菌悬液与菌片的制备.docx

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1、 菌悬液与菌片的制备2.1.1.2.1 适用范围制备消毒剂杀菌试验用细菌悬液与菌片，以供消毒剂杀菌试验时使用。2.1.1.2.2 试验器材（1）菌种:金黄色葡萄球菌 ATCC 6538、铜绿假单胞菌 ATCC 15442、大肠杆菌 8099、枯草杆菌黑色变种 ATCC 9372、龟分枝杆菌脓肿亚种 ATCC 93326、白色葡萄球菌 8032、白色念珠菌ATCC10231、黑曲霉菌 ATCC16404。在上述规定的菌株基础上，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌株。（2）有机干扰物：见附录 A。（3）磷酸盐缓冲液：见附录 A。（4）无菌蒸馏水。（5）稀释液：见附录 A。（6）细菌培

2、养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）等，见附录 A。（7）革兰染色液：见附录 A。（8）芽孢染色液：见附录 A。（9）恒温水浴箱。（10）玻璃漏斗。（11）刻度吸管（1.0ml、5.0ml、10.0ml），毛细吸管。（12）数字可调移液器（10l， 20l， 100l，200l，1000l）及配套用一次性塑料吸头。（13）离心机。（14）电动混合器（15）浊度计。2.1.1.2.3 细菌悬液制备程序（1）细菌繁殖体悬液的制备1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 ml10.0ml 营养肉汤培

3、养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37培养 18h24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于 37培养 18h24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于 37培养 18h24h，即为第 3 代培养物。2）取菌种第 3 代14 代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h24h），用 5.0ml 吸管吸取 3.0 ml5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合（振荡）20s，或在手掌上振敲80 次，以使细菌悬浮均匀。3）初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其

4、含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。4）细菌繁殖体悬液应保存在 4冰箱内备用。应当天使用不得过夜。5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。（2）细菌芽孢悬液的制备1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量营养肉汤培养基，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5 ml10ml 营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37培养 18h24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于 37培养 18h24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，于 37培养 18h24h，即为第 3 代培养物。2）用 10.

5、0ml 吸管吸取 5.0 ml10.0ml 第 3 代5 代的 18h24h 营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面，再将多余肉汤培养物吸出，将罗氏瓶置于 37温箱内，培养 5d7d。3）用接种环取菌样少许涂于玻片上，固定后以改良芽孢染色法染色，并在显微镜（油镜）下进行镜检。当芽孢形成率达 95% 以上时，即可进行以下处理。否则，应继续在室温下放置一定时间，直至达到上述芽孢形成率后再进行以下处理。改良芽孢染色法：用接种环取菌样涂布于玻片上，待自然干燥。而后通过火焰加热将菌固定于玻片上。将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的 5.0% 孔雀

6、绿水溶液。将平皿盖好，放5456 条件下，加热 30min。取出，去滤纸，用自来水冲洗残留孔雀绿溶液。加 0.5% 沙黄水溶液，染 1min。水洗，待干后镜检。芽孢呈绿色，菌体呈红色。4）罗氏瓶培养物，用 10.0ml 吸管加 10.0ml 无菌蒸馏水于每一罗氏瓶中，以 L 棒轻轻推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌悬液，再向瓶内吸加 5.0ml 无菌蒸馏水，重复洗菌一遍。将第一和第二批洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶中，振摇 5min，打碎菌块，使成均匀的芽孢悬液。5）必要时，将盛装菌悬液的三角烧瓶置 45水浴中 24h，使菌自溶断链，分散成单个芽孢。6）用无菌棉花或纱布过滤芽孢悬液，清

7、除其中的琼脂凝块。7）将过滤后的芽孢悬液，置无菌离心管内，以 3000 r/min 速度离心 30min。弃上清液，加蒸馏水吹吸使芽孢重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗，先后共 3 遍。8）将洗净的芽孢悬浮于三角烧瓶内蒸馏水中，并加入适量小玻璃珠。9）将芽孢液放于 80水浴中 10min（或 60，30min），以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，保存于 4冰箱中备用。有效使用期为半年。10）芽孢悬液在使用时，应先进行活菌培养计数。11）怀疑有杂菌污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。2.1.1.2.4 菌片的制备程序（1）消毒试验中使用的菌片是以菌液滴加于载体上制成。载体应根据

8、消毒对象选择，常用的有金属、玻璃、滤纸、线、棉布等。根据其特点选择适宜材料载体作为代表。载体可以为方形，大小为 10mm10mm。 当以金属片为载体时，因方形金属载体在振敲时可将玻璃试管撞碎，故改用 12mm 直径圆形金属片（厚 0.5mm）。（2）所用载体（除滤纸片外）于染菌前，应进行脱脂处理。脱脂方法如下：将载体放在含洗涤剂的水中煮沸 30 min；以自来水洗净；用蒸馏水煮沸 10min；用蒸馏水漂洗至 pH 呈中性；晾干、熨平备用。（3）布片用白平纹棉布制作。在剪开前，先将脱脂的布块按载体规定的大小，抽去边缘一周的经纬纱各一根，再按抽纱痕剪开。此法制成的载体大小一致，且无毛边。金属片以不

9、锈钢制作，纸片以新华滤纸制作。（4）载体经压力蒸汽灭菌后，使用滴染法染菌。染菌用菌悬液：使用 TSB 营养肉汤配制。细菌繁殖体，可直接使用经 18h24h 培养的斜面培养物，细菌芽孢可使用 4冰箱贮存液。含菌量约为 1108cfu/ml5108cfu/ml，可使用浊度计调整菌液浓度。滴染法染菌时，将经灭菌的载体片平铺于无菌平皿内，逐片滴加菌液。菌液滴加量每片为 10l。用 10l 移液器接灭菌塑料吸头滴染菌液，并用接种环涂匀整个载体表面。滴染菌液后，染菌载体可置 37温箱内干燥（约 20min30min），或置室温下自然阴干后再使用。（5）每个菌片的回收菌数，按活菌培养计数所得结果，应为 51

10、05 cfu/片5106 cfu/片。2.1.1.2.5 注意事项（1）用浊度计测定的菌悬液浓度，只用于在滴染菌片时对菌悬液稀释度的估计。作为菌悬液含菌浓度或菌片染菌量的正式报告（如杀菌试验中阳性对照组菌悬液或菌片所含菌量），必须以活菌培养计数的实测结果为准，不得使用根据比浊法判定的估计值。（2）滴染时，菌液滴加量不宜过多，避免流散影响染菌的准确性。（3）细菌繁殖体在烤干过程中，可引起部分死亡，如铜绿假单胞菌在 37干燥过程中，滴度最高可下降 1 个对数值。此时，应提高初始菌浓度，以便达到所需的菌量。（4）配制菌悬液和制备菌片时，严格按无菌要求操作，以防污染杂菌，影响随后杀菌试验的结果。（5）用带橡皮塞的容器保存菌液时，应将其预先煮沸 10min 进行脱硫处理。（6）制得的菌悬液和菌片，用毕应随时放入冰箱内，尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的自然死亡。