人卵母细胞辅助激活研究进展 - 生殖医学分会.doc

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1、人卵母细胞辅助激活研究进展人卵母细胞辅助激活研究进展贾洪响，苏丹，毕星宇，武学清贾洪响，苏丹，毕星宇，武学清*（山西省妇幼保健院生殖医学中心，太原，（山西省妇幼保健院生殖医学中心，太原，030000）摘要：卵胞浆内精子注射（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）是目前治疗男性不育最有效的方法，但在ICSI周期中仍然有1-3%的受精失败发生。卵母细胞辅助激活（Assisted oocyte activation，AOA）通过施加外界刺激激活卵母细胞，可以有效克服ICSI后的受精失败，因此近年来获得了越来越广泛的研究和应用，本文综述了近年来人们在卵母细胞辅助激

2、活机理和应用方面的研究成果，并对该技术今后的发展前景作了探讨。关键词：辅助激活；钙离子震荡；受精失败；人卵母细胞；通讯作者：武学清：E-mail： Tel：18035118787随着上世纪90年代初卵胞浆内精子注射（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）技术的出现，人类辅助生殖技术得到了很大的的提升和发展，有效克服了过去由男性因素引起的各种不育症，成为目前治疗男性不育最有效的方法1。ICSI主要应用于由男性因素造成的常规IVF受精失败，其总体受精率可以达到70%以上，对患有少弱精和畸精症等患者均有良好的效果2,3。尽管如此，在ICSI周期中仍然有1-3%

3、的受精失败发生4，对于引起受精失败的原因尚存在很多争议，Rawe等5发现在ICSI后受精失败的卵母细胞中，有39.9%是由于卵母细胞没有正常激活，无法形成原核或者排出第二极体，表明卵母细胞的非正常激活是造成受精失败的主要原因之一。Nasr-Esfahani等6认为由鱼精蛋白缺乏所引起的染色体过早浓缩（Premature chromosomal condensation, PCC）也是造成受精失败的重要原因。除此之外，精子畸形（如圆头精子）也会对ICSI受精率造成一定影响7。针对ICSI受精失败的问题，近年来，不断有文献报道应用卵母细胞辅助激活（Assisted oocyte activatio

4、n，AOA）来改善结局，取得了较为明显的效果。虽然目前在安全性方面仍然面临很多争议，但该技术的进步使人们能够成功克服ICSI后受精失败，有望成为治疗男性不育的重要辅助手段。1 卵母细胞激活的机制对于卵母细胞受精或是孤雌培养，卵母细胞激活都是其中不可缺少的环节，通常认为，卵母细胞在成熟促进因子(metaphasepromoting factor，MPF)和细胞静止因子(cytostatic facotr，CSF)的作用下，发育并停滞于第二次减数分裂中期。只有在精子或某些理化因素的刺激下，卵母细胞才能恢复并完成减数分裂，这一过程称为卵母细胞激活8。该过程伴随着一系列事件的发生，包括钙离子震荡，皮质

5、反应，第二极体排出，雌雄原核形成等，通常以第二极体排出和雌雄原核形成作为激活成功的形态学标志9。卵母细胞是在精子或其他外界刺激的作用下激活的，触发激活的首要反应就是钙离子震荡，即卵母细胞内质网中的钙离子持续释放，引起胞质内钙离子浓度脉冲式升高，进而产生相关酶的级联反应，降调MPF和CSF，从而恢复第二次减数分裂10。钙离子震荡是引发卵母细胞激活的关键，Ducibella等通过显微注射将钙离子载体注入小鼠卵母细胞即使其发育至囊胚11，而钙离子震荡持续的时间、强度和频率不仅影响卵母细胞激活，还会影响到后续的胚胎发育12及基因表达13。Nikiforaki等14还发现复发性部分性葡萄胎的发生与精子未

6、能引发正确的钙离子震荡模式有着密切联系。对于精子触发钙离子震荡的机制，目前能够达成共识的是该过程由三磷酸肌醇(inositol triphosphate, IP3)介导完成，但是对于具体的机制尚无定论。近年来有越来越多的证据表明一种由精子产生的磷脂酶C（phospholipase C zeta, PLC）是激活IP3通路的关键性物质15, 16。PLC可以水解细胞内的二磷酸磷脂酰肌醇，分解成IP3和二酰基甘油，IP3与内质网上的受体结合，引发了钙离子的释放17。Young等发现出生后17天的仓鼠精细胞中即开始表达PLC的 mRNA18。Aghajanpour等的研究表明圆头精子患者或有低受精史

7、患者的精子中PLC的表达量显著低于常人19。另外，还有研究发现，对男性不育症患者的免疫荧光和免疫印迹结果也显示PLC的表达异常20,21。除了精子方面的因素，卵母细胞本身在激活中也扮演着很重要的角色。有证据表明，卵母细胞在从GV期到MII期的成熟过程中建立起了Ca2+的释放机制，这期间细胞质内发生了一系列的变化，包括内质网重组，IP3受体增加和生化性质的改变（对IP3敏感性增加），Ca2+浓度升高等22。而细胞核与细胞质的不完全成熟有可能会抑制卵母细胞对PLC的反应23。同时，还有人认为卵母细胞内的线粒体也可通过IP3和内质网介导Ca2+信号通路24。2 ICSI受精失败患者精子激活能力的检测

8、与诊断对于ICSI受精失败的患者，我们需要确认导致ICSI受精失败的是精源性因素还是卵源性因素，以便于制定相应的后续治疗方案。目前来说，小鼠卵母细胞激活检测（the mouse oocyte activation test, MOAT）是较为可靠的检测方法之一，其原理是用患者的精子对小鼠卵母细胞进行ICSI，通过检测卵母细胞的受精率，来评估患者精子的激活能力是否正常。一般根据受精率的高低把患者分为三组：1. 激活率20%，为低激活组；2.激活率在21%-84%之间，为中等激活组；3. 激活率85%，为高激活组25。处于低激活组的患者提示其有精源性的功能障碍，处于高激活组的患者提示其精子激活能力

9、正常，而处于中等激活组的患者，其受精率尚不足以证明其精子的激活能力正常，还需要对其钙离子震荡的频率和振幅进行检测以确认结果。但是这种技术在实际应用中还是有很多不足，第一，只有当精子的激活率处于极低水平（20%）时才能认为是精源性功能障碍，当激活率高于该水平时依然无法确定受精失败的原因；第二，人精子的磷脂酶C活性高于小鼠26，如果MOAT结果提示患者精子对小鼠卵母细胞激活率只是略低于正常水平，实际上有可能该患者的精子并不足以激活人卵母细胞。这些因素都会降低MOAT结果的准确性，同时该实验还需要稳定的小鼠卵母细胞来源，费时费力，也限制了该方法的广泛应用。有研究者比较了正常人和ICSI后受精失败患者

10、精子的MOAT结果，发现受精失败患者组的2PN率为0% (0/46)，而对照组的2PN率为81.5% (66/81)27，也可以证实受精失败患者精子的激活能力低于常人。考虑到精子中的PLC在卵母细胞激活中的关键性作用，有人提出可以通过实时定量PCR检测患者精子中PLC的表达量，以此作为评价精子激活能力的依据28，并认为这种方法的可靠性高于顶体酶活性检测和染色体成熟度检测。但是在实际应用中发现，即使同一患者的精液样本其PLC的总表达量也会出现显著的差异，这就对该方法的可操作性造成了极大的影响29。3 人卵母细胞辅助激活技术及应用卵母细胞辅助激活是指人们利用化学试剂或物理刺激等手段实现卵母细胞激活

11、的过程。该技术已经广泛应用于体细胞核移植和孤雌胚胎的获得30,31，对于ICSI后反复受精失败的治疗也取得了一系列的进展，但是目前还未能大规模应用于临床。常见的辅助激活方法包括二甲基氨基嘌呤(6-dimethylaminopurine, 6-DMAP)，钙离子载体A23187，电激活等，这些方法通常可以引发单次的钙离子脉冲32，还有其他激活剂如SrCl2可以使卵母细胞产生多次钙离子脉冲，形成钙离子震荡33，但这种激活剂主要应用在小鼠上34，对人卵母细胞的辅助激活研究还比较少。电激活是经典的物理激活方法，Egashira等35首次报道将圆头精子进行ICSI后辅助电激活，成功得到健康新生儿，证明该

12、方法是一种有效的辅助激活方法。该方法用直流电通过卵母细胞，击穿磷脂双分子层，在卵母细胞膜上留下很多小孔，在短时间内引起胞外钙离子内流，使得胞内钙离子浓度升高，之后钙离子浓度会逐渐下降，恢复到初始水平。与化学激活相比，电激活没有潜在的细胞毒性和致畸性，具有更高的安全性。但是，电激活会在激活过程中产生超氧化物(reactive oxygen speciesm, ROS)，会对胚胎产生不利影响36。钙离子载体如离子霉素（ionomycin）和钙离子载体A23187作为化学激活剂在AOA中都有广泛的应用37,38，它们能够高度选择性结合钙离子，穿过细胞膜将钙离子运输到胞质内，提高胞质内的钙离子浓度，但

13、是不能引发持续的钙离子震荡。与氯化锶激活相比，钙离子载体并不能产生生理性的钙离子震荡，而是通过促进钙离子内流使胞质内钙离子的浓度达到阈值39，进而引发后续的酶联反应。钙离子载体使用的浓度、处理时间和处理方式等的不同，都会直接或间接影响着激活的效果，使受精率产生巨大的差异 40。氯化锶作为钙离子的同族离子，锶离子可经由细胞膜上的钙离子通道进入细胞内，置换出内质网中的钙离子，使胞内游离钙离子浓度升高。由于胞质内的锶离子不被消耗，氯化锶所引发的钙离子震荡更加持久，激活模式更接近于正常的精子激活41。自从2006年Yanagida42报道用氯化锶激活成功使不育症患者妊娠并产下健康新生儿以来，氯化锶激活

14、得到了越来越多的关注和研究。Kyono等43随访了5名氯化锶激活后出生的新生儿，其身体和心理发育均为正常，证明氯化锶激活是一种有效而安全的辅助激活方法。之后，XiaoYu Yang等44首次报道1例将圆头精子进行ICSI后使用SrCl2辅助激活成功产下健康新生儿。现有的激活方法在激活原理和激活方式等方面都不尽相同，激活效果也各有优劣，如果将不同的激活方法联合使用，可能会比使用一种激活方法更有效。徐小明等45分别使用钙离子载体A23187联合6一 二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)法或精子提取物卵胞质内注射法两种不同的激活方法对体外成熟MII的卵母细胞进行孤雌激活，发现两种方法均能有效激活体外成熟的

15、MII期卵母细胞。6-DMAP是一种蛋白激酶抑制剂，能够抑制MPF和CSF等相关蛋白质的合成和磷酸化，弥补钙离子载体A23187的不足，使MPF水平维持在低水平，诱导卵母细胞激活。此外，还有人利用电激活联合标准的Ionomycin/6-DMAP激活方法对人的体细胞核移植重构胚进行激活，成功发育至囊胚46。Tachibana等47取消了Ionomycin处理的环节，即电激活后只用6-DMAP处理，发现囊胚发育率提高到17.5%，由于体细胞核移植重构胚需要的激活强度更高，该结果也表明联合激活能够更好地满足卵母细胞辅助激活的需要。钙离子震荡模式对后续的胚胎发育及基因表达等都有重要的影响，在动物模型上

16、的试验证明错误的钙离子震荡模式会损害胚胎的发育潜能48。而卵母细胞辅助激活方法主要通过外界因素使卵母细胞产生足够的钙离子震荡，因此有人提出对胚胎发育阻滞、胚胎质量低下的患者也可使用AOA提高其胚胎质量49。Y. Liu等50研究发现玻璃化冻融的未成熟卵母细胞成熟培养后分别行ICSI和ICSI-AOA，结果ICSI-AOA的优胚率显著高于ICSI组。近期还有一篇Meta分析表明，AOA不论作为辅助激活措施还是未受精卵的补救措施，都能够有效提高胚胎的卵裂率以及优胚率51。4 人卵母细胞辅助激活的安全性一直以来，关于人AOA安全性的争论从来没有停止过，主要原因还在于现有的激活方法与自然的精子激活模式

17、并不一致，人们无法确定所用的激活剂对胚胎着床前后的发育是否有影响以及对新生儿是否有副作用，在掌握足够的证据前，这样争论还将一直持续下去。现在已经证明离子霉素对小鼠胚胎着床前后的发育没有显著影响52，另外, Vanden Meerschaut等报道了将离子霉素, 氯化锶和电激活对有激活缺陷的小鼠模型进行试验，结果均有健康而且有生育能力的小鼠出生53。与此同时, 有些中心开始研究AOA对人类儿童的影响, 针对21名年龄在3-10岁儿童的调查结果显示, 这些儿童在神经发育和行为表现等方面都没有明显异常54。虽然现有的证据均表明AOA对胚胎发育及胎儿生理心理都没有显著影响, 但是由于样本量有限, 这样

18、的结果尚不足以证明其安全性, 还有待于后续的进一步论证。5 人卵母细胞辅助激活的发展前景由于AOA对ICSI后受精失败的显著改善，该技术近年来得到了越来越多的关注和研究。在受精机理和激活方法上不断取得新进展，特别是对PLC的研究使人们对受精机理有了更加深入的认识和理解，也为以后研究新的激活方法打开了思路；同时，越来越多的受精失败患者在该技术的帮助下成功得到了后代，也为临床研究积累了宝贵的经验。但是AOA目前仍然是一项试验性质的技术，要想真正获得推广应用，除了面对伦理方面的困扰，技术上还需要解决一系列的问题。第一，检测受精失败的可靠性高而且容易实施的诊断方法，这是临床上确认患者受精失败原因所亟需

19、解决的问题，虽然已经提出几种可替代MOAT的诊断方法，但是还需要更多的论证和完善；第二，对技术安全性的证明，AOA对胚胎及新生儿后续的生长发育是否有潜在的威胁，虽然一些中心对新生儿的生长发育进行随访显示无明显异常，但这些结果始终不能打消人们的疑虑，不过随着PGD、PGS以及其他胚胎检测技术的兴起，在安全性方面可以得到越来越多的证据；第三，新的辅助激活方法，目前所使用的激活方法主要还是利用化学试剂或物理刺激来激活卵母细胞，由此才引发了对安全性的质疑，新的辅助激活方法应该更安全，更接近生理性的激活过程，在这方面还需要得到持续的支持和研究。参考文献:1 Palermo, G, Joris, H, D

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