养，每笼 2-3 只。饲料为钴60放射灭菌鼠全价颗粒饲料，不限量自由摄取（在动物解剖前禁食过夜） 。饮水瓶不间断供给高压蒸汽灭菌水，自由摄取。饲料和饮水检测结果均符合国家标准。动物检疫与适应环境 7 天，然后根据动物体重按分层随机化分组法进行分组，雌、雄分别分组。三个剂量分别为 5g/只，20g/只和150g/只，按大鼠平均体重 300g 计，即分别相当于 17g/kg, 67g/kg 和 500

30、g/kg，分别约为人用剂量的 2 倍、8 倍和 60 倍。肌肉注射给药，每天给药 1 次，给药体积为0.2mL/只，连续给药 28 天，恢复期 3 周(21 天)。在给药结束对每组 20 只动物进行剖检，恢复期结束时对每组 10 只动物进行剖检。在细胞因子检测时，在对流式细胞术CBA 法进行方法学评价时，应用了以 CpG 684 为佐剂的乙肝疫苗，分别在第0、2、4、6 周免疫大鼠和食蟹猴，均设低、高剂量，分别为（50g CpG ODN+10g HBsAg）/只和（500g CpG ODN+10g HBsAg）/只，在首次免疫后 1 周、第 3 次免疫后 1 周、末次免疫后 4 周采取血清进行

31、细胞因子测定。4. 各项免疫毒性检测方法各项免疫毒性检测方法4.1 免疫器官水平研究免疫器官水平研究对鼠疫疫苗、NTV疫苗和CpG 684实验动物均进行了免疫器官脾脏和胸腺的称重，对脾脏、胸腺、骨髓、注射局部引流淋巴结（腹股沟淋巴结）和非引流淋巴结（肠系膜淋巴结） 、局部淋巴组织进行大体病理学、组织病理学检查。4.2 免疫细胞水平研究免疫细胞水平研究CD4+、CD8+ T 细胞测定：用 FACS calibur 流式细胞仪进行 CD4+、CD8+ T 细胞测定，按照相关 SOP 进行流式细胞术检测动物外周血淋巴细胞表型的样本制备。用流式细胞仪收集一定数量的细胞，计数 CD4+ 和 CD8+ 细

32、胞个数，用 Cellquest 软件分析CD4+和 CD8+ 细胞占淋巴细胞的比例，并计算 CD4+、CD8+ 细胞的比值。该项测定在鼠疫和 NTV 疫苗实验中进行。血液总白细胞计数和白细胞分类（中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞）计数：在两种疫苗和佐剂的毒性研究中用血细胞分析仪进行外周血总白细胞计数和白细胞分类计数。4.3 免疫分子水平研究免疫分子水平研究细胞因子测定：疫苗免疫后细胞因子的测定既是对细胞免疫反应的检测，也同时被用作免疫毒性的评价指标，因为过高的细胞因子分泌会引起不良免疫刺激，给机体带来损伤。分别用酶联免疫斑点技术（ELISPOT）和细胞内染色流式法检测

33、鼠疫疫苗免8疫后外周血淋巴细胞分泌IFN-和IL-2的情况；用流式细胞术微球阵列法（cytometric bead array, CBA）检测以CpG 684为佐剂的乙肝疫苗免疫大鼠后血清IFN-、IL-6和TNF-（Flex Set）的水平及CpG 684-乙肝疫苗免疫猴后血清Th1/Th2细胞因子IFN-、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和TNF-（CBA Kit）的水平。血清免疫球蛋白、补体水平检测：生化分析仪检测两种疫苗和佐剂给药后血清白蛋白、总蛋白水平，计算球蛋白水平，在鼠疫疫苗实验中检测免疫球蛋白亚型IgG、IgM、补体C3、C4水平。4.3.1 鼠疫疫苗：猴外周血淋巴细胞分

34、泌鼠疫疫苗：猴外周血淋巴细胞分泌IFN-、IL-2的检测的检测4.3.1.1 ELISPOT 方法检测方法检测 IFN-、IL-2 分泌分泌检测时间点：首次给药前，第 2、3 次给药后 3 天，末次给药后 2 天，末次给药后 3 周检测方法：ELISPOT 法检测样本：猴外周血1) 抗凝全血制备：经前臂静脉取猴血 2.5-3.0mL，肝素抗凝，备用。2) 将 ELISPOT 板按照说明书 25l 70%乙醇室温浸润 1 分钟，然后甩掉乙醇，用无热源的 PBS 洗板 2 次，200l/孔/次，在灭菌纸上排干，然后加稀释好的包被液 50l/孔，盖好盖子，4过夜。3) 用巴氏吸管取肝素钠抗凝血 2.

35、0ml，经 2.0ml 生理盐水稀释一倍，分别取 2.0 ml 稀释血液缓缓加到 3.5ml 淋巴细胞分离液液面上，每只动物两管。4) 平衡后，2000g，20，水平离心 30 分钟，将加减速设为 0。5) 小心取出离心管，用巴氏吸管轻轻吸出淋巴细胞层，放入另一装有 8ml 1640 培养液（室温）的离心管中，300g，20，水平离心 10 分钟，将加减速设为 5。6) 将离心后上清倒掉，用手弹击管底，使细胞悬起，再加入 3ml 1640 培养液（室温） ，300g，20，水平离心 10 分钟，将加减速设为 5。7) 将离心后上清倒掉，用手弹击管底，使细胞悬起，再加入 12ml 1640 完全

36、培养液，混匀，室温备用。8) 弃去包被液，用无热源的 PBS 洗 ELISPOT 板 3 次，200l/孔/次，然后加封闭液，200l/孔，371 小时。9) 细胞计数：使用细胞计数板或 viacount 试剂染色 5 分钟后流式计数。10)调整细胞浓度：根据计数结果，用 1640 完全培养液（含双抗）将浓度调到 2.0106个细胞/ ml。11)弃封闭液，相应孔中加入适当浓度的刺激物 50l，然后加入 100l 细胞，盖上盖子，置 5%CO2 37培养 18-20 小时。12)用力甩弃细胞，用平衡至室温的 PBS 洗 2 次，200l/孔/次，用洗液洗 5 次，250l/孔/次。13)弃洗液

37、，加入生物素结合检测抗体，100l/孔，用封板膜封板，37孵育 1 小时。914)弃检测抗体，去除底托，用洗液洗正反两面洗板 5 次。15)每孔中加入 100l 酶连亲和素，用封板膜封板，37孵育 1 小时。16)弃酶连亲和素，用洗液洗正反两面洗板 5 次。17)每孔中加入 100l 底物显色液，盖上盖子，室温避光孵育 25 分钟，注意防止显色过度。18)用去离子水冲洗板子正反两面，终止显色。19)室温干燥，读板。20)计算每 1106细胞中产生 IFN-/ IL-2 的细胞数。4.3.1.2 细胞内染色流式方法细胞内染色流式方法检测检测 IFN-、IL-2 分泌分泌检测时间点：首次给药前，第

38、 2、3 次给药后 3 天，末次给药后 2 天，末次给药后 3 周检测方法：细胞内染色流式方法检测样本：猴外周血具体检测步骤：1)每只动物取肝素钠抗凝血与等量的 1640 培养基混匀，加入抗原刺激物及 CD28/ CD49d Costimulatory Reagent，37，5% CO2 培养箱孵育 8 h；8h 后，加入BFA，混匀，继续培养 11 h。2)红细胞裂解每个流式管中加入 3ml 稀释好的 1BD PharmLyseTM 红细胞裂解液，混匀后避光孵育 10 分钟，裂解红细胞。350 g，5 min 离心，弃上清。3)细胞染色4)取荧光抗体 CD3-FITC 和 CD4-PerCP

39、/Cy5.5 各 10L/管，单阳管（1、2）分别加入CD3-FITC/ CD4-PerCP/Cy5.5 各 10 L。室温避光孵育 20 分钟。同型对照中加入对照荧光抗体各 10L/管，混匀。5)加入 2ml 细胞洗液（0.01MPBS+1%FBS pH7.4）混合均匀后，350 g，5 min 离心，弃上清。6)固定：加入 0.5 mL Fixation/Permeabilization solution 重悬细胞，室温暗处静置 20 min。350 g，5 min 离心，弃上清。7)破膜：加入 2 mL 1 BD Perm/WashTM buffer 洗涤重悬细胞，室温暗处静置 10 m

40、in，350 g，5 min 离心，弃上清。8)胞内染色：每管用 50L 1 BD Perm/WashTM buffer 重悬细胞，每管加入 5L IFN-Alexa Fluor 647 与 20L IL-2-PE 荧光抗体，混匀，室温暗处静置染色 30 min。i.单阳管（3、4）分别加入 IFN-Alexa Fluor 647 荧光抗体 5L 和 IL-2-PE荧光抗体 20L。10ii.同时取 IFN- 的同型对照荧光抗体 5L 与 20L IL-2 同型对照荧光抗体混合，室温暗处静置染色 30 min。9)加入 1mL 1 BD Perm/WashTM buffer 洗涤细胞，350

41、g，5 min 离心，弃上清。每管加入 300L PBS，振荡重悬细胞 4避光保存，上流式细胞仪检测。10) 计算产生 IFN-/ IL-2 的细胞占 CD3CD4 双阳性细胞百分率。4.3.2 NTV疫苗：疫苗：ELISPOT法检测脾脏淋巴细胞分泌法检测脾脏淋巴细胞分泌IFN-、IL-2 检测时间点：第 3 次给药当天、末次给药当天、末次给药后 6 周。样本：小鼠脾脏淋巴细胞检测方法和原理：ELISPOT 法，检测原理见下图。操作步骤：操作步骤：分离分离脾脏单个核细胞（脾脏单个核细胞（SMNC）：）：1) 取各组待取脾小鼠，在预定的免疫检测点对相应的小鼠采完血后脱臼处死小鼠，喷 75%乙醇消

42、毒处理 23min。 2） 无菌条件下在超净台中取出脾脏，培养皿中加入 5ml 无血清的 RPMI1640（含 P/S, 2mM 的谷氨酰胺） ，并将无菌铜网（200 目）置于其中。然后将脾脏放在铜网上，用注射器针栓在铜网上摩擦脾脏直至留下白色结缔组织。3） 移去铜网及白色结缔组织。用巴氏管轻轻吹打开脾脏单个核细胞（SMNC） ，将SMNC 转移到 15ml 无菌离心管中，1000rpm，离心 5min。114） 弃掉上清，利用残余液体用手轻轻震荡重悬细胞。加入 2ml 红细胞裂解液（10mM KHCO3，0.1mM EDTA，0.15M NH4Cl，用 HCl 调 pH 值至 7.2-7.4

43、，0.22m 滤器过滤除菌，4保存）重悬细胞，室温裂解 4min，其间不时地摇动。5） 加入 10ml RPMI1640 培养基（含 P/S, 2mM 的谷氨酰胺，10% FCS） ，1000rpm，离心 5min，弃掉上清。6） 最后用 2ml RPMI1640 培养基重悬细胞，所得的细胞即为 SMNC。Mouse IFN- ELISPOT 检测：检测：1）封闭预包被的板子（无菌条件下）i 将 ELISpot 板子取出，用灭菌 PBS 洗 4 次（200l/孔） 。ii 用含 10% FCS 的细胞培养液进行封闭（200l/孔） ，室温孵育30 分钟。2）细胞孵育（无菌条件下）i. 弃封闭液

44、，用细胞培养液稀释刺激物痘苗病毒（NTV 病毒） ，终浓度2106pfu/ml，每孔加入 50l。ii. 用细胞培养液将细胞悬液稀释到合适浓度，每孔加入 100l。iii. 将板子置于 37，5%CO2孵箱孵育 1248h。注意在此过程中应采取措施避免试剂蒸发（如可用铝箔包住板子） 。3）检测斑点i. 弃掉细胞液，用 PBS 洗 5 次，200l/孔。ii. 用含 0.5%胎牛血清(FCS)的 PBS 稀释检测抗体(R4-6A2-biotin) 到 1g/ml, 然后每孔加入 100l，室温孵育 2h.iii. 弃掉检测抗体溶液，用 PBS 洗 5 次，200l/孔。iv. 用含 0.5%胎牛

45、血清的 PBS 稀释 Streptavidin-ALP(1:1000), 然后每孔加入 100l，室温孵育 1h。v. 弃掉溶液，用 PBS 洗 5 次，200l/孔。vi. 用 0.45m 滤器过滤底物溶液（BCIP/NBT-plus） ，每孔加入 100l，等待有明显的斑点出现。vii. 用自来水冲洗停止显色。去掉板子后面的软塑料，冲洗膜的背面。viii. 让板子自然干燥。ix. 用 ELISPOT 读数仪分析（板子在室温避光保存） 。4.3.3 以以CpG 684为佐剂的乙肝疫苗：流式细胞术为佐剂的乙肝疫苗：流式细胞术CBA法检测大鼠和猴血清细胞因子水法检测大鼠和猴血清细胞因子水平平检测

46、时间：检疫期、首次给药后 1 周、第 3 次给药后 1 周、末次给药后 4 周。检测指标和样本：以 CpG 684 为佐剂的乙肝疫苗免疫大鼠后，检测血清 IFN-、IL-6和 TNF- 的水平，免疫食蟹猴后检测血清 Th1/Th2 细胞因子 IL-122、IL-4、IL-5、IFN-、IL-6 和 TNF- 的水平。检测方法：流式细胞仪 Cytometric Bead Array(CBA)法，大鼠血清使用三种细胞因子的Flex set，猴血清使用 Non-human Primate Th1/Th2 Cytokine Kit，两种操作方法有部分区别。检测原理：利用微小、分散的包被有特异抗体的微球

47、捕获液体样本中的细胞因子，再与荧光标记的检测二抗反应，通过流式细胞仪检测特定荧光的强度测定细胞因子水平。该法可同时检测多种细胞因子，可自由组合(Flex set) 或使用CBA Kit（如下图所示） 。带有包被抗体带有包被抗体 孵育孵育 捕获捕获 分析分析 的捕获微球的捕获微球CBA Flex set 测定大鼠血清测定大鼠血清 IFN-、IL-6 和和 TNF- 操作步骤：操作步骤： 1) 对卫星组动物采血，分离血清。制备倍比稀释的细胞因子标准品溶液； 制备捕获微球混合稀释液及 PE 检测试剂混合稀释液。2) 涡旋混匀捕获微球混合液至少 5 秒钟, 然后各管加入 50L 捕获微球混合稀释液。3

48、) 各标准管加入 50L 相应的连续稀释的标准品，待测管加入 50L 待 测样品，空白管加入 50L 稀释液。4) 轻轻混匀试管，室温下孵育 1h。5) 各管加入 50L PE 检测试剂混合稀释液。6) 轻轻混匀试管，室温下避光孵育 2h，在此期间，用 Setup Beads 进行仪器设定（用于设定初始的流式细胞仪电压和设定补偿）, 操作过程如下：a. 准备 5 个 Setup 管 A，B，C，D，Eb. D 管中加入 25L PE 仪器设定微球 F1 c. D 管中加入 50L PE Positive Control Detector，短暂涡悬混匀 D 管d. D 管在室温下避光孵育 15mine. A 管中加入 25L 仪器设定微球 A9f. B 管中加入 25L 仪器设定微球 A1g. C 管中加入 25L 仪器设定微球 F9h. A、B、C、D 管中各加入 25L 仪器设定微球 F1i. E 管中加入 50L 混匀的捕获微球13j. D 管中加入 300L 洗涤液，短暂涡悬混匀k. A、B、C、E 管中各加入 350L 洗涤液，短暂涡悬混匀各管中所加微球见下表：Tube（设定管）Setup Beads(设定微球)AA9+ F1BA1+ F1CF9+ F1DPE-F1+ F1E混匀的捕