玻璃实验器皿清洗方法.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流玻璃实验器皿清洗方法.精品文档.1 清洗在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长微生物产品附带杂物上次细胞残留物非营养成分的化学物质需要清洗的培养用品玻璃器皿的清洗胶塞的清洗塑料制品的清洗玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤清洗后的玻璃器皿干净透明无油迹不能残留任何物质浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等先用自来水简单刷洗，然后用5稀盐酸液

2、浸泡过夜，以中和其中的碱性物质再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上刷洗：用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时清洁液 常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml） 强清洁液 631000200 次强清洗液 120 2001000 弱清洁液 100 1001000配制时应注意安全，须

3、穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色 冲洗在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹最好用洗涤装置如用手工操作需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5 次，晾干备用胶塞的清洗新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理常规清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用塑料制品

4、的清洗塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品必要时用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用消毒细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染常见原因：操作间或周围空间的不洁培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染消毒灭菌方法物理消毒灭菌法紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿，30min湿热（高压蒸气灭菌法）：121，20min干烤：160, 2 小时

5、过滤：0.22m化学消毒灭菌法70%酒精主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理1新洁尔灭主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒抗生素主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染2 细胞培养常用物品水水的制备：  细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净细胞培养基市场上可提供干粉培养基和液体培养基干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便常用的培养基种类RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM

6、-低糖（标准型）、McCoys 5A、M199、F10等细胞培养基应用选择选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考： (1 ）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 (2) 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 (3) 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选 RPMI1640 。 (4) 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。制备1000mlRPMI 1640培养基RPMI 16

7、40 干粉培养基10.4g（1包） 蒸馏水 400ml 磁力搅拌至完全溶解  加三蒸馏水定容至1000ml 在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有0.22m孔径滤膜的过滤器除菌，并分装成200ml/瓶，-20保存备用。 用前取一瓶溶解，每200ml培养液加灭活的小牛血清至终浓度为10%，即加22ml。再加青霉素和链霉素至终浓度各为100U/ml。 - 细胞培养液血清热灭活：56, 30 分钟加热已完全解冻的血清热灭活目的：灭活血清中的补体成分。如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活。  因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量。

8、灭活后严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。血清中的沉淀物絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清平衡盐液体组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分用于洗涤组织、细胞等PBS（Phosphate-Buffered Salline

9、s）KCl 0.20g KH2PO4 0.20g NaCl 8.00g Na2HPO47H2O 2.16gDPBS（Dulbeccos Phosphate-Buffered Sallines）标准型 CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙) 0.10g KCl 0.20g KH2PO4 0.20g MgCl26H2O 0.10g NaCl 8.00g Na2HPO47H2O 2.16gD-Hanks 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS) KCl 0.40g KH2PO4 0.06g NaCl 8.00g NaCO3 0.35g Na2HP

10、O4 0.048g D-Glucose 1.00g Phenol Red 0.01g 消化液分离组织和分散细胞常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液单独或混合使用胰蛋白酶溶液主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用胰蛋白酶溶液配制称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks 平衡盐溶液调成糊状，再补足D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4 小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中， -20保存备用（以免分解失效），常用浓度为0.25% （0.1%-0.5%）胰蛋白酶溶液偏酸

11、，使用前可用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右EDTA4Na 溶液一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便常用工作液浓度为0.02%。 注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长EDTA 溶液配制：用D-Hanks 平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，4冰箱保存pH 调整液NaHCO3 溶液常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4保存HEPES（分子量238.31）溶液一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时

12、培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES使用终浓度一般为10-50mmol/L常配成1M 储存液：用20ml 双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4保存。使用时可向100ml培养液中加入2ml HEPES浓缩液，终浓度为20mmol/L 谷氨酰胺补充液谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4放置2周以上时，要重新加入原来量的谷

13、氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内使用终浓度为1-4mmol/L一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mmol/L（29.22g/L），配制方法为 ：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30），过滤除菌，分装小瓶，-20保存，使用时可向100ml培养液中加入0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mmol/L 酚红大多数培养液中使用酚红作为pH 指示红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫色表示碱性pH在一些特殊培养液中不含酚红因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用抗生素溶液抗生素使用种

14、类与浓度：               工作浓度 储存温度 杀灭细菌 penicillin 100 u/ml -20 G(+) streptomycin 100 ug/ml -20 G(+) 、G(-) gentamicin 50 ug/ml - 20 G(+) 、G(-)、支原体 amphotericin B 2.5 ug/ml -20 真菌 nystatin 50 ug/ml -20 真菌 器材和液体的准备细胞培养用的玻璃器材培养瓶、吸管等在清洗干净以

15、后，装在铝盒和铁筒中，160，2小时干烤灭菌后备用手术器材、瓶塞、配制好的PBS液15磅，121，20分钟蒸气灭菌MEM培养液、小牛血清、消化液用G6滤器负压抽滤后备用   无菌操作中的注意事项在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟操作时，小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打 开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45角取用 在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯

16、的周围进行哺乳动物细胞冷冻保存冷冻保存要点冷冻过程要缓慢。4 3060 分钟-20 30 分钟 -80 1618 小时（或过夜）液氮长期保存冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90，无微生物污染。细胞浓度控制在：11075107/ml。常用细胞冷冻保存液10DMSO 完全细胞生长培养液（20血清基础培养液）10甘油 完全细胞生长培养液（20血清基础培养液）冷冻保存细胞的解冻与复苏要点快速解冻冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24 小时后再用新鲜完全培养液替换

17、旧培养液，以去除DMSO如果细胞对冷冻保护剂特别敏感解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中解冻冷冻保存细胞的离心方法从液氮中取出冻存的细胞，立即放入37水浴中快速解冻将12ml 冻存细胞液加入到25ml 新鲜完全细胞生长培养液中，轻轻混匀用80g 离心23 分钟，弃上清液用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞接种细胞到培养瓶中，起始密度为3105/ml。细胞培养系列二 常用器材及处理方法 体外培养细胞使用的器材品种较多。由于离体细胞对各种毒物都很敏感，所以细胞培养所用器材的清洗、消毒处理是培养能否成功的关键之一。一、玻璃器材 常用的玻璃器材有各种规格

18、的玻璃瓶、培养瓶、培养皿、吸管、离心管等。无论是初次使用还是培养后重复使用的玻璃器材均需要进行消毒处理。首次使用的玻璃器材应先用自来水初步刷洗，然后用稀盐酸溶液（1%）浸泡过夜，再用自来水冲洗，最后处理方法与重复使用的器皿的处理。重复使用的玻璃器皿的处理步骤：（1）刷洗。用软毛刷和优质中性洗涤剂刷洗，去除器皿内外表面的杂质。刷洗时注意不要用力过重，以防损坏器皿内表面光洁度，影响细胞生长；也不能留有死角。器皿数量大时，可使用超声波清洁装置，冲洗干净后晾干。（2）清洁液处理。将刷洗晾干后的玻璃器皿放入硫酸-重铬钾清洁液中。清洁液配方如下，见下表：表 清洁液配方 名 称*清洁液浓度25%(弱液)50

19、%(次强液)75%(强液)重铬酸钾1000g1000g1000g浓 硫 酸2500mL5000mL7500ML蒸馏水(或废液)7500Ml5000mL2500mL该清洁液具有高度腐蚀性，操作时必须穿长筒胶靴，戴防酸橡皮手套，围裙和眼镜，以防清洁液溅出而灼伤。在配液时还需注意将酸缓慢放入水中，以防酸遇水放热产生酸溅出或使玻璃及陶制容器裂开而使清洁液外泄。切勿将水加入酸中，以防酸溅出。常用清洁液为75%和50%两种。将玻璃器皿放入时最好装入塑料网袋内，再浸入清洁液中，玻璃瓶内不要残留气泡。一般浸泡1224小时后取出。在清洁液中取出的器皿先用自来水冲洗10次以上，再用单蒸水冲洗三次以上，最后用双蒸水

20、（或去离子水）冲洗12次，晾干，包装杀菌。一般用121磅高压蒸气灭菌20分钟。玻璃滤器使用后及时用自来水冲洗滤器表面的剩余物，然后用单蒸水浸泡，除去滤板内堵塞杂物，若用滤膜则将滤膜丢弃，加4N盐酸浸泡12小时以上，用自来水冲洗，再用单蒸水抽滤2次，双蒸水(或去离子水)抽滤冲洗、包装、121高压蒸气灭菌20分钟。也可用5%洁消精浸泡20分钟后，再按上述方法冲洗和灭菌。 二、塑料器材 体外培养细胞中塑料器皿的使用越来越多，有进口的，也有国产的。主要有多孔培养板、培养皿、培养瓶及吸嘴。多孔培养板有4孔、6孔、24孔、96孔等规格可供选择。多数为进口产品，已消毒灭菌密封包装，使用时只需打开即可。有一次

21、性使用的，也有反复使用的。在我国不少实验室，由于经费有限，经过清洗和消毒灭菌再使用的较多。塑料器皿若使用后，先用自来水浸泡冲洗、晾干，再用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡过夜，用自来水充分冲洗，或先用2%NaOH处理之后再用3%HCl浸泡30分钟，最后用自来水冲洗干净，并用双蒸水冲洗3次以上，晾干。消毒采用紫外线直接照射或辐照灭菌办法。清洗时要防止产生划痕，以免影响细胞的贴附性。所以，培养要求较高的细胞的塑料器材，最好一次性使用。三、橡皮器材 应选择质软、耐高温、毒性小的橡皮制品(最好是硅制品)做各种瓶或试管的塞子、盖子。新购置的橡皮制品，用自来水冲洗去除其表面粉粒和污物。先用5%氢氧化钠煮沸

22、15分钟，用自来水冲洗8次，再用4%盐酸煮沸15分钟，用自来水冲洗8次，单蒸水冲洗3次，双蒸水(或去离子水)冲洗一次，晾干后包装或置于铝盒内，用121高压蒸气灭菌20分钟。已用过的橡皮制品，先用自来水冲洗干净，然后用洗衣粉加热煮沸10分钟后，用自来水边冲边用力搅动，以充分洗净残余洗衣粉，然后用蒸馏水煮沸2次，每次15分钟，再用单蒸水冲洗2次，必要时还要用双蒸水(或去离子水)冲洗一次，晾干后包装或放于铝盒内，用121高压蒸气灭菌20分钟。四、金属器材 细胞培养中需用多种金属器材，用于解剖、取材、剪切组织及持取物件等，常用的有剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头等。新的

23、金属器材，先用纸擦去表面的油脂，再用洗衣粉煮沸，或用1%碳酸氢钠煮沸15分钟，擦干后再用95%酒精纱布擦干，包装或置铝盒内于121高压蒸气灭菌20分钟。已用过的金属器材，及时用酒精棉球擦干净，包装入铝盒内于121高压蒸气灭菌20分钟。五、其他物品 纱布先用自来水洗净后，再用单蒸水冲洗，然后用单蒸水煮沸2次，每次15分钟，并经常用长镊子翻动，再用单蒸水洗2次，晾干后折成八层包装，用121高压蒸气灭菌20分钟。注射器的针头使用后，立即用自来水（或来苏尔水）冲洗数次，冲洗出针头内的剩余物，以免堵塞针头，然后用单蒸水洗23次，再用95%酒精冲洗3次，包装或置铝饭盒内121高压蒸气灭菌20分钟。用于细胞培养过程中的各种人工合成培养液、缓冲液和酶滤液等也需要进行除(灭)菌处理。缓冲液常用高压蒸气消毒。血清用56水浴灭活30分钟。人工合成培养液等酶溶液用过滤除菌。安装滤器时要防止滤膜装偏而导致过滤失效，过滤时力量不能过大、过猛，以免滤膜破裂。滤液量多，用抽滤式或加压式（正压式）过滤装置。滤液量少，可选用2.5cm直径的小号滤器，直接套在小瓶（如青霉素瓶）上，以注射器推动压力过滤。消毒灭菌前所用的包装材料可用牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒和特制玻璃（或金属）消毒筒等，可根据器材大小、形态选用，采取局部包装或部分包装，并用线绳扎紧。