病毒灭活试验.docx

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1、 病毒灭活试验2.1.1.10.1 适用范围主要适用于消毒产品鉴定或日常监测。用具有一定代表性的、活的病毒及其细胞感染技术，评价各种用途的消毒因子对测试病毒的杀灭效果。按此方法进行的试验，只是对消毒因子的灭活病毒能力的重要方面进行验证。2.1.1.10.2 试验器材（1）试验用病毒株：脊髓灰质炎病毒 1 型（poliovirus-，PV-）疫苗株；艾滋病病毒 1 型（HIV-1）美国株。（2）宿主细胞：可采用 VERO 细胞系、BGM 细胞、Hela 细胞系或 FL细胞系，作为 PV-1 的测试细胞。用含有人 T 淋巴细胞白血病病毒 1 型（human T cell leukemiavirus

2、 1，HTLV-1）基因的人淋巴细胞（MT4 株）作为 HIV-1 的测试细胞。（3）细胞培养瓶与 96 孔培养板。（4）恒温水浴箱。（5）二氧化碳培养箱。（6）层流超净工作台。（7）低温冰箱（-20，-80）。（8）液氮罐。（9）倒置显微镜。（10）离心机。（11）可调移液器及配套一次性塑料吸头。（12）细胞维持培养基：见附录 A。（13）细胞完全培养基：见附录 A。（14）去离子水。2.1.1.10.3 病毒悬液的制备（1）从液氮中取出冻存的试验用宿主细胞，在 37温水中迅速融化，用毛细吸管移植于含有细胞维持液的细胞管内，吹吸数次，使混匀，立即离心（3000r/min，3min），去上清液

3、。再加入适当的细胞维持液，吹吸数次，使混匀，同上离心后，转种于加有 10ml 完全培养基的培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验。（2）取出低温冻存的试验病毒毒种，37水浴融化，用细胞维持液作 10 倍稀释，然后接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置 37温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待 3/4 细胞出现病变时，收获病毒。（3）将含有病毒及宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，用超声波（或反复冻融）破碎宿主细胞，释放病毒。然后，尽快离心（6000r/min，15min）去除沉淀（主要为细胞碎片），上清液即为所需的病毒悬液。按每管 1.0ml 分装于无菌离心管(1.5

4、ml)中。（4）取 1 支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度。其余均冷冻保存于-80备用。2.1.1.10.4 病毒灭活滴度计算方法（1）终点稀释法病毒感染滴度的计算以半数细胞感染剂量（TCID50）表示。TCID50的对数值计算公式如下。TCID50 对数值= 病变率高于 50%组稀释度的对数值 + 距离比例（“病变率高于 50% 组”是指病变率超过 50%的最低组，下简称“高于 50% 组”；“病变率低于 50%组”是指病变率低于 50%的最高组，下简称“低于 50%组”）。具体计算方法如下：1）计算细胞病变率。先计数培养板上不同稀释度样本细胞病变发生与未发生的孔数，然后分别计算“

5、细胞病变（-）”和“细胞病变（+）”的累积总计值。计算“细胞病变（-）”累积值时，由稀释度低样本组向稀释度高样本组累积；“细胞病变（+）”累积值则相反，由稀释度高样本组向稀释度低样本组累积见表 2-2。各稀释度样本组“细胞病变（+）”累积总计值，除以该稀释度样本组“细胞病变（-）”与“细胞病变（+）”累积总计值之和即为其病变比，由之可得病变率（%）见表 2-2。2）计算距离比例。距离比例可按下式计算：3）计算举例设试验数据如表 2-2 表 2-2 某消毒剂对 HIV 灭活作用的测定结果样本接种细胞病变累积值稀释度孔数-+细胞病变(-)细胞病变(+)病变比病变率（%）10-440401212/1

6、210010-5404088/810010-6413144/58010-7431411/52010-8440800/80本例，高于 50% 组病变率（%）为 80；低于 50%病变率（%）为20；高于 50%组稀释度对数值为 6。TCID50 对数值 = 60.5 = 6.5（2）噬斑法病毒感染滴度的计算噬斑法病毒感染滴度，以噬斑形成单位数（pfu），简称噬斑数表示。计数方法同活菌培养计数技术（参见 2.1.1.3）。每毫升测试样品中的病毒含量计算（pfu/ml） 平板平均噬斑数稀释倍数（3）平均灭活对数值的计算平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID50或 pfu）的为 N0，试验（消毒）组平均病毒感染滴度（TCID50或 pfu）为 Nx。平均灭活对数值 = log Nolog Nx