抗（抑）菌试验.docx

《抗（抑）菌试验.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《抗（抑）菌试验.docx（18页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、 抗（抑）菌试验抗（抑）菌试验2.1.8.1 目的测定抗（抑）菌产品对细菌和真菌的抗（抑）菌作用。常使用的方法有抑菌环试验、最小抑制浓度测定试验、滞 留 抑 菌 效 果 测 定 试 验 、洗衣粉抗菌效果测定试验、振荡烧瓶试验、浸渍试验与奎因试验， 可视情况选用。2.1.8.2 抑菌环试验2.1.8.2.1 原理利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。试验 通过抑菌环大小以判断其是否具有抑菌能力。本试验适用于抑菌剂与溶出性抗 （抑）菌产品的鉴定。 2.1.8.2.2 试验器材(1)金黄色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌 (ATCC 102

2、31) 菌悬液(见 2.1.1.2)及根据抑菌剂特定用途所用的其他菌悬液。(2)抑菌剂载体 (5 mm 直径园形新华一号定性滤纸片，经压力蒸汽灭菌处 理后，置 120 烤干 2h，保存备用)。(3)活菌培养计数所需器材(见 2.1.1.3)。(4)微量移液器(5l50l，可调式)。(5)游标卡尺。(6)营养琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基与沙堡琼脂培养基2.1.8.2.3 操作程序(1)抑菌片的制备:对液体抑菌剂，取无菌并干燥的滤纸片。每片滴加实际 使用浓度抑菌剂溶液 20l，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，开盖置 温箱(37) 中烤干，或置室温下自然干燥后备用。溶出性抗（抑）菌产品，可

3、直接制成直径为 5mm，厚不超过 4mm 圆片(块)， 每 4 片(块) 一组。(2)阴性对照样片的制备:取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水 20l，干燥后备用。溶出性抗（抑）菌产品的阴性对照样本，应取同种材质不含抑菌成份的样 品，制成与试验组大小相同的样片(块)。(3)试验菌的接种:用无菌棉拭子蘸取浓度为 5105cfu/ml5106cfu/ml 试验菌悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹 3 次。每涂抹 1 次，平板应 转动 60，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥 5min。(4)抑菌剂样片贴放:每次试验贴放 1 个染菌平板，每个平板贴放 4 片试验 样片，1 片阴

4、性对照样片，共 5 片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样 片中心之间相距 25mm 以上，与平板的周缘相距 15mm 以上。贴放好后，用无 菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置 37温箱，培养 16h18h 观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径 (包括贴片) 并记录。试验 重复 3 次。测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。 测量其直径应以 抑菌环外沿为界。2.1.8.2.4 评价规定(1)抑菌作用的判断:抑菌环直径大于 7mm 者，判为有抑菌作用。抑菌环直径小于或等于 7mm 者，判为无抑菌作用。(2) 3 次重复试验均有抑菌作用结果者，判为合格。(3)阴性对照组

5、应无抑菌环产生。否则试验无效。2.1.8.2.5 注意事项(1)每次试验均应设置阴性对照，不可省略。在报告中亦必须将对照组的结 果列出。(2)接种用细菌悬液的浓度应符合要求。浓度过低，接种菌量少，抑菌环常 因之增大; 浓度过高，接种量过多，抑菌环则可减小。(3)应保持琼脂浓度的准确性，否则可影响抑菌环的大小。(4)培养时间不得超过 18h。培养过久，部分细菌可恢复生长，抑菌环变小。(5)抑菌环直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。故抑菌剂滤纸片应在 试验当天制备。2.1.8.3 最小抑菌浓度测定试验（琼脂稀释法）2.1.8.3.1 原理本试验采用琼脂稀释法将不同浓度的抑菌剂混合溶解在琼脂培

6、养基中，然 后点种细菌，通过细菌的生长与否，确定抗（抑）菌物质抑制受试菌生长的最 低浓度，即最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)。本方法 适用于不溶性抗（抑）菌产品。 2.1.8.3.2 试验器材（1）菌株金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大肠杆菌 8099 或 ATCC 11229。可根据抑菌剂的用途，选择特定的菌株。（2）水解酪蛋白琼脂培养基（MH），称取 38gMH 琼脂培养基，溶于 1000ml 水 中，加热至沸腾溶解，然后 121高压灭菌 15min，置 4550水浴备用， 此培养基将用于对照试验。（3）0.03mol/L 磷酸

7、盐缓冲液 pH7.2。（4）加样器（1l10l）。（5）4550水浴恒温箱。（6）吸管、试管、平皿。（7）37培养箱。2.1.8.3.3 操作步骤（1）抗（抑）菌溶液的配制：以无菌操作取 5ml 或 5g（固体研磨后）样品， 放入 45ml 灭菌磷酸缓冲液中，充分震荡溶解，配成 10%的均匀分散的溶液或悬 液。（2）含抗菌剂培养基配制：将已配成 10%的抗（抑）菌溶液或悬液用 PBS 做对 倍系列稀释成不同浓度的受试液，置 4550水浴恒温备用。（3）双倍浓度培养基配制：称取 76gMH 琼脂培养基，溶于 1000ml 水中。加热 至沸腾溶解。然后 121压力蒸汽灭菌 15min，置 4550

8、水浴备用。此培 养基将用于稀释抗（抑）菌溶液或悬液。（4）含抗（抑）菌液培养基的配制：分别取 10ml 系列稀释的抗菌液加入平皿 内。将在 4550水浴中的双倍 MH 琼脂培养基 10ml，加入平皿内 ，边加边 摇晃平板，使抗（抑）菌液和培养基充分混匀，待凝固后备用。（5）用加样器取 1l2l（含菌量约为 107cfu/ml）菌悬液点种于含抗（抑） 菌液培养基的平皿，接种后所形成的菌液圈直径约 5mm8mm（每个点菌量约为 104cfu）。（6）以同样方法接种不含抗（抑）菌成分的 MH 琼脂平板，作为阳性对照。（7）将接种后的平板放置 35培养箱中，倒置培养 18h24h，观察结果。2.1.8

9、.3.4 评判规定菌落生长被完全抑制的最低抗（抑）菌液浓度为该样品对受试菌的 MIC。单一 菌落生长可忽略不计。2.1.8.3.5 注意事项（1）接种时，应由低抗（抑）菌剂浓度向高浓度平板依次接种，最后接种对照 平板。（2）为了保证平板受热均匀，培养时平板堆放不得超过 4 个。2.1.8.4 最小抑菌浓度测定试验（营养肉汤稀释法）2.1.8.4.1 原理本试验将不同浓度的抑菌剂混合溶解于营养肉汤培养基中，然后接种细菌，通 过细菌的生长与否，确定抗（抑）菌剂抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑 菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)。本方法式用于可溶性抑

10、菌 产品。 2.1.8.4.2 试验器材（1）试验菌株：金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大肠杆菌 8099 或 ATCC 11229。可根据抑菌剂的用途，选择特定的菌株。（2）营养肉汤培养基，见附录 A。（3）稀释液，见附录 A。（4）吸管、试管 （5）37培养箱。2.1.8.4.3 操作步骤（1）按 2.1.1.2 所示方法制备的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌悬液 （2）含抗菌剂培养基配制：将抗（抑）菌溶液用蒸馏水做对倍系列稀释成不同 浓度的受试液，取各稀释度受试液 2.5ml 加入到含 2.5ml 双倍浓度营养肉汤的 试管中。（3）取 0.1ml 含菌量约为 108cfu/ml 菌悬液接种

11、于含抗（抑）菌剂的营养肉汤 的试管中，作为试验组样本。（4）以同样方法接种不含抗（抑）菌剂的营养肉汤的试管中，作为阳性对照组 样本。（5）取 2 支含营养肉汤的试管中，作为阴性对照组样本。（6）将试验组样本、阳性对照组样本及阴性对照组样本放置 37培养箱中， 培养 48h，观察结果。（7）试验中应将试验用菌悬液进行活菌培养计数，其作用浓度应为 5105cfu/ml5106cfu/ml。2.1.8.4.4 评判规定当阳性对照管有细菌生长(混浊)，阴性对照管无菌生长(透明)，试验用菌悬液 的作用浓度为 5105cfu/ml5106cfu/ml 时，试验组无菌生长的最高稀释度 所对应的抗（抑）菌剂浓

12、度，为该样品对受试菌的 MIC。2.1.8.4.5 注意事项接种时，应由低抗（抑）菌剂浓度向高浓度依次接种，2.1.8.5 滞 留 抑 菌 效果 试 验2.1.8.5.1 原 理本试验通过模拟适合细菌生长、繁殖和可能产生感染的皮肤条件下，使用随机 性、双盲的、配对比较的方法检测抗（抑）菌香皂和抗菌沐浴露 12h 或 24h 的 滞留抑菌效果。2.1.8.5.2 试验器材(1) 试验产品: 试验品为 25 套按顺序编号的香皂样品。每套 2 块，一块为测试 样品皂，另一块为不含抑菌剂的对照皂。(2) 不含抑菌剂的洗发水 25 瓶（200ml/瓶）(3) 不含抑菌剂的香皂 25 块(4) 胰蛋白酶大

13、豆肉汤培养基(TSB)(5) 胰蛋白酶大豆琼脂培养基（TSA）(6) 0.075mol/L 的磷酸盐缓冲液(7) 70%酒精(8) 恒温箱(9) 金属筒 （直径 2.2cm、高度 3cm）(10) 一次性接种环（直径 4mm）(11) 小塑料碗（直径 2.2cm，高 2.5mm，）(12) 胶带（Darapore，3M 公司生产） (13) 尼龙刮菌棒(14) Triton-X 100 500ml(15) 外用抗生素软膏(例如:百多邦莫匹罗星软膏)(16) 玻璃弯棒(17) 羊血(18) 金黄色葡萄球菌 ATCC 27217（此株金黄色葡萄球菌是一种低毒性、对青 霉素敏感、对四环素有抗药性的色

14、素株，曾用于许多试验研究，没有任何严重 副作用）。(19) 皮肤消毒剂2.1.8.5.3 试验步骤(1)调整阶段试验开始前 7d 至 14d，受试者使用不含抗（抑）菌成分的香皂、洗发水和 沐浴液进行日常的洗手、洗澡。此阶段持续至少 7d，但不超过 14d。(2)清洗阶段清洗阶段共 3d，受试者每天用抑菌皂清洗一侧前臂，用对照皂清洗另一侧前臂， 清洗过程如下:1）先清洗左臂，用流动水（水温应保持在 3537）打湿前臂内侧；2）用香皂从手腕至臂肘上下摩擦 15s；3）用手在涂有香皂的手臂上上下摩擦泡沫 45s；4）用流动的清水冲洗前臂 15s，不要搓擦；5）用纸巾沾干前臂. 不要搓擦；6）重复以上

15、步骤清洗右臂；7）按上面所描述的试验步骤每日清洗前臂 3 次，每次间隔至少一个小时，在最 后一次清洗之后，需记录好时间，在 12h 之后，进行滞留效果检测。在第 9 次 清洗前臂以后，受试者不能洗澡、淋浴或洗净前臂，直到试验结束。用品包的 标签上注明洗哪只手臂。清洗前后的两块香皂的重量及受试者完成清洗的情况， 须记录下来。（3）试验阶段清洗阶段的第四天(最后一次清洗后 12h 或 24h)，将在受试者每只前臂上划出 一个试验区，对试验区进行接种、封包和回收存活细菌，具体步骤如下:1）将金黄色葡萄球菌（ATCC 27217）连续转种 3 代，取第 3 代培养物接种于胰 蛋白大豆肉汤培养基（TSB

16、）中，在 352的条件下培养 20h 2h。然后用 胰蛋白酶大豆肉汤适当稀释菌悬液，使菌悬液浓度约为 108cfu/ml109cfu/ml。2）细菌接种: 在受试者的每只前臂中间部位（不要在手腕和肘皱褶处），用带 有印墨直径为 3.0cm 的玻璃量筒扣在皮肤上，划分出一个试验区。使用加样器 取 10l 上述菌悬液，接种于前臂试验区（菌落数为 106cfu/试验区107cfu/ 试验区），用一次性接种环，把接种物涂成一圆形，使其与试验区边缘应有 4mm5mm 的距离。3）封包:细菌接种后立即用小塑料碗扣于染菌区上面 ，再用胶带将小塑料碗固 定在皮肤上，记录封包的时间。4）回收存活细菌：接种后 2

17、h5min 对前臂上接种的区域进行取样。将金属筒 放置于试验区中间部位，不要接触到盖有印墨的边缘。将 1ml 含 0.1% triton- X100 的 0.075mol/L 磷酸盐缓冲液吸移至金属筒内，用尼龙刮菌棒刮洗金属筒 罩住区域内的皮肤 60s，将筒内液体吸移至试管内，再加 1ml 含 0.1%triton X-100 的 0.075mol/L 磷酸盐缓冲液，对该区域内的皮肤进行第 2 次刮洗 30s，将 第 2 次擦洗的液体，注入含第 1 次刮洗液体的试管中。5）实验区试验后的消毒处理: 一个实验区采样之后，需用 70%的酒精对实验区 进行消毒。然后对另一个实验区以同样方法进行采样，

18、采样结束后，先用 70% 的酒精对实验区进行消毒，然后用皮肤消毒剂对两只前臂进行消毒处理，处理 后清水冲洗，擦干，再涂少量的抗生素软膏。6）平皿接种与培养:对每一个取样进行平皿接种，以 0.0375mol/L 磷酸盐缓冲 液对样品进行 10 倍系列稀释，选适当稀释度取 0.1ml 接种于 2 个含 5%羊血的 TSA 平板表面，用玻璃弯棒涂匀，在 352的培养箱中培养 48h 4h，计 数菌落数。7）抑菌率的计算抑菌率= （对照平均菌落数试验平均菌落数）/ 对照平均菌落数 100%2.1.8.5.4 判定标准试验不得少于 16 人次，抑菌率50%，可判定该产品在规定的时间内有滞留抑 菌作用。2

19、.1.8.5.5 注意事项（1）受试者录用标准年龄介于 18 岁至 65 岁的男性或女性；受试者应身体健康；前臂应完好无损且没有皮肤病及其它皮肤问题；同意在整个试验期间，避免使用抗（抑）菌洗液和乳膏、局部类固醇类药和 全身或局部使用抗生素，除非因为并发病症医生要求使用；同意在清洗阶段使用非药物香皂或洗液洗澡和淋浴，但受试者不能清洗前臂。 在第 9 次洗完前臂以后，不洗澡，淋浴或洗净前臂，直到试验结束。（2）排除受试者的标准 如果受试者有下列情况之一，不能被录用参加试验 同时参加另外一个临床试验 在过去的 14d 中，参加过任何一种形式的关于清洁手或手臂的试验 对香皂、去污剂、香水或青霉素过敏

20、怀孕妇女 诊断患有糖尿病、肝炎、艾滋病（HIV 阳性）、器官移植者，（3）其它试验限制 受试者不得使用其它清洁用品； 受试者应避免洗热水盆浴和游泳； 受试者应避免接触未干的油漆、涂料或者其它溶剂； 受试者应避免在手腕处和前臂上喷洒香水。（4）在试验完成后的 48h72h 内，需检查前臂上有无小脓疱、水疱，隆起的 红色痒疱。出现这些情况的受试者应尽快通知检验单位。2.1.8.6 洗衣粉抗（抑）菌效果鉴定方法 82.1.8.6.1 原 理本 方 法 通过 模 拟 洗 衣 机 的 洗 衣 过 程 ，检 测 抗 （抑）菌 洗 衣 粉（剂）的 抗 菌 作 用 。 2.1.8.6.2 试 验 器 材 （1

21、） 试 验 菌 株大 肠 杆 菌 A T C C 1 1 2 2 9，金 黄 色 葡 萄 球 菌 A T C C 6 5 3 8。（2）培 养 基 营 养 琼 脂（ 琼 脂 含 量 为 1.5%）营养琼脂 A：在营养琼脂中另加入 1.5 %的琼脂。TSA 营养肉汤。（3）牛 血 清 白 蛋 白（ 过 滤 除 菌）（4）烷 基 酚 聚 氧 乙 烯 醚 （Tergitol ）（5）碳 酸 钠 （6）标准 硬 水（7）非 离 子 浸 湿 剂 ： 见 测 试 棉布 制 备 部 分（8）冲 洗 溶 液 （9） 中 和 剂（ 经 中 和 剂 鉴 定 试 验 合 格 ）（10） 吐 温 80 ( 过 滤 除

22、 菌 )（11）去 离 子 水 或 蒸 馏 水灭 菌(12)不锈钢转轴（由 一 条 直 径 0.16cm 不 锈 钢 丝 制 成，如 图 2-2） 俯 视 图 侧 面 图图 2-2 缠 绕 测 试 布 条 的 不 锈 钢 转 轴（13）有 金 属 螺 盖 的 玻 璃 罐（ 容 积 为 470 ml ，可 高 压 灭 菌 ， 并 可 放 入 转 轴 的 广 口 罐），将 罐 口 覆 盖 牛 皮 纸 ，加 盖 ，于 121C 灭 菌 2 5 min 备 用。（14）转 动 速 度 为 45 r/ min6 0 r/ min 的 滚 动 摇 床 （15）可 调 恒 温 水 浴 箱（16）吸 管 (

23、1ml， 5ml，和 10 ml)（17）培 养 皿（18）铺 有 滤 纸 的 玻 璃 培 养 皿。（29）菌 种 保 存 管（20）细 菌 培 养 箱（21）涡 流 振 荡 器（22）细 菌 比 浊 仪（23）棉布（32 支纱/cm32 支纱/cm 平织棉布）（24）别 针、镊 子、无 菌 手 套 、3mm5 mm 玻 璃 珠 、秒 表、载 体 布片 2.5cm3.75cm ，见 测 试 棉布 准 备。2.1.8.6.3 实 验 准 备（1）测 试棉布的制备非 离 子 浸 润 剂 的 制 备：取 5g 烷 基 酚 聚 氧 乙 烯 醚 ，5 g 碳 酸 钠 加 入 到 1 L 去 离 子 水

24、中 。洗 涤 液 的 制 备 ：1.5g 非 离 子 浸 润 剂 ，1.5g 碳 酸 钠 ，加 入 到 3 L 去 离 子 水 中 。将 大 约 3 0 0 g 测 试 棉 布 加 入 3 L 洗 涤 溶 液 。 加 热 煮 沸 1h 。 取 出 棉 布 在 煮 沸 的 去 离 子 水 中 清 洗 5 m i n 。 然 后 放 入 凉 去 离 子 水 中 5 min 。 以 去 除 残 留 的 浸 润 剂 。 然 后 将棉布 晾 干。 （2）测 试 棉 布 和 转 动 支 架 的 准 备 ：取 处 理 过 的 棉 布，剪 成 5 cm 宽 ，重 量 为 15g 1 g 的 布 条，将 其 一

25、 端 插 入 固 定 在 测 试 转 动 支 架 的 水 平 方 向 的 外 边，然 后 在 3 条 水 平 支 架 间 以 足 够 的 张 力 缠 绕 12 个 整 圈 ，将 布 条 的 另 一 端 用 不 锈 钢 别 针 固 定 在 前 一 圈 布 条 上 。最 后 以121 压 力 蒸 汽 灭 菌 15 mi n ，备 用 。（3） 细 菌 悬 液 的 制 备 ：取 0. 5 ml 营 养 肉 汤 冻 干 的 菌 种 溶 解，接 种于含 10 ml 的 营 养 肉 汤 的 试 管 ，于 3 5 C 2 C 培 养 2 4 h。 然 后， 振 荡 混 合 均 匀 。用 10l 接 种 环

26、在 营 养 琼 脂 平 板 上 划 线 ，置 于 35 C 2C 培 养 2 4h。 然 后 ，从 平 板 上 挑 取 单 个 菌 落 种 入 菌 种 保 藏 管 中 ，上 下 摇 动 10 次 ，吸 弃 多 余 液 体 ， 置8 0 C 冰 箱 保 存。 试 验 前 ，从 菌 种 保 藏 管 中 取 出 1 粒 带 菌 小 颗 粒 放 入 营 养 琼 脂 斜 面 ，晃 动 斜 面 。 将 斜 面 至 3 5 培 养 2 4 h 。 每 天 转 种 1 次 ，连 续 传 3 代 。第四天，用 5 m l P B S 洗脱斜面上的菌苔，取 0.5 ml 加入到含 9.5 ml PBS 的试管中，

27、混匀，取 1 ml2 ml 加入含有 20 m l 营养琼脂 B 的细胞培养瓶中， 晃动培养瓶使菌液覆盖整个琼脂表面。吸弃多余菌液，然后将培养瓶倒置平放 在 35培养箱中，培养 24h。用 5m l PBS 和 3g 灭菌玻璃珠洗脱细胞瓶中的菌体，用 PBS 调整浓度至 1108cf u /ml5108cfu/ml，然后加入 3%的牛血清白蛋白。（4）染菌载体的制备：每片载体接种 20l 菌悬液，放回培养皿中，加盖，于 352在培养箱中干燥 20min。（5）测试样品的制备：至少在实验开始前 20 m i n，将盛有 265ml 硬水的玻 璃罐在水浴箱中恒温至测试温度(251)。加入被测试样品

28、混合溶解。2.1.8.6.4 试验步骤（1）将两片染菌载体放入转动支架的第 6 和 7 层布条之间，将第 3 片放入第 7 和 8 层布条之间。（2）以 无 菌 操 作 方 式 将 转 动 单 元（ 支 架、 布 条 和 染 均 载 体）放 入 含 有 测 试 产 品 的 玻 璃 罐 中 ，加 盖 。（3）玻璃 罐 固 定 在 摇 床 上 ，滚 动 旋 转 洗 涤 20 m i n ，取 下 玻 璃 罐。（4）以无菌操作方式，取出转动单元，取出 3 片染菌载体，放入到含有 3 0 ml 中和剂（在测试抗菌产品的抗菌作用时，不加中和剂，只加入含 0.5%吐温 8 0 的 PBS）的试管中，在振荡

29、器中混合 10s。然后振打 200 次，用 PBS 做 10 倍 系列稀释，并选择适宜稀释度样液接种 TSA 平板。每个稀释度接种两个平板。（5）对 照 组 除 用 0.5 %（ V/V） 的 吐 温 8 0 替 代 测 试 产 品 外 ， 其 它 实 验 条 件 和 步 骤 均 与 试 验 组 相 同 。（6）菌 数 对 照: 将 3 片染 菌 载 体 加 入含 有 3 0 ml 0.5 % 吐 温 8 0 的 PBS 试 管 中 ，在 振 荡 器 振 荡 10s ，然 后 振 打 2 0 0 次 ，用 PBS 做 10 倍 系 列 稀 释 ，并 取 适 宜 稀 释 度 样 液 1.0ml，

30、以 倾 注法 接 种 TSA 平 板，每 个 稀 释 度 接 种 两 个 平 板。（7）将 试 验 组、对照 组 和 菌 数 对 照 组 平 板 倒 置 于 3 5 2 培 养 箱 中 ，培 养 4 8 h 4 h，计 数 菌 落 数 。（8）结 果计 算试 验 重 复 3 次 。 记 录 并 计 算 测 试 样 品 的 细 菌 总 数 的 对 数 值 ， 求 其 平 均 值.。2.1.8.6.5 评 价 规 定按 2.1.7.4.3（7）的 方 法 计 算 抑 菌 率 ，抑 菌 率 达 到 5 0 % 可 判 为 该 抗 菌 合 格 ；按 2.1.1.7.4（6）方 法 计 算 杀 灭 对

31、数 值。杀 灭 对 数 值 3.00， 可 判 定 该 产 品为 消 毒 合 格 。2.1.8.6.6 注意事项（1）将旋转单元放入玻璃罐后应将盖子盖紧，以防转动时漏水。（2）试验时应严格无菌操作，以防止杂菌污染。2.1.8.7 振荡烧瓶试验2.1.8.7.1 原理在液体中通过快速长时间振荡，增加微生物与抗（抑）菌产品内抑菌剂的接触 以显示其抑菌作用。试验根据抑菌率大小判断其是否具有抑菌能力。本试验适 用于对非溶出性抗（抑）菌织物的鉴定。2.1.8.7.2 试验器材(1)金黄色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌 (ATCC 10231) 菌悬液的制备方法见 2.

32、1.1.2。根据抑菌剂特定用途也可用其他菌悬液。(2)磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH 值 7.27.4)(3)振荡摇床 (300r/min)(4)三角烧瓶(5)营养琼脂培养基、胰 蛋 白 胨大 豆琼 脂培 养 基（TSA）与沙堡琼脂培养 基2.1.8.7.32.1.8.7.3 操作程序操作程序（1）将抗菌物品剪切成 10mm10mm 样片，称取 0.75g 分装包好。（2）将 0.75g 样片放入 250ml 的三角烧瓶中，分别加入 70ml PBS 和 5ml 菌悬 液，使菌悬液在 PBS 中的浓度为 1104 cfu/ml5104 cfu/ml。（3）将三角烧瓶固定于振荡摇

33、床上，在作用温度为 2025的条件下，以 300r/min 振摇 2min。吸取 1.0 ml 用 PBS 作适当稀释只至 10-2，作为试验组震 荡前样液。（4）将 0.75g 样片放入上述含有 70 ml PBS 和 5ml 菌悬液的三角烧瓶中，然后 将三角烧瓶固定于振荡摇床上，在作用温度为 2025的条件下，以 300r/min 振摇取 0.5ml 振摇 1h。吸取 1.0 ml 样液，或用 PBS 作适当稀释后作 为试验组振荡后样液。（5）分别吸取振荡前和振荡后样液各 1.0ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样 液接种两个平皿，按照 2.1.1.3 规定的方法进行活菌培养计数。（6）试验

34、同时设阴性对照样片和不加样片组。对照样片组以不含抗菌剂的材质、 大小相同的样片代替抗菌样片外，其它操作程序均与试验组相同。不加样片组 分别取 5ml 菌悬液和 70mlPBS 加入 250ml 三角烧瓶中，混匀，分别于振荡前和 振荡后 1h，各取 1.0ml 菌悬液与 PBS 的混合液做适当稀释。按 2.1.1.2.3 法进 行活菌培养计数。（7）试验重复 3 次，按下列公式计算抑菌率2.1.7.7.42.1.7.7.4 评价规定评价规定(1)不加样片组活菌计数在 1104cfu/ml5104cfu/ml，且样本振荡前后平均 菌落数差值在 10% 以内，试验有效。(2)试验样片抑菌率与对照样片

35、抑菌率的差值 26%，即可认定该样片具有抗菌 作用。2.1.8.7.52.1.8.7.5 注意事项注意事项(1) 振荡前须将振荡摇床上的三角烧瓶固定牢，以免碰破。(2) 试验中，在实验误差允许的范围内，如果试验组和对照组出现振荡后菌 落数高于振荡前菌落数的情况，其抑菌率可按“0”计算。2.1.8.8 浸渍试验2.1.8.8.1 原理将试样和对照织物分别放于三角瓶中，用含有肉汤培养基的试验菌悬液接种于 试样和对照织物上，经培养后，分别将培养前后试样上的细菌洗下，测定细菌 的数量，可计算出试样上细菌减少的百分率。该方法适用于溶出性抗菌织物的 检测。2.1.8.8.2 试验器材(1)试验菌株 金黄色

36、葡萄球菌 ATCC 6538(2)试样 将抗菌织物剪成直径为 5cm 的圆形样片(3)肉汤培养基(4)胰蛋白胨大豆琼脂培养基(5)0.03mol/L 磷酸盐缓冲液 pH7.2(6)恒温水浴箱(7)37培养箱2.1.8.8.3 试样和菌悬液的制备（1）试样的制备：距布边 10cm 以上，离布端 1m 以上，剪直径为 5cm 的圆形试样若干，（需用试 样数量要根据纤维类别及织物织法而定，以能吸收 1ml 菌液且三角瓶中不留残 液为度）。另剪取对照织物若干，取 3 份试样和 2 份对照织物分别装于三角瓶 中，该好瓶口，121 15min 灭菌备用。(2) 菌悬液的制备用接种环将保存的菌种以划线法接种

37、到营养琼脂平皿上，在 37培养箱中培养 24h，取平皿上典型的菌落移种到肉汤培养基的三角瓶中，在 37条件下培养 24h ，用肉汤进行系列稀释，使菌悬液的含量为 1105cfu/ml5105cfu/ml。2.1.8.8.4 试验步骤(1) 分别取 1ml 菌悬液加在三个准备好的三角瓶内的织物上，确保其均匀分布， 且三角瓶中不留多余液，封好瓶口，以防蒸发。(2) 分别在一个盛有试样和对照织物的三角瓶中加入 100ml 缓冲液，剧烈摇晃 1min 洗涤细菌，取 1ml 做 10 倍系列稀释，选适当稀释度以倾注法接种平皿， 作为“0”接触时间样品和对照织物上的细菌数。(3) 将另一个装有接种试样的三

38、角瓶在 37培养箱中培养 20h2h，然后加入 100ml 缓冲液，剧烈摇晃 1min 洗涤细菌，取 1ml 做 10 倍系列稀释，选适当稀 释度以倾注法接种平皿，作为试验组。(4)阴性对照 试样不接种菌悬液，在“0”接触时间加入 100ml 缓冲液，剧烈摇 晃 1min 取样，接种平皿。(5)阳性对照另取 1 个装有对照织物的三角烧瓶，接种 1ml 菌悬液后，在 37 培养箱中培养 20h2h，然后加入 100ml 缓冲液，剧烈摇晃 1min 洗涤细菌，取 1ml 做 10 倍系列稀释，选适当稀释度以倾注法接种平皿。(6)将阴性和阳性对照样本与试验组样本一并放入 37培养箱中，培养 48h，

39、计 数菌落数。(7)试验重复 3 次。(8)结果计算B 或 C 或(BC)/2-A抑菌率（%）= 100B 或 C 或(BC)/2A-试验组试样上的细菌数；B- “0”接触时间试样上的细菌数；C-“0”接触时间对照织物上的细菌数；如果“B”和“C”差别较大时，取较大值；如果“B”和“C”差别不大时，取 平均值。2.1.8.8.5 评判规定（1）“0”接触时间对照织物的平均菌落数应在 1103cfu/ml5103cfu/ml。（2）阴性对照应无菌生长，阳性对照菌数比 0 接触时间的菌数明显增加。（3）各次试验的抑菌率均50%，即可认定该样片具有抗菌作用。2.1.8.8.6 注意事项（1）对织物进

40、行染菌操作时，应确保其均匀分布，且三角瓶中不沾染或存留多 余菌液。（2）三角瓶内的织物染菌后，应将瓶口封好，以防液体蒸发，造成细菌死亡。2.1.8.9 奎因试验2.1.8.9.1 原理将菌悬液直接滴于抗（抑）菌产品上，覆盖以培养基，加强微生物和抑菌剂的 接触以显示其抑菌作用。试验根据抑菌率大小判断其是否具有抑菌能力。本试 验适用于对非溶出性硬质表面抗（抑）菌产品的鉴定。2.1.8.9.2 试验器材（1）金黄色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌 (ATCC 10231) 菌悬液(见 2.1.1.2)。根据抑菌剂特定用途所用的其他菌悬液。（2）磷酸盐缓冲液(PBS，

41、0.03mol/L，pH 为 7.27.4)。（3）营养琼脂培养基、沙堡琼脂培养基和半固体营养琼脂培养基。2.1.8.9.3 操作程序（1）倾注琼脂培养基平板。（2）菌悬液的制备按 2.1.1.2 进行。将菌悬液稀释成 105cfu/ml106cfu/ml 作为试验用菌悬液。（3）将测试的抗（抑）菌产品剪切成 50mm50mm 大小样片，用 75%乙醇消毒 后，逐片平放于无菌平皿内，取 0.1ml 试验用菌悬液滴染于样片中央，涂匀， 使菌液与样片边沿留有 5mm 的距离。置 37温箱内干燥 30 min60min，作为 染菌的抗（抑）菌样片备用。（4）将染菌的抗（抑）菌样片有菌面朝上平贴于无菌

42、琼脂平板表面。（5）用半固体琼脂 3.0 ml5.0ml，均匀覆盖于染菌样片表面，置 37温箱培 养 18h24h，观察结果。（6）另将试验用菌悬液作适当稀释，使其浓度为 1103 cfu/ml2103 cfu/ml，取其 0.1ml 滴染于不含抗（抑）菌剂的同质样片上，涂匀，与试验组 样片做同样处理后，同放一平板内，用半固体琼脂覆盖培养，作为阳性对照。（7）试验同时，试验菌悬液作活菌计数，并观察不含抗（抑）菌剂的对照样片 受试菌的培养计数。（8）试验重复 3 次。（9）按下列公式计算抑菌率。2.1.8.9.4 评价规定阳性对照生长菌数100cfu/片，抑菌率99.00%，可判为有抑菌作用。2.1.8.9.5 注意事项（1）样片滴染菌悬液时，勿溢出片外。（2）覆盖用琼脂的温度以在 4550间为宜，不可过热。