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1、1附件 4食品中多种动物源性成分检测实时荧光 PCR 法BJS 2019041 范围本方法规定了肉及肉制品中猪、驴、山羊、绵羊、牦牛、鼠源性成分检测的实时荧光PCR 方法。本方法适用于肉及肉制品中猪(Sus scrofa)、驴(Equus asinus)、山羊(Capra hircus)、绵羊(Ovis aries)、牦牛(Bos grunniens)、鼠源性成分的一种或多种成分同时定性检测。注:本方法中鼠源性成分包括海狸鼠(Myocastor coypus)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、豚鼠(Cavia porcellus)和竹鼠(Rhizo
2、my spruinosus)源性成分。2 原理提取样品DNA,通过特异性引物探针进行动物源性成分的实时荧光PCR扩增,根据PCR扩增反应中产物荧光信号及扩增曲线判定,实现对样品动物源性成分的定性分析。3 试剂和材料除另有规定外,本方法所用试剂为分析纯或生化试剂,实验用水应符合GB/T 6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。3.1 检测用引物和探针(a) 猪 cytb 基因检测用引物探针序列为:5端引物:5-GCACTTTATCCTGCCATTCATCATT-33端引物:5-GTACAAGGATTAGTAGGATTAGT-3探针:5-FAM-CGCCCTCGCAGCCGTACAT
3、CTCCTA-BHQ1-3(b) 驴 nad5 基因检测用引物探针序列为:5端引物:5-GCTAGCCTCATTATCAGTAT-33端引物:5-GTGATGAGGATACGTGCT-3探针:5-FAM-TCATATCATCAATCCTCAACACCCACA-BHQ1-3(c) 山羊 cytb 基因检测用引物探针序列为:5端引物:5-CTTTATCCTCCCATTCATCATCA-33端引物:5-GAATTCCTGTGGGGTTGTTC-3探针:5-FAM-GCTCTCGCCATAGTCCACCTGCTTTTC-BHQ1-3(d) 绵羊 cytb 基因检测用引物探针序列为:25端引物:5-CT
4、CATGCTACTAGTACTATTTACG-33端引物:5-GTACGCGAATAGGAAGTATCAT-3探针:5-FAM-TGACTTACTCGGAGACCCAGACAACTACAC-BHQ1-3(e) 牦牛 cytb 基因检测用引物探针序列为:5端引物:5-AACTTCGGCTCCATAGTAGGAGTA-33端引物:5-CGTCTCGGCAGATATGGACA-3探针:5-FAM-CGGAGGAGAATGCTGTTGTTGTATCGGATGT-BHQ1-3(f) 鼠 cytb 基因检测用引物探针序列为:5端引物:5-CTCCACGAGACAGGATCAAACAACCCATCAGGAC
5、TAAA-33端引物:5-TCATTCTGGTTTGATGTGGGGTGGGGTATT-3探针:5-FAM-TAGTGGGTTAGCAGGTGTGTAGTTGTCTGGGTCTC-BHQ1-33.2 CTAB 裂解液:2% (w/v) CTAB,1.4mol/L NaCl,20 mmol/L EDTA,100 mmol/L Tris,用 10%盐酸调节 pH 至 8.0,121高压灭菌 20 min,备用。3.3 蛋白酶 K:20mg/mL,-20保存备用。3.4 苯酚三氯甲烷异戊醇(体积比 25241)。3.5 异丙醇,优级纯。3.6 70%乙醇。3.7 实时荧光 PCR 预混液。以 2预混
6、液为例,成分为:PCR 缓冲液(终浓度 1),氯化镁(终浓度 2.5 mmol/L),dNTP(终浓度 0.2mmol/L),TaqDNA 聚合酶(终浓度 1 U)。3.8TE 缓冲液(Tris-HCl、EDTA 缓冲液):10mmol/L Tris-HCl(pH8.0),1 mmol/L EDTA(pH8.0)。4 仪器和设备4.1 组织研磨器。4.2 核酸蛋白分析仪。4.3 恒温水浴锅。4.4 离心机(最大离心力12000g)。4.5 微量移液器(0.1L2.5L,0.5L10L,10L100L,100L1000L)。4.6 实时荧光 PCR 仪。4.7 涡旋振荡器。4.8 电子天平:感量
7、 0.01 g。4.9 高压灭菌锅。4.10 pH 计。35 分析步骤5.1 试样选取与制备多点采取肌肉组织,选取适量具有代表性的样品进行均质处理。所用器皿应为一次性耗材,或经过彻底清洗和高压消毒并单独使用。用过的器皿应采取措施消除核酸的污染,否则不可重复使用。5.2DNA提取称取解冻后的均质样品0.1g0.2g,置于2mL离心管中,加入600 L CTAB裂解液和20L蛋白酶K,振荡混匀,65孵育1h2h,期间每隔10min振荡混匀;加入500 L的苯酚:三氯甲烷:异戊醇(25241),充分振荡混匀,12000g离心5min;小心吸取上清液至洁净的1.5mL离心管内,加入等体积的异丙醇,振荡
8、混匀,12000g离心5min;弃去上清液,500L70%乙醇洗涤2次,12000g离心5 min,弃上清液,晾干;加入50L100L TE缓冲液或无菌双蒸水,溶解DNA,-20保存备用。同法提取阳性对照、阴性对照及空白对照。也可用等效商品化的试剂盒提取DNA。5.3DNA浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪检测 DNA 浓度及纯度,DNA 浓度在 1ng/L100ng/L 之间,A260/A280 值在 1.72.0 之间时,适宜于本方法。5.4 实时荧光 PCR 扩增各动物源性成分PCR扩增均采用20L的反应体系,包括PCR反应预混液(2)10L,5端、3端引物(10mol/L)各0.2L,
9、探针(10mol/L)0.1L,DNA模板(1ng/L100ng/L)1L,用无菌双蒸水补足20L。每个样品设置两个平行反应体系。PCR扩增反应程序为:955min;35个循环(95 15s,58 1min,收集荧光)。也可用等效的商品化试剂盒进行扩增。5.5 实验对照实验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。用相应动物源性成分生鲜肉样品作为阳性对照,用不含相应动物源性成分的生鲜肉样品作为阴性对照,用等体积的无菌双蒸水代替模板DNA作为空白对照。6 结果判断与表述6.1 质量控制(a)空白对照:无FAM荧光信号检出;(b)阴性对照:无FAM荧光信号检出;(c)阳性对照:有FAM荧光信号检出,
10、且出现典型的扩增曲线,Ct值30.0。否则判定为实验无效。6.2 结果判定4(a)如有FAM荧光信号检出,Ct值30.0,且出现典型的扩增曲线,则判定为被检样品阳性;(b)如Ct值35或无Ct值,则判定为被检样品阴性;(c)如有FAM荧光信号检出,且30.0Ct值35.0,则重新进行实验。如再次扩增后Ct值仍35.0,且有典型的扩增曲线,则判定被检样品阳性;否则判定被检样品阴性。6.3 结果表述结果为阳性者,表述为“检出XX源性成分”。结果为阴性者,表述为“未检出XX源性成分”。7 污染判定在DNA浓度相对差值在20%以内的情况下,本方法所检测生鲜肉与阳性对照差值6,或肉制品与阳性对照差值10,且结果可独立重复,提示该源性成分含量低于2%。8 防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行。本方法负责起草单位:成都市食品药品检验研究院、中国科学院成都生物研究所、北京维德维康生物技术有限公司。验证单位:山东省食品药品检验研究院、中国检验检疫科学研究院、北京市食品安全监控和风险评估中心、河北省食品检验研究院、国家副食品质量监督检验中心,广州质量监督检测研究院。主要起草人:梁恒兴、尚柯、段庆梓、唐卓、张彪、马立才。