灭菌与消毒指示器材鉴定试验.docx

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1、灭菌与消毒指示器材鉴定试验灭菌与消毒指示器材鉴定试验2.1.6.1 压力蒸汽灭菌生物指示物鉴定试验2.1.6.1.1 目 的测定压力蒸汽灭菌生物指示物所含菌量，以及在 1210.5饱和蒸汽作用下 的存活时间、杀灭时间与 D 值是否达到要求指标。2.1.6.1.2 实验器材(1) 压力蒸汽灭菌生物指示器材抗力检测器 (biological indicator evaluator resistometer，pressured steam sterilization，BIER，下简称抗 力检测器)。对抗力检测器要求的技术指标：时间控制以秒为单位；温度控制以 0.1为单位；加热至预定温度的时间应10s

2、；排气时间5s；试验期间柜室 内温度误差0.5。(2) 5660 温箱。(3) 溴甲酚紫蛋白胨培养液 (嗜热脂肪杆菌芽胞恢复培养基，见附录 A)。(4) 嗜热脂肪杆菌芽胞恢复琼脂培养基 (见附录 A)。(5) 眼科镊子 (夹取菌片用)。(6) 磷酸盐缓冲液 (PBS，0.03 mol/L，pH 7.2)。(7) 回收液 (含 0.1% 吐温 80 的 PBS 液)。2.1.6.1.3 生物指示物微生物含量与抗力标准(1) 嗜热脂肪杆菌(Bacillus stearothermophilus ATCC 7953 或 SSI K31) 芽 孢。回收菌量为 5105cfu/片5106cfu/片，或

3、5105cfu/ml5106cfu/ml。(2) 在 1210.5 饱和蒸汽条件下，存活时间3.9min，杀灭时间 19min。(3) 在 1210.5 饱和蒸汽条件下，D 值为 1.3min1.9min。2.1.6.1.4 生物指示物含菌量的测定随机抽取 3 个生物指示物样本。样本如为菌悬液式指示物，直接用 PBS 作适当 稀释后，按 2.1.1.3 规定进行活菌培养计数即可；样本如为含菌载体式指示物 (如菌片)，应先置回收液中洗下芽孢，并以 PBS 稀释至适当浓度，再进行活菌计数培养。培养温度为 5660，24h 观察结果。培养基仍用营养琼脂培养 基。检测菌量符合 2.1.6.1.3 者为

4、合格。2.1.6.1.5 存活时间和杀灭时间的测定下以生物指示管的测定为例：(1) 试验按作用时间分为 3.9min 和 19min 两组，各组测定 20 个样本。(2) 先将抗力检测器的电热蒸汽发生器加满蒸馏水，以不超过最高水位为度。(3) 接通检测器电源，预热，使达到预定蒸汽压。(4) 设定灭菌温度(1210.5)和作用时间。(5) 启动抗力检测器工作程序，使自动运行两个循环，以保证柜室等得到充分 的预热。(6) 将生物指示管 (每批放 20 个样本) 放专用载物架上并置抗力检测器柜室 中，保证每个样本都可充分暴露于蒸汽中。(7) 关闭柜门，先设定一组所规定的灭菌时间。(8) 启动抗力检测

5、器工作程序，使自动进行抽真空柜室加热灭菌处理排 气。(9) 打开柜门，取出生物指示管。(10) 紧接着重复 (5)(9) 的程序进行另一组的测定。(11) 取出的生物指示管应尽快 (勿超过 2h) 放入 5660 温箱，培养 7d，观察最终结果。(12) 测定结果，3.9min 组(存活时间组)20 个生物指示管均有菌生长；19min 组(杀灭时间组)20 个生物指示管均无菌生长时，可判为合格。其中一个组或两 组各有一个样本未达规定要求，可再用 4 组样本重复试验(3.9min 和 19min 组 各测试 2 次)。重复试验中，如各样本均达规定要求，仍可认为合格。 对生物指示菌片测定时，操作程

6、序与判断标准与上述生物指示管基本相同， 只是将单片菌片装于牛皮纸袋中，以防灭菌时被冷凝水浸湿。此外灭菌完毕， 需将样本分别接种于溴甲酚紫蛋白胨培养液中培养，7d 观察最终结果。2.1.6.1.6 D 值的测定(1) 随机抽取 50 个样本，在 0min20min 范围内分成 10 个作用时间组进行 试验。每组 5 个样本。作用时间递增幅度，可根据预备试验结果适当变动(最 长时间必须达到使菌全部死亡的作用时间)。(2) 将各组样本按 2.1.6.1.5 (2)(10) 所示程序，分次进行灭菌处理。(3) 灭菌完毕，按 2.1.6.1.4 所示对各组样本随机抽取 3 个进行活菌培养计数。(4) 计

7、算每个作用时间样本上平均存活芽孢数的对数值。以作用时间为横坐标 (X)，存活芽孢数的对数值为纵坐标(Y)，算出芽孢存活与作用时间的回归方程 (Y = a + bX)。(5) 计算各实际测定值与直线回归方程的相关程度(相关系数)。(6) 根据所得直线回归方程式，计算出减少 90%芽孢数所需的作用时间(D 值)。 D 值符合 2.1.6.1.3 者为合格。2.1.6.1.7 稳定性试验(1) 在规定的贮存条件下，存放足量产品。(2) 按使用说明书规定的有效期限抽样检测，先观察外观，特别注意指示剂中 的培养液颜色有无变化。(3) 在外观正常情况下，进一步按 2.1.6.1.4、2.1.6.1.5 所

8、示方法测定活菌 数量、存活时间、杀灭时间。菌量数下降50%，存活时间和杀灭时间又在规定 合格范围内(见 2.1.6.1.3)者，该贮存期可视为产品的有效保存期。2.1.6.1.8 注意事项(1) 测定生物指示剂的抗力时，必须用压力蒸汽灭菌生物指示剂检测器进行， 不能用普通压力蒸汽灭菌器代替。(2) 使用抗力检测器进行测定时，为确保每次加热时间的一致，每次间隔时间 不宜超过 100s。如时间过长，柜室必须重新预热。(3) 培养基性能对热损伤后的芽孢恢复有一定影响，试验时不能用普通培养基 代替恢复培养基。(4) 严格无菌操作，尤其是对生物指示菌片进行存活和杀灭时间测定时。2.1.6.2 压力蒸汽灭

9、菌化学指示卡鉴定试验2.1.6.2.1 目 的测定下排气式、预真空式和脉动真空式压力蒸汽灭菌化学指示卡(下简称化学指 示卡)产品在饱和蒸汽作用下所产生的颜色变化，与拟代表的温度、杀菌作用时 间的吻合情况，以作为判断该指示卡是否合格的依据。对其他相似类型化学指 示物的鉴定，可参照本试验的有关原则进行。2.1.6.2.2 实验器材(1) 压力蒸汽灭菌生物指示物抗力检测器 见 2.1.6.1.2 (1)，下简称抗力检 测器。(2) 生物指示物 (经鉴定合格者，见 2.1.6.1)。(3) 留点温度计 (60140，应经检定合格)。2.1.6.2.3 试验分组试验根据作用温度和时间分组，一般情况下，以

10、使用说明书表明的变色温度和 作用时间为第 1 组，而后温度不变，作用时间缩短 10min 为第 2 组；另外，作 用时间不变，仍为 20 min，温度下降 4为第 3 组。预真空和脉动真空式压力 蒸汽灭菌，因所需作用时间很短，故第 2 组只降低 2min 即可。例如，某一下排气式压力蒸汽灭菌化学指示卡使用说明书写明，在温度为 121，作用 20 min 可全部达到变色完全 (与标准合格色块相同)。对该指示 卡鉴定试验时，可分组如下:第 1 组 121，20min；第 2 组 121，10min；第 3 组 117，20min。又如，某一预真空式压力蒸汽灭菌化学指示卡使用说明书写明，在温度为 1

11、32，作用 3min 可全部达到变色完全。对该指示卡鉴定试验时，可分组如下:第 1 组 132，3min；第 2 组 132，1min；第 3 组 128，3min。分组测试的目的是： 验证使用说明书所表明的温度和作用时间，能否使指 示卡变色完全；测试灭菌不完全的温度或时间条件下，化学指示变色不完全 (未达到与标准合格色块深度相同) 的比例。2.1.6.2.4 实验室试验操作程序(1) 每组试验，取 10 片化学指示卡、1 件生物指示器材和 1 支留点温度计， 同时放入抗力检测器中。(2) 操作抗力检测器，将各组样本按 2.1.6.1.5 (2)(10) 所示程序分次进行 处理 (各试验组要求

12、的温度和作用时间，见 2.1.6.2.3)。 (3) 立即打开柜门，取出上述物品，进行检测。(4) 检测时，观察留点温度计所示温度；对比化学指示卡上变色色块与标准合 格色块的颜色，确认是否达到合格要求；将生物指示物放入 56 温箱中培养 7d，并观察是否有菌生长。 (5) 系统记录各组留点温度计、化学指示卡和生物指示物的结果。(6) 各组试验均重复 3 次。(7) 3 次测定结果均符合以下全部情况者可判为合格： 第 1 组指示卡 100% 变色完全，第 2 组与第 3 组指示卡 20% 变色完全； 各组生物指示物结 果与指示卡基本同步； 留点温度计读数与试验规定的温度，相差不超过 0.5。2.

13、1.6.2.5 稳定性试验取包装完好并在室温、避光、干燥条件下，保存至一定时间 (至少半年) 的化 学指示卡，用实验室试验(2.1.6.2.4) 方法进行检测。若结果符合上述要求， 可视为指示卡在该保存期内性能稳定。2.1.6.2.6 注意事项(1) 化学指示卡的鉴定，除注意其在到达灭菌要求温度和时间时可变为合格颜 色外，还必须观察其在未达到灭菌要求温度和时间时是否不会变成合格颜色。 从防止灭菌不合格角度看，后者更为重要。因此，在试验中低于灭菌要求温度 和时间组绝不可省略。(2) 测定时应使用饱和蒸汽，否则可影响结果的准确性。(3) 留点温度计检定时所观测到的误差，在记录试验温度时，应将读数校

14、正。(4) 压力蒸汽灭菌生物指示物抗力检测器为一专用设备，国外和我国均有生产。 由于试验要求的精密度较高，不宜用一般压力蒸汽灭菌器代替。(5) 试验中所用化学指示卡和生物指示物必须为同批产品。(6) 下排气式和预真空 (包括脉动真空) 式压力蒸汽灭菌对温度和作用时间的 精确度要求不同，故在两类化学指示卡试验分组中温度和作用时间的组距亦不 同，两者不宜混用。 (7) 对所要求的重复性试验，不可只在同次试验中增加一些化学指示卡，而应 每重复一次试验即应进行一次压力蒸汽灭菌处理，以防产生系统性误差。2.1.6.3 压力蒸汽灭菌化学指示胶带与化学指示标签的鉴定试验2.1.6.3.1 目 的测定压力蒸汽

15、灭菌用化学指示胶带与化学指示标签在规定温度的饱和蒸汽和作 用时间下的变色情况，以作为判断该指示胶带和标签是否适用于作为经压力蒸 汽灭菌处理标志的依据。2.1.6.3.2 实验器材(1) 下排气式压力蒸汽灭菌器与预真空或脉动真空压力蒸汽灭菌器。(2) 留点温度计 (60140，经鉴定合格)。2.1.6.3.3 试验分组试验根据作用温度和时间分组，一般情况下化学指示胶带和标签所要求的准确 度较化学指示卡类产品为宽松。分组时，以使用说明书表明的变色温度和作用 时间为第 1 组；而后，温度不变，作用时间缩短 10min 为第 2 组 ；另外， 时间不变，温度下降 10 为第 3 组。预真空和脉动真空压

16、力蒸汽灭菌，因所需时间很短，故第 2 组缩短至 1min 即 可。例如，使用说明书表明，某种用于下排气式压力蒸汽灭菌的化学指示胶带，在 温度为 121，作用 20 min 可全部达到变色完全 (与标准合格色块相同)。试 验时，可分组如下： 第 1 组 121，20min；第 2 组 121，10min；第 3 组 111，20min。又如，某一用于预真空与脉动真空式压力蒸汽灭菌的的化学指示胶带，说明书 写明，在温度为 132，作用 3min 可全部达到变色完全。试验时，可分组如 下：第 1 组 132，3min；第 2 组 132，1min；第 3 组 122，3min。分组测试的目的是： 验

17、证使用说明书所表明的温度和作用时间，能否使样 本变色完全；测试灭菌不完全温度或时间条件下，化学指示胶带与化学指示 标签变色不完全 (未达到与标准合格色块深度相同) 的比例。2.1.6.3.4 试验操作程序(1) 每组试验取 5 个标签或来自不同卷的 5 段胶带，粘贴于厚纸片上，随同 一留点温度计放入相应的压力蒸汽灭菌器中。(2) 按常规灭菌方法处理，待达到要求的温度及其相应的压力，持续至规定的 时间，排空柜室内蒸汽使成常压。(3) 打开柜门，取出样本。(4) 观察、记录化学指示胶带、标签，是否变色和留点温度计显示的温度。(5) 各组试验重复 3 次。(6) 3 次试验均符合以下条件者为合格：

18、第 1 组全部样本变色完全， 第 2 和第 3 组变色完全的样本比例不超过 20%。 留点温度计所示温度与设 定的温度相差不超过 0.5。对未印有变色完全的标准色块的指示胶带和标签，可依据生产者另外提供的完 全变色样本，对变色完全与否进行判断。2.1.6.3.5 稳定性试验取包装完好的样本，在室温、避光、干燥条件下保存至使用说明书规定的有效 期限，用 2.1.6.3.4 规定的方法进行检测，若结果符合要求，所测指示胶带与 标签可视为在该保存期内性能稳定。2.1.6.3.6 注意事项(1) 于 121 条件下检测合格者，只能于 121 灭菌时使用，于 132条件下 检测合格者，只能于 132灭菌

19、时使用。只有两组检测均合格者，才能兼用于 上述两种温度灭菌的监测。(2) 其他注意事项见 2.1.6.2.6 中的有关内容。2.1.6.4 紫外线灯管照射强度化学指示卡鉴定试验2.1.6.4.1 目 的测定紫外线灯管照射强度化学指示卡 (下简称指示卡) 在照射后颜色的变化与 所受照射剂量的相关情况，从而确定是否可用于使用单位对紫外线灯管照射强 度的自检。2.1.6.4.2 试验器材(1) 紫外线照度计 (在计量标定有效期内，下简称照度计)。(2) 低臭氧直管紫外线灯 30 W，紫外线强度 (辐照度值) 90W/cm2。(3) 紫外线灯测定架（附 220V 稳压器。下简称测定架）。2.1.6.4

20、.3 试验操作程序(1) 将紫外线灯装于测定架上，指示卡置灯管下方垂直中心位置的照射台上 (灯管与照射台距离可上下调整，以使达检测时规定的照射强度)。(2) 开启紫外线灯，待 5 min 后灯管工作稳定，按指示卡上各标准色块注明的 强度，分别调整好灯管下照射台中心测试点处的紫外线照射强度 (用照度计测 定)，以进行随后的照射试验。(3) 照射时，在测定架上对指示卡变色区进行照射。每 10 张指示卡为一组， 每组照射 1min，每个强度照射 3 组（共 30 张指示卡）。(4) 照射后，即刻用肉眼观察照射过的指示卡，比较其变色区色块与相应标准 色块的颜色。(5) 同时用照度计测定紫外线照射强度，

21、以与指示卡结果核对。(6) 变色区色块与标准色块，以及指示卡检测结果与照度计测定结果的符合率 均90% 者，可判定为合格。2.1.6.4.4 稳定性试验(1) 在室温避光条件下，存放足量指示卡。(2) 按使用说明书规定的期限抽样，每次抽取 20 份样本按 2.1.6.4.3 方法进 行检测。(3) 试验结果符合合格要求 2.1.6.4.3 (6)，可认为该存放时间即为其贮存 有效期。2.1.6.4.5 注意事项(1) 为防失准，所用照度计必须定期检测校正，并在计量标定有效期内。(2) 试验中所用指示卡必须为同一批产品。(3) 测试时，对指示卡照射 1min，时间应准确，过长或过短均可影响结果。

22、(4) 指示卡测定时，应防紫外线灯光直射。(5) 光敏指示卡反应变色后，久存可能颜色有所改变，为此检测结果应即时观 察并用文字记录。(6) 测试应分多次进行，否则易发生系统误差。(7) 电压波动可影响灯管放射的紫外线强度，试验时应予注意。2.1.6.5 消毒剂浓度试纸鉴定试验2.1.6.5.1 目 的通过检测消毒剂浓度试纸 (下简称试纸) 颜色反应情况与溶液中消毒剂浓度相 关程度，以作为对其应用做出评价。2.1.6.5.2 实验器材消毒剂有效成分化学分析器材。2.1.6.5.3 测定分组 鉴定中，应根据试纸使用说明书所列可测试消毒剂种类分别进行测试。测试中， 取比色卡上所示标准色块中的高、中、

23、低 3 个浓度作为 3 个组。对每种消毒剂， 每组浓度测试 30 个样本 (取自 3 个以上最小包装)。3 组的主要有效成分浓度， 均应分别用化学滴定法测定。2.1.6.5.4 试验操作程序(1) 配制各种消毒剂的高、中、低 3 组浓度溶液，并按本规范中有关方法测定 其主要有效成分浓度。(2) 对各消毒剂浓度组，分别用试纸浸于溶液中，润湿即取出。半分钟后与标 准色块比较，确定所测浓度。每条试纸作为 1 个样本，逐个样本分别进行测定。(3) 将试纸测得的浓度与化学滴定法测得的浓度比较，该组样本总符合率90% 者为合格。2.1.6.5.5 稳定性试验(1) 按说明书要求，在室温存放足量指示卡。(2) 按使用说明书规定的期限抽样，按 2.1.6.5.4 所示方法进行检测。(3) 试验结果符合合格要求2.1.6.5.4 (3) 者，可认为该存放时间即为其贮 存有效期。2.1.6.5.6 注意事项 (1) 有效成分不稳定的消毒剂，应在试纸检测后尽快用化学法滴定其浓度。(3) 对于反应后颜色可消退的产品，应及时观察结果，并用文字记录。